Name: 빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 인공 전사 인자(ATF)를 합성하고 GFP 기반 기자를 이용하여 효모에서 유전자 발현을 조절하는 방법을. 이 기법은 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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RSM은 NSF 대학원 연구 활동에서 자금 조달을 인정합니다. MBN은 루이스 - Sigler 원정대 자금 피터 루이스의 부여 선물을 인정합니다. DB는 NIH (GM046406) 양이 생물학 (GM071508)에 대한 일반적인 의학 센터의 국립 연구소에서 자금 조달을 인정합니다. 우리는 유동 세포 계측법 실험에 대한 지원은 크리스티나 DeCoste을 인정합니다.

그림 2는 프로토콜 섹션 1-3의 회로도를 제공한다. 1. ATFs의 창조 <ol><li> PCR은 관심의 DNA 결합 도메인을 증폭하기위한 프라이머를 만듭니다. ACT1 프로모터 및 호르몬 수용체에 상 동성이 (도 3 및도 4의 설명 참조) 균주 yMN15으로 정확한 재결합을 용이하게하기 위해 PCR을 통해 부가된다. </li><li> PCR은 높은 충실도 중합 효소를 사용하여 그 DBD를 증폭. </li><li> 리튬 아세테이트 방법 (13)을 이용하여 효모로 정제 된 PCR 생성물의&gt; 1 μg 변형. </li><li> 마이크로 원심에서 15 초 동안 최고 속도로 변환, 회전 세포에 따라 변형 믹스를 제거합니다. </li><li> YPD에 멸균 물과 판의 ~ 200 μL에 재현 탁. </li><li> 다음 날, YPD에서 복제 판은 5-FOA 판에 13 (콜드 스프링 하버 효모의 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 5-FOA 플레이트가 만들어집니다). </li><li> 2-4 일 동안 성장을 허용AYS 및 restreak 적어도 5-10 식민지 YPD 상. 포함을 확인하기 위해 표 1과 순서에 프라이머를 사용하여 식민지 PCR을 수행합니다. </li></ol> 2. ATF 플라스미드 기자의 창조 <ol><li> (문학에서 올 가능성이 가장 높은) ATF의 결합 부위를 확인합니다. </li><li> (필요한 경우, 또는 Ultramers) 주문 올리고으로 결합 영역을 원하는. 표 2에 나타낸 바와 같이를 NotI 및 XbaI의에 대한 올바른 오버행 위쪽과 아래쪽 가닥으로 주문하십시오. </li><li> 몰 농도 (100 μM)에 올리고 희석. </li><li> T4 폴리 뉴클레오티드 키나제 및 열 순환기에 다음 어닐링을 이용하여 인산화. 반응 조건은 표 3에있다. </li><li> 다이제스트 ~ 1 ~ 37 ° C (표 4의 반응 조건)에서 1 시간 동안을 NotI-HF &amp;를 XbaI과 pMN8 ㎍의. </li><li> 젤 백본 밴드를 정화. </li><li> 10 NG / μL로 정제 된 백본을 희석. </li><li> 이중 가닥, 포스 희석μL 당 백본의 몰 농도를 5 배에 바인딩 사이트를 ated. </li><li> T4 DNA 리가 제를 사용하여, 30 분 (표 5) 실온에서 소화 백본에 결합 부위를 결찰. </li><li> 변환의 경우, 표준의 50 μL, 같은 XL1 - 블루 또는 DH5-알파와 같은 화학적으로 유능한 대장균 절반 연결 반응을 추가합니다. </li><li> 다음 열 충격 42 ° C의 물을 욕조에 45 초 동안 세포와는 2 분 동안 얼음에 배치합니다. </li><li> 변환 반응에 SOC 매체 900 μl를 추가합니다. </li><li> 롤러 드럼에 1 시간 동안 37 ° C에서 성장. </li><li> LB + AMP (100 ㎍ / ㎖)을 접시 당 100 ~ 200 ㎕의 세포를 확산하고 밤새 품어. </li><li> E.을 성장 LB + AMP의 대장균 액체 및 수확 플라스미드 DNA. 