Name: 분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 배우세요 분단 미세소관을 이용하여 단백질 분자와 비드의 운동을 연구하는 방법을. 광분해 가능한 캡으로 미세소관 해중합을 정밀하게 제어하여 세포 생물학 및 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 프로토콜을 개발하고 시약을 제공하는 인물, N. Gudimchuk 및 P. Zakharov에 대한 이미지를 제공하기 위해, N. Dashkevich, N. Gudimchuk 및 A. Korbalev을 재사용 할 수있는 유량 용기를 디자인하고 제조하는 데 도움을 위해 FI Ataullakhanov에게 감사의 말씀을 전합니다 텍스트 편집 및 팁 및 토론을위한 Grishchuk 연구소의 다른 회원들과 도움을 제닌 표지 미세 소관 씨, A. Potapenko를 준비합니다. 이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 NIH 부여 GM R01-098389과 킴멜 학자 ELG 펜실베니아 근육 연구소에서 파일럿 부여, RFBR 12 채로 04-00111-13-04-40190-H를 부여하고 (13) - 04-40188-H, 과학 상임위원회 보조금 러시아 아카데미 FI Ataullakhanov에 (분자 시스템 통합 및 분자 및 분자 세포 생물학 프로그램의 메커니즘), NIH는 JR 매킨토시에 GM R01 GM033787을 부여하고, 드미트리 Zimin 왕조 재단 박사의 교제 VAV

저자가 공개하는 게 없다.

대부분의 단일 분자 분석은 오늘날 일상적으로 크게 특이 단백질의 고집을 줄이기 위해 특수 처리 커버 슬립을 사용합니다. 우리가 여기에서 설명하는 절차는 하워드 랩 32에서 개발 된 원래의 프로토콜의 변형이며, 우리는 커버 슬립을 silanizing은도 형광을 사용하지 않는 DIC 기반 비드 분석과 노력의 가치는 사실을 알게 될 것입니다. 이러한 커버 슬립 조립 챔버 훨씬 청소기 표면을 보여주고, 수용성 미세 소관 결합 단백질의 존재 하에서 얻어진 결과는 매우 낮은 단백질 농도가 사용되는 경우에는 특히 더 재현성. 분할 된 이동 단말의 성공적인 준비를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> 튜 불린의 농도와 배양 시간의 최적화 (5.1-5.2 단계). 시간과 프로토콜에 주어진 농도는 대략 등으로 인해 튜 불린 준비, 챔버 볼륨의 차이에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 특정 꽉nucleators 커버 슬립에...

미세 소관은 높은 세포 구조, 세포 운동성, 세포 분열, 세포 내 수송 1에 중요한 골격 구조를 보존하고 있습니다. 이러한 동적 중합체는 GTP의 존재 튜 불린에서 조립 이들은 자발적 성장이 단축 전환. 미세 소관은 (직경 25 nm의) 콘트라스트가 광학 현미경으로 미세 소관을 관찰하는 데 사용되어야합니다 강화하기 때문에 특별한 광학 기술 매우 얇은입니다. 이러한 폴리머와 이전 작업은 미분 간섭 대비 (DIC)을 3 사용하여 동적 동작을 살펴 보았다. 체외에서 이것과 유사한 연구는 일반적인 실험 조건에서 미세 소관은, 드물게 해중합에 재앙과 스위치를 거쳐야 밝혀마다 5 ~ 15 분 (이 주파수는 28 ~ 32 ° C에서 검사 7-15 밀리미터 용해 튜 불린의 농도입니다 ) 4. 다른 기술은 따라서 인덕턴스에 제안되었다제어 방식으로 전자 미세 소관 해중합. 미세 소관 쇼트닝 여기서 설명한 바와 같이, 거리 수용성 튜 불린 5,6 세척 레이저 광 (7)로 미세 소관을 절단 또는 분할 된 미세 소관 8을 사용하여 발생 될 수있다. 분할 된 미세 소관뿐만 아니라, 확률 론적으로 전환 폴리머를 사용하여 이전 작업은 이러한 염색체, 소포, 단백질 코팅 비즈 작은 세포 내화물은, 단축 미세 소관 9-13의 끝에서 이동할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 현상은 유사 분열 세포의 염색체 운동에 대한 직접적인 의미를 생각하고, 기본 메커니즘이 활성화 연구 14-16에서 현재됩니다. 최근, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 형광 기반 기술, 동적 인 미세 소관과 운동성을 연구하기 위해 사용되었다가 17-24로 끝났습니다. 이 방법의 장점은 허용한다는 것이다 상호 작용의 검토다른 형광 물질로 표지 단백질을 사용하여 실시간으로 미세 소관과 미세 소관 결합 단백질 사이의. 몇몇 단백질 복합체는 미세 소관 단부를 연신 및 / 또는 단축으로 processively 이동 발견되었다. 그들은 미세 소관 관련 단백질 Dam1 10,12,18, Ska1 19 일 및 XMAP215 (20)뿐만 아니라, 키네신 모터 Kif18A 21, 22, MCAK 23 CENP-E (24)이 (가) 있습니다. 이 단백질은 EB1 (25)와 같은 고전적인 팁 추적 단백질의 그것과 근본적으로 다른 processive 팁 추적을 나타낸다. EB1 분자 및 관련 파트너는 안정적으로 동적 미세 소관은 개별 분자가 빠르게 용해 수영장 (26)와 교환 만 ~ 0.8 초 미세 소관 팁에 바인딩 유지, 종료와 관련된 남아있는 것처럼 보이지만. 미세 소관이 많은 마이크론에 끝 반면, processive 팁 추적기, Dam1처럼, 여행, 및 미세 소관 조언과의 관계는 M 지속될 수모든 초. 팁 연관 시간뿐만 아니라, 추적 결과 속도는, 팁 추적 복합체를 형성하는 분자 (27)의 수에 크게 의존한다. 