분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

다음 실험의 전반적인 목표는 탈중합 미세소관의 말단과 함께 단백질 분자와 단백질로 코팅된 비드의 움직임을 연구하는 것입니다. 이는 재사용 가능한 플로우 챔버를 깨끗한 크기의 커버 슬립으로 조립하여 달성됩니다. 다음으로 미세소관 씨앗을 커버 슬립에 부착하여 준비하고 미세소관을 핵 생성하는 데 사용한 다음 광파괴 가능한 캡으로 임시로 안정화합니다.

그런 다음 GFP 표지된 단백질 또는 단백질 코팅 비드가 유동 챔버에 도입되어 분절된 미세소관에 결합합니다. 그런 다음 마이크로 튜브 해중합은 광 절제에 의해 캡을 제거하여 트리거됩니다. 이미지는 CH로 분석하여 표지된 단백질이 탈중합 미세소관의 말단과 함께 이동하는 팁 추적 동작을 나타내는지 여부를 결정합니다.

이 기술의 주요 장점은 높은 시간적 및 특수 해상도로 미세소관 형성을 유발할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 프로토콜은 초음파 밀링을 사용하여 플로우 챔버 준비 및 조립으로 시작됩니다.

일반 현미경 슬라이드에 두 개의 홈이 있도록 수정합니다. 홈을 14mm 간격으로 만듭니다. 정사각형 22mm 커버 슬립을 사용하여 조립된 챔버에 가장 적합한 1mm를 주거나 받습니다.

그런 다음 슬라이드의 각 홈에 100mm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 놓고 홈의 안쪽 끝에 약 5mm 돌출부를 남겨둡니다. 시아노아크릴레이트 접착제로 홈 내부에 튜브를 고정하고 튜브를 홈 내부에 완전히 삽입합니다. 엎지르지 않고 에폭시 접착제로 홈을 조심스럽게 채웁니다.

하루 동안 말리십시오. 다음 날. 날카로운 면도날을 사용하여 각 부착 부위의 말단 끝에서 3-4mm 떨어진 곳에서 응고된 접착제를 자릅니다.

슬라이드 중앙에 근접한 부품을 제거합니다. 튜브는 홈에 남아 있어야 하고 절단부는 튜브 개구부가 있는 평평한 표면을 만들어야 합니다. 다음으로, 주사기에 물을 채우고 튜브가 제대로 작동하는지 테스트합니다.

액체가 자유롭게 흐르면 홈의 바깥쪽 끝에 직경 약 5mm의 에폭시 접착제 한 방울을 떨어뜨리고 하루 정도 건조시킵니다. 따라서 완성된 플로우 챔버는 내구성이 뛰어나 수개월 동안 반복적으로 사용할 수 있습니다. 이 3시간 프로토콜은 12개의 커버 슬립을 준비합니다.

흄 후드, 세라믹 커버 슬립 홀더 1개, 15밀리리터 3개, 염색 용기 3개, 뚜껑이 있는 250밀리리터 유리 용기 1개가 필요합니다. 염색 용기는 4개의 일반 번호 1 22mm 커버 슬립을 스택에 넣어야 합니다. 세라믹 홀더에 미리 청소하고 건조시킨 12개의 커버 슬립 더미로 시작합니다.

항아리에 플러스 하나의 반발 실렌 용액을 채우고 슬라이드를 천천히 내립니다. 병을 닫고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 균일한 커버 슬립 문명을 보장하기 위한 가장 중요한 단계는 Selene 용액에서 커버 슬립을 배양하는 동안 물 흔적을 피하는 것입니다.

이 단계는 마이크로 난관 씨앗의 단단한 부착에 필수적입니다. 나중에 프로토콜에서 커버 슬립이 준비되면 항아리에서 세라믹 홀더를 제거합니다. 그런 다음 테프론 코팅 핀셋을 사용하여 세라믹 홀더에서 메탄올이 로드된 염색 용기로 커버 슬립을 개별적으로 옮깁니다.

이제 세 개의 항아리를 금속 또는 유리 받침대가 있는 음파 욕조의 물통에 넣습니다. 수위는 항아리 높이의 2/3에 있어야 하며 항아리를 70와트에서 20분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 중에는 5 분마다 메탄올 용액을 교체하십시오.

초음파 처리가 완료되면 헹구고 덮개가 탈 이온수로 10 번 미끄러집니다. 사일로화가 제대로 작동하면 커버 슬립이 건조하게 보입니다 물에서 꺼냈을 때 외관에 관계없이 잔여 물을 철저히 제거하십시오. 질소 가스 이송을 사용하여 건조된 덮개가 질소 건조 밀봉 가능 용기로 미끄러집니다.

인터레이 킴이 커버 슬립 사이로 닦는다. 이런 식으로 실온에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1-2시간, 1개의 플로우 챔버 및 준비된 G-M-P-C-P-P 안정화 마이크로 튜비알 시드가 필요합니다.

먼저 플로우 챔버를 조립합니다. 준비된 슬라이드의 중앙 5mm 너비 영역을 따라 양면 테이프 두 개를 부착하고 커버 슬립을 테이프에 단단히 누릅니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 튜브를 통해 100마이크로리터의 B rrb 80 용액으로 챔버를 채웁니다.

다음으로, 작은 플라스틱 페트리 접시 위에 두 가지 색상의 퀵 캐스트 실런트를 작은 방울 짜냅니다. 이쑤시개로 빠르고 철저히 섞으십시오. 녹색으로 바뀝니다.