순서는 프라이머 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;를 이용하여 결찰 식민지에서 새로운 리포터 플라스미드를 확인합니다. </li><li> ATF 함유 효모 STR에 새 기자 플라스미드를 변환리튬 아세테이트 변환을 사용하여 제 1 항에서 알아. </li></ol> 3. GFP 리포터를 사용하여 유전자 발현에 ATF 유도의 효과를 정량화 샘플을 준비 : <ol><li> 25 mM의 β-에스트라 디올 주식 (β-에스트라 디올의 에탄올 + 0.0681 g을 10 ㎖)를 확인합니다. 냉장 보관하십시오. </li><li> ATF는 + 5ml는 SC-URA에 밤새 긴장을 기자 함유 성장. </li><li> 확보 구 250 ㎖의 플라스크를 흔들어 각각 25 ㎖의 SC-URA를 추가합니다. </li><li> 0 NM, 0.1 nm의, 1 nm의 10 ㎚, 100 NM, 1 μM, 10 μM의 β-에스트라 디올을 추가합니다. 이 가장 쉽게 25 mM의 β-에스트라 디올 주식의 10 배 희석으로 제작하여 수행됩니다. 10 μM의 β-에스트라 디올의 최종 농도를 들어, SC-URA 25 ㎖에 25 mM의 β-에스트라 디올 주식의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 플라스크 (1:200 희석)에 하룻밤 문화의 125 μl를 추가합니다. </li><li> 2 나머지 플라스크를 들어, 구성 적 GFP 생산 strai 접종n 및 GFP 부족한 변형. 이러한 사이토 흐름을 교정하기위한 요구된다. </li><li> 12 ~ 18 시간 동안 30 ° C에서 200 rpm으로 흔들어. 참고 : 최적의 배양 시간이 GFP 유도 더 이상 변화가 β-에스트라 디올의 추가 다음 경우 식별에 의해 결정된다. </li><li> 각 문화의 500 μl를 가지고 별도의 1.7 ML의 마이크로 원심 튜브에 스핀 다운. </li><li> 기음 SC-URA. </li><li> 1 ㎖ PBS +0.1 % 트윈 20 대기음에 한 번 씻으십시오. </li><li> PBS +0.1 % 트윈 20에 resuspend의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 팔콘 튜브에 PBS +0.1 % 트윈 - 20의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 5 ML 튜브 (최종 부피 = 2 ㎖)에 재현 탁 셀을 추가 (몇 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.) </li><li> 선택 사항 : 이별에 가볍게 초음파 처리 세포 어떤 응집 세포. 유동 세포 계측법 분석 : 개요 : 10,000-100,000 세포의 형광은 일반적으로 샘플 당 분석된다. 데이터 FlowJo 또는 MATLAB에서 사용자 정의 스크립트를 사용하거나 하나를 처리 할 수​​ 있습니다R.는 GFP 양성 및 음성 컨트롤을 사용하여 GFP 채널의 전압을 조정해야합니다. FCS 파일이 반출되면, 그러한 기능 fca_readfcs (함께도 6의 것과 같은 스크립트 <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader가</a> ) 처리하는 데 사용될 수있다 데이터. </li><li> 유동 세포 계측법을 수행합니다. <ol><li> 효모 세포를 식별하는 데 사용할 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC). </li><li> ~ 3000 세포 / 초의 유량을 설정한다. </li><li> GFP (FITC 채널)를 측정한다. </li><li> 데이터가 수집되면, 수출. FCS 파일 </li></ol></li><li> MATLAB을로드합니다. </li><li> . FCS 파일, fcs_readfcs.m, 그림 6에서 동일한 폴더에 유사한 스크립트를 이동합니다. </li><li> 데이터 및 스크립트가 포함 된 폴더에 현재 작업 디렉토리를 변경합니다. </li><li> (참고 그림 6에서 스크립트를 실행합니다 :전설 수동) 그림 7에서 볼 무엇을 생산하기 위해 입력되었습니다. </li></ol> 4. 