큰 단백질 앙상블은 일반적으로 훨씬 더 팁 추적기입니다. 예를 들어, 분리 된 효모 kinetochores와 같은 복잡한 어셈블리는 미세 소관에 결합 된 상태를 유지할 수는 시간 28 일 끝납니다. 일부 미세 소관 결합 단백질은, 예를 들어 Ndc80 동원체의 단백질 복합체, 단일 분자 수준에서 종료 미세 소관으로 추적 할 수없는 것으로, 아직 Ndc80은 구슬화물 19,29-31의 움직임을 결합에 매우 효율적입니다되었습니다. 따라서, 다른 단백질 복합체뿐만 아니라 생물학적 역할에 의한 팁 추적 메커니즘을 이해하기 위해, 그 팁 추적 복잡한 분자의 개수의 함수로서 팁 추적을 검사 할뿐만 아니라, 결정하는 것이 중요하다 구슬화물의 표면에 집단 운동을 전시하는이 단지의 기능을 제공합니다. (그림 1A)와 함께 실험을 준비하고 수행 할 수있는 세부적인 프로토콜을 제공하는 아래. 첫째, 상업적으로 이용 가능한 유리 슬라이드 짧은 폴리에틸렌 관 (프로토콜 1)를 첨부하도록 수정됩니다. 재사용 할 수있는 현미경 흐름 챔버는 다음과 같은 슬라이드에서 조립 및 화학적 또는 플라즈마 세정 및 실란 커버 슬립 (프로토콜 2) 32 ~ 34됩니다. 얻어진 챔버 체적은 유입 배관의 용적 등 만 20-25 μL (또는 15 μL 한 작게, 프로토콜 1 주 3 참조)이다. 시판 유동 챔버도 사용될 수 있지만, 그 양이 단백질의 불필요한 낭비로 이어지는, 보통 크다. 큰 챔버가 사용되는 경우, 아래의 프로토콜의 모든 솔루션의 볼륨이 비례 적으로 조정해야한다. 미세 소관의 씨앗이 서서히 가수 분해 GTP 아날로그, GMPCPP (구아노 신-5&#39;-[(α, β) methyleno] 트리 포스페이트) (프로토콜 3 등을 사용하여, 준비, 하이 먼 &lt;도 참조EM&gt; 등. 35). 씨앗 청소 커버 슬립에 고정하고 표면은 이후에 다른 단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 차단 32 (프로토콜 4 제닌 사용 씨의 고정화를 설명합니다). 분단 미세 소관은 5 프로토콜을 사용하여 제조 될 수있다. 이 방법의 주된 이론적 근거는 GTP의 존재하에 동적 미세 소관 형성 중합체, GMPCPP 포함될 안정 튜 불린 세그먼트의 짧은 &quot;캡&quot;을 추가하여 일시적으로 안정화 될 수 있다는 것이다. 이 모자는 로다 민 표지 튜 불린을 포함, 그래서 그들은 530-550 nm의 레이저 또는 수은 아크 램프 (프로토콜 6) (36)의 시야를 비추는 것만으로 간단하게 제거 할 수 있습니다. 팁 트래킹 신호의 형광 강도는 고려 현미경 야 조사 (프로토콜 12)의 요철을 가지고, 분해 미세 소관 단부로 여행 분자의 수를 추정하기 위해 사용될 수있다. 유사한 접근법이 사용될 수있다27 (프로토콜 8)에 기술 된 바와 같이 제조 된 해중합의 미세 소관 단백질 코팅 구슬 사이의 상호 작용을 연구합니다. 일부 단백질은 쉽게 분할 된 미세 소관의 벽에 결합하지만, 레이저 핀셋도하여 그 바인딩 홍보, 미세 소관 벽 근처 비드를 보유 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">표 1. 현미경 및 기타 장비.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td><td>DIC 및 epifluorescence-imaging이 가능한 다른 현미경 모델을 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Objective</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Objective heater</td><td>Bioptechs</td><td>150803, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>형광 필터 큐브</td><td>Chroma</td><td>49004 또는 49008 41017 또는 49020</td>은 <td>Rhodamine 형광에 최적화되어 있습니다. GFP 형광 획득 소프트웨어에 최적화된 </td></tr><tr><td></td><td>프리웨어 MicroManager 분자 장치</td><td>해당 없음 MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ 다른 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 입자 추적</td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>고감도 EMCCD 카메라</td></tr><tr><td>트래핑 레이저</td><td>IPG 포토닉스</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>1,064nm 레이저, 10W</td></tr><tr><td>형광 여기 레이저</td><td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>사파이어 488 LP 사파이어 552 LP</td><td>여기 녹색 형광단 여기 적색 형광단</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>상업용 흐름 챔버</td><td>워너 인스트루</td>먼트 <td>RC-20 또는 RC-30</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatus</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>두 펌프 모두 필요한 액체 유량 속도를 제공하지만 연동 펌프는 매우 느린 속도로 펄스할 수 있습니다. 