커버 슬립의 모든 가장자리를 따라 즉시 실런트를 바르십시오. 실런트가 커버 슬립 아래로 너무 깊숙이 침투하는지 확인하십시오. 튜브가 막힌 경우 주사기의 플러그를 뽑고 튜브를 들어 올려 실런트가 누출되는 것을 방지하기 위해 부드러운 압력을 가합니다.10분 후 용액 흐름이 제한되지 않았는지 확인하십시오.

그런 다음 챔버를 섭씨 32도의 예열된 현미경 스테이지로 옮깁니다. 용액 제거를 위해 튜브 중 하나를 펌프에 부착합니다. 주입 튜브의 다른 쪽 끝을 따뜻한 BRB 80 완충액이 있는 0.5mm 바이알에 담그십시오.

펌프를 분당 100마이크로리터로 설정하고 필요에 따라 사용하여 기포를 부드럽게 밀어냅니다. 이 작업은 수동으로 수행할 수도 있습니다. 이제 펌프를 사용하여 30마이크로리터의 따뜻한 항원 항체를 로드합니다.

펌프를 끄고 5분 정도 기다립니다. 모든 배양 중에는 펌프를 끄십시오. 다음으로, 약 100마이크로리터의 따뜻한 b rrb 80으로 챔버를 세척합니다.

그런 다음 BRB 80에서 50 % onic F1 27의 1 마이크로 리터를 관류합니다. 사일로화된 커버 슬립의 소수성 표면을 막을 때까지 10분 동안 기다립니다. 이제 100마이크로리터의 운동 버퍼로 챔버를 세척합니다.

다음으로, 펌프 속도를 분당 15마이크로리터로 낮추고 30-40마이크로리터의 미세소관 시드를 1-200-1-600의 운동성 완충액으로 희석하여 챔버를 관류합니다. 씨앗을 15분 동안 배양한 다음 분당 100마이크로리터의 속도로 400마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거합니다. 다음으로, 펌프 속도를 분당 30마이크로리터로 줄이고 예열된 라벨링되지 않은 튜불린 용액으로 챔버를 관류합니다.

이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 기포를 피하는 것입니다. 갓 준비된 튜불린 용액을 사용하고 특히 마이크로 튜블러 캡핑 중에 프로토콜의 정확한 타이밍을 따릅니다. 5-7분 배양 동안 DIC 광학 장치를 사용하여 미세 세뇨관 성장을 모니터링합니다.

미세소관은 일반적으로 약 10미크론 성장하며, 전쟁 전의 Rumine Tubulin Mix와 용액을 빠르게 교환하고 8-10분 더 배양 시간을 허용합니다. 분당 20마이크로리터의 속도로 100마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 잘 세척하여 난류와 뉴클레오티드, 용해성 미세소관 단편을 제거합니다. 다음으로, GFP 표지된 단백질 또는 단백질 코팅된 비드의 가열된 용액으로 챔버를 관류하고 GFP로 표지된 DAM의 이미징을 진행하여 박테리아 세포에서 정제하고 팁 추적 분석을 위한 양성 대조군으로 사용했습니다.

이러한 단백질은 미세소관의 해중합 말단을 추적하여 커버 슬립에 부착된 종자를 향해 꾸준히 이동합니다. 이러한 단백질은 해당 그래프에 비스듬한 선으로 나타나며, 이를 분석하여 팁 추적 복합체의 단백질 분자 수를 결정할 수 있습니다. 이 분석은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.

대조적으로, 팁 트랙에 실패한 단백질은 분해 마이크로 말단에서 형광 신호의 농축을 보여주지 않습니다. 이것은 인간 NDC 80 GFP 단백질에서 볼 수 있습니다. 단백질로 코팅된 비드와 미세소관 사이의 결합은 일반적으로 매우 강하기 때문에 비드를 현미경 챔버에 추가하면 분할된 커버 슬립이 부착된 미세소관에 쉽게 결합됩니다.

비드 추적이 프로세스형인 경우 많은 관찰을 수행할 수 있습니다. 하나의 미세소관에 부착된 구슬은 미세소관이 성장 부위 주위를 약간 회전할 때 호와 같은 움직임을 보였습니다. 안정화 캡이 비춰질 때 시드와 비드의 원위부에서 빨간색 세그먼트 하나만 보이면 비드가 하나의 미세소관에 부착된 것입니다.

캡은 종종 캡이 표백될 때까지 비드의 움직임을 따라가는 것을 볼 수 있습니다: 표백 직후의 비드 움직임은 미세소관 방향과 일치하는 것으로 보입니다. 마이크로 튜비알이 짧아지고 비드가 시드 쪽으로 이동함에 따라 진동과 같은 호의 진폭이 감소합니다. 구슬이 안정적인 미세소관에 지속적인 부착을 형성하지 못하는 경우.

레이저 트래핑은 TP가 있는 상태에서 분절된 마이크로 튜비알 벽에 비드를 발사하기 위해 이 기술이 필요했던 플러스 말단 지시 kinesin SE E의 다른 단백질 구조체와 함께 비드를 사용할 수 있습니다. 이 구슬은 그래프의 뚜껑이 있는 마이크로 tubial plus 말단을 향해 빠르게 움직였습니다. 이 움직임은 캡이 파괴된 후 캡을 향하는 비스듬한 선을 생성했습니다. 녹색 화살표로 표시된 대로 미세소관에서 분리된 잘린 스파이 단백질로 코팅된 구슬

대조적으로, 전체 길이 B 단백질을 가진 비드는 반대 방향으로 움직임을 유지할 수 있습니다. 이것은 chm 그래프에서 지그재그 패턴으로 보이며, 이는 미세소관의 플러스 또는 마이너스 끝에 반대 방향으로의 움직임으로 인해 발생합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세관 분해에 의해 유발되는 움직임을 연구하기 위해 유동 챔버를 준비하고 분절된 미세소관을 성장시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.