세포 성장에 ATF 유도의 효과를 정량화 <ol><li> 냉동 주식에서, 모두 밖으로 행진 (1) 별도의 YPD 판에 ATF 함유 변형 (예 : yMN15 등) (2) ATF-부족한 변형. </li><li> 성장의 2 일 후, 각 균주 YPD 액체 5 ㎖를 포함하는 별도의 문화 튜브에 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 성장 </li><li> 10 배 100 % 에탄올에 1 만 배 (0.025 μM β-에스트라 디올)에 0.25 mM의 β-에스트라 디올 원액까지의 일련의 희석을 수행합니다. </li><li> YPD 액체 (1-250 희석) 10 ㎖에 하룻밤 문화의 40 μl를 추가합니다. </li><li> 각 균주를 들어, 96 - 웰 플레이트의 18 우물에 희석 세포의 96 μl를 추가합니다. </li><li> 세포에 β-에스트라 디올의 4 μl를 추가합니다. 중요한 점은 각 웰 총 에탄올의 동일한 금액을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. (대안 적으로, MO<html> β-에스트라 디올의 집중 재고를 사용하고 이후 지점으로 희석 될 수있다 다시 성장에 에탄올의 효과) 측정하지 않습니다. </li><li> 세중의에서 수행합니다. 각 변형에 대한 우물의 세 에탄올 전용 컨트롤해야한다. </li><li> 가스 투과 막에있는 96 - 웰 플레이트를 커버. </li><li> 플레이트 리더의 성장 (OD 600)를 모니터링합니다. </li><li> 이러한 최대 슬로프를 찾는 같은 표준 방법을 사용하여 임의의 수의 증가율을 계량화한다. 참고 : 우리는 R 프로그래밍 환경에서 실행되는 오픈 소스 소프트웨어 패키지 grofit 14 일 좋은 성공을 했어 그것은 언급 할 가치가있다 그 96 - 웰 플레이트 분석에서 계산 성장률 (25 ㎖의 문화) - 플라스크를 흔들어 비교하면서. 필요한 것은 아닙니다 (때문에 생리학 및 계측에서 모두 차이), 우리는 (이것은 항상 그렇지 않을 수도 있지만) 상대적으로 성장 속도가 유사하다는 것을 발견했습니다 같은. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. 유도 성 게놈 대립 만들기 <ol><li> pMN10, (반대 방향으로) KanMX에 융합 pMN8에서 ATF 응답 프로모터 noncentromeric 플라스미드를 얻습니다. </li><li> 제한 섹션 2와 벡터 백본 젤 추출물을 소화. </li><li> 단련, 인산화 및 제 2 절에 설명 된대로 적절한 바인딩 사이트를 포함 결찰 올리고. </li><li> 순서는 확인합니다. 이 플라스미드는 이제 유도 대립 유전자를 만들기위한 DNA 템플릿이 될 것입니다. </li><li> 관심의 해당 ATF를 표현하는 효모를 얻습니다. </li><li> PCR은 표 6에서 프라이머를 사용한 KanMX 촉진제 카세트 (~ 2킬로바이트)를 증폭한다. </li><li> 리튬 아세테이트 방법을 사용 ATF-발현 균주에 PCR 생성물을 변형. </li><li> YPD + G418 다음날 위에 YPD 및 복제 접시에 접시. </li><li> 일까지 앞으로 프라이머 (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) 및 역방향 프라이머 내부를 사용하여 프로모터의 적절한 삽입 확인그 발기인 전자 유전자는 대체되었습니다. 역방향 프라이머는 일반적으로 첫번째 ATG (15)의 하류 200-300 bp의 사이가 될 수 있도록 설계된다. 최종 PCR 제품은 ~ 1.2 KB입니다. </li></ol>

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</ol>

McIsaac, 노이스, 그리고 Botstein (다른 사람들과)는 특허 공개로이 시스템의 일부를 제출했다.