주사기 펌프를 사용한 흐름은 다양한 속도에 대해 더 일관되지만 이 펌프에는 관성이 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">표 2. 현미경 챔버 준비.</td></tr><tr><td>재사용 가능한 챔버를 위한 수정된 현미경 슬라이드</td><td>콜로라도의 정밀 유리 불기</td><td>www.precisionglassblowing.com</td><td>그림 1</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm의 회로도를 사용하여 슬라이드의 Sonic 슬롯을 맞춤 주문; 이 튜브를 사용하여 조립된 챔버를 펌프 및 폐기물 용기에 연결하십시오.</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; 이 튜브를 사용하여 재사용 가능한 챔버를 만드십시오.</td></tr><tr><td>일반 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>다른 유사한 슬라이드를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td><td>다른 유사한 coverslips를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>실리콘 실란트</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 접착제</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 접착제</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>또는 다른 제조업체의 cyano아크릴late 접착제</td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Coverslips 청소 및 코팅.</td></tr><tr><td>Molecular Sieves, Grade 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass Staining</td><td>Jar Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 세라믹 홀더</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenin AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">표 4. 씨앗 및 분절된 미세소관의 준비.</td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>purified from cow brains Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>정제 프로토콜은 49&ndash를 참조하십시오. 51 Unlabeled porcine tubulin</td></tr><tr><td>Labeled tubulin</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenin)</td><td>Rhodamine-labeled porcine tubulin Tubulin은 참조52와 같이 모든 아민 반응성 염료로 라벨링할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>부분 표본 및 -70 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>바셀린, 라놀린, 파라핀을 1:1:2로 질량</td><td></td> 기준으로 <td>참조9</td></tr></tbody></table>

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

미세 소관 해중합은 체외에서 다른 단백질 복합체 단백질 코팅 비즈를 수송하는 힘을 제공 할 수 있습니다. 기본 메커니즘은 세포 분열 중에 미세 소관 의존 염색체 운동에 중요한 역할을하는 것으로 생각되지만, 관련 단백질과 자신의 정확한 역할은 불분명합니다. 따라서, 정제 된 구성 요소와 정의 생화학 적 환경을 사용하여 체외에서 이러한 운동을 연구하는있는 분석법을 개발하는 요구가 증가하고 있습니다. 미세 소관은, 그러나, 본질적으로 불안정 중합체이다, 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 photoablatable는 캡을 안정으로 만든 분할 된 미세 소관을 활용. 이러한 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝에서 운동의 연구를 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다. 이 기술은 CA에 사용될 수있다동적 미세 소관은 끝 processively 이동 형광 표지 된 단백질 복합체, 분자의 수의 정량적 인 분석을 RRY. 이것으로 신호 대 잡음 비율 및 기타 정량적 형광 분석법을 최적화하려면, 커버 슬립은 수용성 형광 표지 된 단백질의 비특이적 흡착을 감소하도록 처리한다. 상세한 프로토콜은 고려 형광 조명의 불균일을 취해, 등거리 가우시안 적합하여 하나의 형광의 강도를 결정하기 위해 제공된다. 마지막으로, 우리는 processive화물 운동에 몇 미세 소관 해중합에 다른 모터와 nonmotor 단백질의 기능에 대한 통찰력을 제공하는 단백질 코팅 마이크로 비즈의 미세 소관에 의존하는 동작을 연구하는 분할 된 미세 소관의 사용을 설명합니다.