여기에 설명 된 호르몬 기반의 스위치는 생체 내에서 DNA 시퀀스를 대상으로 그 DNA 결합 도메인의 능력을 테스트에 기본 세포 생물학을 공부, 수많은 응용 프로그램이 있습니다. 이 시스템은 유도, 빠른 조치, 꽉 규제 등급 응답 등 많은 바람직한 기능이 없습니다 (즉. 측정 가능한 leakiness를, 그림 7 참조). 그러나, 개선 및 확장의 여지가 여전히있다. 합성 생물학의 최근 연구는 다중 합성 시스템을 강조하고 잘 특징으로, 프로그램 DNA 부분 (16)의 레퍼토리를 확장하고있다. 별개의 표적 유전자의 독립, 조건식 여러 유도 및 중복 특이성이 부족 DNA 결합 도메인이 모두 필요합니다. 엔지니어링 및 자연적으로 발생하는 수용체의 가용성은 새로운 인공 전사 인자를 개발되는 부품의 큰 세트를 제공합니다. 확장상호 직교 스위치의 레퍼토리는 크게 (17, 18)에 접근 감독 진화에 힘 입어있다. 우리 인공 전사 인자의 리간드 - 결합 특이성을 재 프로그래밍 전류 노력은 미래에 제시 될 것이다. 이전에는 유전자 삭제 / 과발현 형질 결과는 광범위하게 효모 (19, 20)에서 연구되고있다. 그러나, 발현 수준의 범위에서 서로 다른 표현형에 표현의 효과를 연구 간단한 것부터되지 않았습니다. 여기에 제시된 시스템의 주요 특징은 등급을 매긴 자연 (그림 8)입니다. 종종 가정 반면, 유전자 발현과 그 표현형 사이의 관계가 반드시 단조하지 않을 수 있습니다. 이러한 Z 3 EV 및 Z 4 EV 인공 전사 인자는 간단 유전자 발현의 변화에 표현형 응답을 시금의 작업을하게됩니다. 마지막으로, 프로토콜 토론이 원고의 에드 엔지니어링 및 에스트라 디올을 β에 반응 인공 전사 인자의 특성을위한 것입니다, 그러나, 중요한 다른 화학적 반응 도메인 (예 : PhyB/Pif3, LOV 및 BLUF 등) 등 응답 도메인을 사용하는 것입니다, 그의 활동은 문화의 성장 매체 21-23를 교란하지 않고 되돌릴 수 있습니다. 광 기반 시스템은 시공간 유전자 발현의 조절, 단백질 - 단백질 상호 작용, 이온 수송 및 이미 21-26 강력한 입증 효소 활성을 촉진한다. 결론적으로, 우리는 효모에서 유도, 인공 전사 인자의 신속한 건설을위한 방법을 제시 하였다. 이 프로토콜은 자신의 동족 GFP 기자와 함께 건설뿐만 아니라, 유동 세포 계측법을 사용하여 기자의 데이터를 분석하고 성장에 ATF 활성화의 효과를 시금 방법에 대한 템플릿을 제공합니다.

효모에서 유전자 스위치를 개발하는 것은 학문과 산업 모두 연구에 큰 관심입니다. 이상적인 경우, 유전자 스위치는 실험자가 원하는 경우에만 특정 유전자 (또는 유전자 세트)을 활성화하는 데 사용할 수있다. 하류 합성 프로모터의 배치 유전자의 코딩 서열을 유도 분자의 부재로 표현되지 않는다 : 유도 물질을 첨가 할 때 유전자 발현이 빠르게한다. 그것은 단지 최근 이러한 스위치는 유도제의 부재에 변형이 결실 표현형을 표시하지만 유도제의 존재하에 발현은 모든 세포에서 유도의 수준에 비례하여 활성화 효모에서 설계 될 수 있다는 것을 증명되었다 1,2. 역사적으로, 효모 조건식 시스템은 MET, PHO 및 GAL 프로모터 (활동 메티오닌, 인산의 세포 수준에 민감 등 영양소 응답 DNA 서열에 크게 의존갈락토스, 각각). 조건식이 달성 될 수 있지만, 그것은 상당한다면 발현 효과의 선정에 온다. 이러한 인간의 에스트로겐 수용체로 호르몬 수용체는 진핵 생물 3,4 효과 스위치적일 수있다. 호르몬의 부재에서, 호르몬 수용체 융합 단백질은 그것의 Hsp90 샤페론 복합체와 상호 작용하는 세포질에서 압수 될 수있다. 적절한 리간드를 결합하면, 수용체는의 Hsp90 보호자 단지에서 배출되는 원인과 핵 지방화 신호를 공개, 구조적인 변화를 겪는다. 특정 호르몬 수용체 함유 단백질의 현지화 역학을 관찰하기 위해, 우리는 Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, Gal4p DNA 결합 도메인, 인간 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 합성 전사 인자의 C-말단 융합을 생성 , 및 VP16) GFP 2. 핵 이행을 첨가 한 다음에 13 분 이내에 관찰되는 야생형 효모가 완전히 불활성, 유도, ß-에스트라 디올의 양을 포화. 이 시간까지, 세포의 대부분은 (형광 제자리 교잡을 통해 정량) GEV의 표적 유전자에 대한 명확하게 보이는 활성 전사 사이트뿐만 아니라 완전히 성숙의 mRNA 2,5있다. GEV의 표적 유전자는 핵으로 이동시키다 DNA에 결합하고, 전사를 활성화하기 위해 &lt;키메라 활성화 2.5 분을 소요 보여, 2.5 분 2,6 (마이크로 어레이를 사용하여 측정) 내에서 표현&gt; 2 배 증가. 여러 온 - 스위치, 다른 하나는, 아무도 속도를 달성 없습니다 (대장균 대장균에서 고전 독시사이클린 (doxycycline) 기반의 스위치 7,8와 애기 장대에서 인디고 기반 스위치 9 포함) 다양한 작은 분자 또는 약물을 사용 효모에 적용되었지만, 특이도, 또는 호르몬 기반의 스위치에 의해 전시 된 규제의 압박감. 그것은 t 언급 할 가치가있다모자 급속-스위치 오프 또한 효모에서 개발되었으며, 일반적으로 순서 2,10,11,12을 대상으로 단백질 분해 효소 또는 유비퀴틴 리가 아제에 유전자를 융합하여 작동합니다. 급속 셀로부터 목적 단백질을 분리하는 능력은 필수 유전자의 연구뿐만 아니라 열을 삭제할 때 유전 억제하는 경향이있는 유전자를 용이하게한다. 이 프로토콜에 설명 된 방법을 구축하고 온 스위치 효모 합성의 특성을위한 것입니다. 첫째, 우리는 신속하게 그 DNA 결합 도메인으로 구성된 유 전적으로 통합 된 융합 단백질을 생성하는 방법을 보여, 리간드는 인간 에스트로겐 수용체 결합 도메인 및 VP16 (DBD-EV의). 우리의 프로토콜에 따라, 융합 단백질 ACT1 프로모터로부터 발현된다. 우리는 그 다음 ATF의 동족 기자 플라스미드를 만들고 유동 세포 계측법을 사용하여 기능을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 우리는이 기자의 플라스미드는 새로운 ATFs (그림 1)에 사용되는 구상이지만, 그들은 B 수전자뿐만 아니라 네이티브 전사 활성에 대한 기자로 사용된다. 마지막으로, 96 - 웰 플레이트에서 세포 증식에​​ ATF 활성화의 효과를 테스트하고 유도 게놈 대립 유전자 공학 상세가 제공된다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td>회사</td> 이름 <td>카탈로그 번호</td><td>코멘트&nbsp;</td></tr><tr><td>확장 High Fidelity PCR 시스템</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Competent E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>NEB</td>, <td>M0201</td><td></td></tr>, <tr><td>PBS,</td><td>Life