미세 소관을 해중합과 추적 단백질이 끝납니다. 효모 동원체 구성 요소 Dam1는 지금까지 해중합 미세 소관의 최고의 팁 트래커 (14)를 종료한다. GFP로 ​​표지이 10-서브 유닛의 복잡한 쉽게 표현 박테리아 세포 18,38에서 정제, 그래서 우리는 끝 추적 분석에 대한 긍정적 인 제어로 사용하는 것을 권장 할 수 있습니다. 미세 소관의 해중합 끝으로 추적 형광 단백질은 꾸준히 coverslip에 부착 씨 (비디오 3)쪽으로 이동 밝은 형광 자리로 볼 수있다. 또한 해당 kymograph (그림 2E)에 사선으로 표시됩니다. 단백질이 트랙을 팁에 실패 할 경우 반면에, 미세 소관은 인간 Ndc80-GFP 복잡한 19 (그림 2 층)에 볼과 같은 미세 소관의 끝에서 형광 신호의 농축을 표시하지 않고 짧아집니다. processive 추적 관찰 될 때...

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

다음 실험의 전반적인 목표는 탈중합 미세소관의 말단과 함께 단백질 분자와 단백질로 코팅된 비드의 움직임을 연구하는 것입니다. 이는 재사용 가능한 플로우 챔버를 깨끗한 크기의 커버 슬립으로 조립하여 달성됩니다. 다음으로 미세소관 씨앗을 커버 슬립에 부착하여 준비하고 미세소관을 핵 생성하는 데 사용한 다음 광파괴 가능한 캡으로 임시로 안정화합니다.그런 다음 GFP 표지된 단백질 또는 단백질 코팅 비드가 유동 챔버에 도입되어 분절된 미세소관에 결합합니다. 그런 다음 마이크로 튜브 해중합은 광 절제에 의해 캡을 제거하여 트리거됩니다. 이미지는 CH로 분석하여 표지된 단백질이 탈중합 미세소관의 말단과 함께 이동하는 팁 추적 동작을 나타내는지 여부를 결정합니다.이 기술의 주요 장점은 높은 시간적 및 특수 해상도로 미세소관 형성을 유발할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 매우 중요합니다. 프로토콜은 초음파 밀링을 사용하여 플로우 챔버 준비 및 조립으로 시작됩니다.일반 현미경 슬라이드에 두 개의 홈이 있도록 수정합니다. 홈을 14mm 간격으로 만듭니다. 정사각형 22mm 커버 슬립을 사용하여 조립된 챔버에 가장 적합한 1mm를 주거나 받습니다.그런 다음 슬라이드의 각 홈에 100mm 길이의 폴리에틸렌 튜브를 놓고 홈의 안쪽 끝에 약 5mm 돌출부를 남겨둡니다. 시아노아크릴레이트 접착제로 홈 내부에 튜브를 고정하고 튜브를 홈 내부에 완전히 삽입합니다. 엎지르지 않고 에폭시 접착제로 홈을 조심스럽게 채웁니다.하루 동안 말리십시오. 다음 날. 날카로운 면도날을 사용하여 각 부착 부위의 말단 끝에서 3-4mm 떨어진 곳에서 응고된 접착제를 자릅니다.슬라이드 중앙에 근접한 부품을 제거합니다. 튜브는 홈에 남아 있어야 하고 절단부는 튜브 개구부가 있는 평평한 표면을 만들어야 합니다. 다음으로, 주사기에 물을 채우고 튜브가 제대로 작동하는지 테스트합니다.액체가 자유롭게 흐르면 홈의 바깥쪽 끝에 직경 약 5mm의 에폭시 접착제 한 방울을 떨어뜨리고 하루 정도 건조시킵니다. 따라서 완성된 플로우 챔버는 내구성이 뛰어나 수개월 동안 반복적으로 사용할 수 있습니다. 이 3시간 프로토콜은 12개의 커버 슬립을 준비합니다.흄 후드, 세라믹 커버 슬립 홀더 1개, 15밀리리터 3개, 염색 용기 3개, 뚜껑이 있는 250밀리리터 유리 용기 1개가 필요합니다. 염색 용기는 4개의 일반 번호 1 22mm 커버 슬립을 스택에 넣어야 합니다. 세라믹 홀더에 미리 청소하고 건조시킨 12개의 커버 슬립 더미로 시작합니다.항아리에 플러스 하나의 반발 실렌 용액을 채우고 슬라이드를 천천히 내립니다. 