Technologies</td><td>, 10010-23</td><td></td></tr>, <tr><td>Tween-20</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr>, <tr><td>클론NAT</td>, <td>Jena Bioscience</td>, <td>AB-102L</td><td></td></tr>, <tr><td>XbaI</td><td>, NEB</td><td>, R0145S,</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF,</td><td>NEB,</td><td>R3189S,</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart, 버퍼,</td><td>NEB</td>, <td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN</td><td></td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>연어 정액 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 pMN8 및 pMN10; 효모 균주 yMN15</td><td>Noyes 또는 Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>장비:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRII 플로우 사이오미터&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>다양한 모델</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 또는 FlowJo</td> MATLAB <td>또는 FlowJo</td><td></td><td>분석 소프트웨어. 유세포 분석 실험의 FCS 파일</td></tr><tr><td>R</td><td>오픈 소스</td><td></td><td>플레이트 리더의 성장률 데이터를 분석합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml Eppendorf&nbsp; 튜브</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250ml 쉐이크 플라스크</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96-well, 평평한 바닥 플레이트</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더 (Synergy H1 다중 모드 플레이트 리더)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy 멤브레인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>다양한 회사</td><td>다양한 모델</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura 분말</td><td>MP Biomedicals</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

빠른 합성 및 gfp 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

합성 생물학 이성적으로 디자인 및 소망 정량적 특성과 합성 회로를 구축 할뿐만 아니라, 기본 제어 회로의 구조를 심문하는 툴을 제공하는 것을 목적으로한다. 두 경우 모두, 제공된 표적 이탈 효과, 신속하고 가변 방식으로 유전자 발현을 프로그래밍하는 능력은 유용 할 수있다. 우리는 사람의 에스트로겐 수용체와 VP16의 리간드 결합 도메인 뒤에 URA3 카세트의 ACT1 프로모터 상류를 포함하는 효모 균주를 구축했다. URA3의 존재에 대한 DNA 결합 도메인 및 선택을 포함하는 선형 PCR 생성물로 균주를 변형시켜, 구성 적으로 발현 인공 전사 인자 (ATF)는 상동 재조합에 의해 생성 될 수있다. 이러한 방식으로 설계된 ATFs함으로써 오프 - 타겟 활성화와 일반적으로 사용되는 컨디셔닝 발견 nonphysiological 성장 조건을 모두 제거 유도제의 존재 하에서 고유 표적 유전자를 활성화 할ONAL 유전자 발현 시스템. 그 기본 또는 인공 전사 인자에 특이 적으로 반응 GFP 기자 플라스미드의 신속한 건설을위한 간단한 방법도 제공됩니다.

<html> 그림 5는 시간이 지남에 Z 3 EV, Z 4 EV, 또는 GEV로 GFP의 유도를 보여줍니다. 결합 도메인 nonyeast DNA를 함유 ATFs에 응답 GFP 생산의 증가를 참고. 우리는 최근이 효모 게놈 1에 단일 유전자의 특이성을 달성 이러한 요인의 결과 추측. Z 3 EV 및 Z 4 EV는 다운 스트림 적절한 결합 부위 (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;와 5&#39;-포함하는 합성 프로모터의 위치 표적 유전자의 발현을 활성화하는 반면 혼자 GEV 유도는, 수백 개의 유전자의 활성화 / 억압에 이르게 GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, 각각) 1. 그림 7은 시스템 (탐지 가능한 GFP 없음 유도 결과)의 모든 셀이 범위에 걸쳐 GFP를 유도하는 Z 3 EV의 능력을 유도에 대한 응답으로 유도 얻을 꽉 규제를 보여줍니다 β-에스트라 디올 농도는 그림 8에 나와 있습니다. <html> 천만에 &quot;FO : 유지 - together.within 페이지를 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> 그림 1. β-에스트라 디올은 ATF에 바인딩 할 때 인공 전사 인자는 β-에스트라 디올.의 부재에서의 Hsp90와 상호 작용의 Hsp90은 ATF가 핵을 입력하고 플라스미드 기자의 표현을 활성화 할 수 있도록, 해리. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> 그림 2. 인공 전사 인자 및 건물 / 동족 GFP 기자를 테스트를 포함하는 엔지니어링 계통에 대한 프로토콜의 개략도. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. LEU2 궤적의 변형 yMN15의 ACT1pr-URA3-EV 순서. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> 성공적으로 yMN15로 변환 할 때 새로운 융합 단백질을 생성하기 위해 추가로 상 동성에 관심이 DNA 결합 도메인을 증폭하기위한 PCR 프라이머의 그림 4. 디자인. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> 그림 5. GFP 유도 1 μM의 β-에스트라 디올에 대한 응답으로 세 가지 다른 ATF-프로모터 쌍으로. &lt;/ P&gt; <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> 그림 6. 세포 계측법 데이터 처리 흐름에 대한 MATLAB 스크립트. 이 스크립트에서 적응했다 <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> 0 μ M의 β-에스트라 디올과 유도의 18 시간 다음 1 μM의 β-에스트라 디올에 대한 응답으로 Z 3 EV로 GFP의 그림 7. 유도. 형광도 내 잘못이었다Z 3 EV 시스템의 타이트한 규정을 설명하기 위해 GFP 부족한 세포에서 시작될 때까지 누출. 이 그림은 그림 6의 코드를 사용하여 생성되었습니다. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> 그림 8. 유도 물질의 농도와 표현의 출력 사이의 관계는 ~ 1 힐 계수 등급을 매긴다. (A) β-에스트라 디올 농도의 함수로 GFP 표현의 분포. (B) (A)에서의 분포의 평균 형광. 데이터는 D는 β-에스트라 디올 복용량 = G의 분 + (G MAX-G의 분) D N / (K N + D의 N), G 최소 및 G 최대가 최소되는 함수 G (D)에 적합했고, GFP 최대 값, RES에 각기, N 힐 계수, K는 ½ (G 최대 + G의 분)을 산출 β-에스트라 디올 용량입니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> 올리고 뉴클레오티드 시퀀스 </td><td> 이름 </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD는 앞으로 확인 </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD 검사 역 </td></tr></tbody></table> 테이블 1. 에스트로겐 수용체에 관심 DBD의 올바른 융합을 확인하는 프라이머. 앞으로 프라이머는 동종 ACT1 프로모터 및 역방향 프라이머는 에스트로겐 수용체에 상동입니다. 전형적인 DBD에 (~ 300 염기쌍)의 경우, PCR 생성물은 &lt;1.5 킬로바이트이다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> 올리고 뉴클레오티드 시퀀스 </td><td> 이름 </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD를 마시고 떠들 사이트 ... T-3 &#39; </td><td> 맨 위로 올리고 </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA 결합 부위 역 ... GC-3 &#39; </td><td> 바닥 올리고 </td></tr><tr><td> 5&#39;-GCC gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG T-3 &#39; </td><td> 맨 위로 올리고 + 6 배 Zif268 바인딩 사이트 </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> 바닥 올리고 + 6 배 Zif268 바인딩 사이트 </td></tr></tbody></table> 그 결합 부위를 포함하는 dsDNA를 만들기위한 프라이머의 표 2. S의 tructure. Z 3 EV 응답 프로모터를 만들려면, 올리고 뉴클레오티드 최고 올리고 + 6 배 Zif268 결합 부위와 바닥 올리고는 + 6 배 Zif268 바인딩을 사용 하였다.