병을 닫고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 균일한 커버 슬립 문명을 보장하기 위한 가장 중요한 단계는 Selene 용액에서 커버 슬립을 배양하는 동안 물 흔적을 피하는 것입니다.이 단계는 마이크로 난관 씨앗의 단단한 부착에 필수적입니다. 나중에 프로토콜에서 커버 슬립이 준비되면 항아리에서 세라믹 홀더를 제거합니다. 그런 다음 테프론 코팅 핀셋을 사용하여 세라믹 홀더에서 메탄올이 로드된 염색 용기로 커버 슬립을 개별적으로 옮깁니다.이제 세 개의 항아리를 금속 또는 유리 받침대가 있는 음파 욕조의 물통에 넣습니다. 수위는 항아리 높이의 2/3에 있어야 하며 항아리를 70와트에서 20분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 중에는 5 분마다 메탄올 용액을 교체하십시오.초음파 처리가 완료되면 헹구고 덮개가 탈 이온수로 10 번 미끄러집니다. 사일로화가 제대로 작동하면 커버 슬립이 건조하게 보입니다 물에서 꺼냈을 때 외관에 관계없이 잔여 물을 철저히 제거하십시오. 질소 가스 이송을 사용하여 건조된 덮개가 질소 건조 밀봉 가능 용기로 미끄러집니다.인터레이 킴이 커버 슬립 사이로 닦는다. 이런 식으로 실온에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1-2시간, 1개의 플로우 챔버 및 준비된 G-M-P-C-P-P 안정화 마이크로 튜비알 시드가 필요합니다.먼저 플로우 챔버를 조립합니다. 준비된 슬라이드의 중앙 5mm 너비 영역을 따라 양면 테이프 두 개를 부착하고 커버 슬립을 테이프에 단단히 누릅니다. 1밀리리터 주사기를 사용하여 튜브를 통해 100마이크로리터의 B rrb 80 용액으로 챔버를 채웁니다.다음으로, 작은 플라스틱 페트리 접시 위에 두 가지 색상의 퀵 캐스트 실런트를 작은 방울 짜냅니다. 이쑤시개로 빠르고 철저히 섞으십시오. 녹색으로 바뀝니다.커버 슬립의 모든 가장자리를 따라 즉시 실런트를 바르십시오. 실런트가 커버 슬립 아래로 너무 깊숙이 침투하는지 확인하십시오. 튜브가 막힌 경우 주사기의 플러그를 뽑고 튜브를 들어 올려 실런트가 누출되는 것을 방지하기 위해 부드러운 압력을 가합니다.10분 후 용액 흐름이 제한되지 않았는지 확인하십시오.그런 다음 챔버를 섭씨 32도의 예열된 현미경 스테이지로 옮깁니다. 용액 제거를 위해 튜브 중 하나를 펌프에 부착합니다. 주입 튜브의 다른 쪽 끝을 따뜻한 BRB 80 완충액이 있는 0.5mm 바이알에 담그십시오.펌프를 분당 100마이크로리터로 설정하고 필요에 따라 사용하여 기포를 부드럽게 밀어냅니다. 이 작업은 수동으로 수행할 수도 있습니다. 이제 펌프를 사용하여 30마이크로리터의 따뜻한 항원 항체를 로드합니다.펌프를 끄고 5분 정도 기다립니다. 모든 배양 중에는 펌프를 끄십시오. 다음으로, 약 100마이크로리터의 따뜻한 b rrb 80으로 챔버를 세척합니다.그런 다음 BRB 80에서 50 % onic F1 27의 1 마이크로 리터를 관류합니다. 사일로화된 커버 슬립의 소수성 표면을 막을 때까지 10분 동안 기다립니다. 이제 100마이크로리터의 운동 버퍼로 챔버를 세척합니다.다음으로, 펌프 속도를 분당 15마이크로리터로 낮추고 30-40마이크로리터의 미세소관 시드를 1-200-1-600의 운동성 완충액으로 희석하여 챔버를 관류합니다. 씨앗을 15분 동안 배양한 다음 분당 100마이크로리터의 속도로 400마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거합니다. 다음으로, 펌프 속도를 분당 30마이크로리터로 줄이고 예열된 라벨링되지 않은 튜불린 용액으로 챔버를 관류합니다.이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 기포를 피하는 것입니다. 갓 준비된 튜불린 용액을 사용하고 특히 마이크로 튜블러 캡핑 중에 프로토콜의 정확한 타이밍을 따릅니다. 5-7분 배양 동안 DIC 광학 장치를 사용하여 미세 세뇨관 성장을 모니터링합니다.미세소관은 일반적으로 약 10미크론 성장하며, 전쟁 전의 Rumine Tubulin Mix와 용액을 빠르게 교환하고 8-10분 더 배양 시간을 허용합니다. 분당 20마이크로리터의 속도로 100마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 잘 세척하여 난류와 뉴클레오티드, 용해성 미세소관 단편을 제거합니다. 다음으로, GFP 표지된 단백질 또는 단백질 코팅된 비드의 가열된 용액으로 챔버를 관류하고 GFP로 표지된 DAM의 이미징을 진행하여 박테리아 세포에서 정제하고 팁 추적 분석을 위한 양성 대조군으로 사용했습니다.이러한 단백질은 미세소관의 해중합 말단을 추적하여 커버 슬립에 부착된 종자를 향해 꾸준히 이동합니다. 이러한 단백질은 해당 그래프에 비스듬한 선으로 나타나며, 이를 분석하여 팁 추적 복합체의 단백질 분자 수를 결정할 수 있습니다. 이 분석은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.대조적으로, 팁 트랙에 실패한 단백질은 분해 마이크로 말단에서 형광 신호의 농축을 보여주지 않습니다. 이것은 인간 NDC 80 GFP 단백질에서 볼 수 있습니다. 단백질로 코팅된 비드와 미세소관 사이의 결합은 일반적으로 매우 강하기 때문에 비드를 현미경 챔버에 추가하면 분할된 커버 슬립이 부착된 미세소관에 쉽게 결합됩니다.비드 추적이 프로세스형인 경우 많은 관찰을 수행할 수 있습니다. 하나의 미세소관에 부착된 구슬은 미세소관이 성장 부위 주위를 약간 회전할 때 호와 같은 움직임을 보였습니다. 안정화 캡이 비춰질 때 시드와 비드의 원위부에서 빨간색 세그먼트 하나만 보이면 비드가 하나의 미세소관에 부착된 것입니다.캡은 종종 캡이 표백될 때까지 비드의 움직임을 따라가는 것을 볼 수 있습니다: 표백 직후의 비드 움직임은 미세소관 방향과 일치하는 것으로 보입니다. 마이크로 튜비알이 짧아지고 비드가 시드 쪽으로 이동함에 따라 진동과 같은 호의 진폭이 감소합니다. 구슬이 안정적인 미세소관에 지속적인 부착을 형성하지 못하는 경우.레이저 트래핑은 TP가 있는 상태에서 분절된 마이크로 튜비알 벽에 비드를 발사하기 위해 이 기술이 필요했던 플러스 말단 지시 kinesin SE E의 다른 단백질 구조체와 함께 비드를 사용할 수 있습니다. 이 구슬은 그래프의 뚜껑이 있는 마이크로 tubial plus 말단을 향해 빠르게 움직였습니다. 이 움직임은 캡이 파괴된 후 캡을 향하는 비스듬한 선을 생성했습니다. 녹색 화살표로 표시된 대로 미세소관에서 분리된 잘린 스파이 단백질로 코팅된 구슬.대조적으로, 전체 길이 B 단백질을 가진 비드는 반대 방향으로 움직임을 유지할 수 있습니다. 이것은 chm 그래프에서 지그재그 패턴으로 보이며, 이는 미세소관의 플러스 또는 마이너스 끝에 반대 방향으로의 움직임으로 인해 발생합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세관 분해에 의해 유발되는 움직임을 연구하기 위해 유동 챔버를 준비하고 분절된 미세소관을 성장시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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연구

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