올바른 DNA의 오버행을 만드는 순서는 소문자로되어 있습니다. Zif268 컨센서스 결합 부위, GCGTGGGCG는 상단 올리고에 밑줄이 그어져 있습니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> T4 폴리 뉴클레오티드 키나제 버퍼 </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> T4 폴리 뉴클레오티드 키나제 (10,000 단위 / ㎖ @) </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 맨 위로 올리고 (100 μM) </td><td> 1.5 ㎕의 </td></tr><tr><td> 바닥 올리고 (100 μM) </td><td> 1.5 ㎕의 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 41 μL </td></tr></tbody></table> 표 3. 인산화 및 상기 반응의 50 μl를 사용하여 열 순환기의 어닐링 프라이머. 두 열 순환기 단계가 있습니다. 1 단계 : 37 ° C에서 30 분 (인산화), 2 단계 : 95 ° C 30 초 (어닐링), 4​​ ° C에서까지 1 ° C의 실망 매 30 초 단계. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 를 XbaI </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 를 NotI-HF </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 플라스미드 DNA </td><td> 5 μL (1 ~ 2 μg) </td></tr><tr><td> 배 컷 스마트 버퍼 </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 38 μL </td></tr></tbody></table> 표 4. 를 XbaI과 NotI을 가진 플라스미드 pMN8의 제한 다이제스트. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> 시약 </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> 양 </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4 리가 버피FER </td><td> 2 μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 리가 </td><td> 0.2 ㎕의 </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> 10 NG / μL @ 백본 </td><td> 1 μL </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> 배 몰 농도 / μL @ 바인딩 시퀀스 </td><td> 1 μL </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> 물 </td><td> 15.8 μL </td></tr></tbody></table> 표 5. 플라스미드 DNA에 결합 부위를 결찰. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> 뇌관 </td><td> 기술 </td></tr><tr><td> ~ 40 bp의 상류 ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> KanMX 발기인를 증폭 앞으로 프라이머 </td></tr><tr><td> 5&#39;-역 보체 (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> PRI에게 반전KanMX 발기인를 증폭 마 </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> GCN4 프로모터 스왑을 만들기위한 앞으로 프라이머. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> GCN4 프로모터 스왑을 만들기위한 역방향 프라이머. </td></tr></tbody></table> 표 6. PCR은 titratible 대립 유전자를 만들기위한 KanMX 발기인을 증폭.

이 프로토콜은 동족 GFP 기자 및 유동 세포 계측법을 통해 GFP 발현을 자극하는 ATFs 능력의 정량화 인공 전사 인자 (ATFs)의 신속한 건설을위한 실험 절차를 설명합니다.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

본 절차의 전반적인 목표는 원하는 특이성을 가진 유전적으로 암호화된 유도성 인공 전사 인자(artificial transcription factors, ATF)를 제작, 테스트 및 검증하는 것입니다. 이는 먼저 단순한 효모 형질전환을 통해 ATF를 제작함으로써 수행되며, 이때 DNA 결합 도메인 PCR 산물을 포함시키면 인간 에스트로겐 수용체 및 VP 16과 프레임 내 융합(in-frame fusion)이 일어납니다. 본 절차의 두 번째 단계는 플라스미드 PMN 8의 결합 부위를 TF 표적 서열로 교체하여 ATF용 GFP 리포터 플라스미드를 제작하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 ATF의 GFP 리포터 활성화 능력을 분석하고, 성장 속도를 측정하여 효모 생리학에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 검증된 TF를 사용하여 내인성 게놈 표적을 조건부로 발현시키는 것입니다. 궁극적으로, 관심 있는 모든 표적 유전자를 조건부 활성 상태로 만들 수 있습니다.갈락토스 매개 유전자 발현 유도와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 다면적 효과 없이 다양한 영양 및 생리적 조건 하에서 선택적 유도를 달성할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 원하는 유전자 생성물을 빠르고 가역적으로 도입함으로써 효모 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 기능 획득 및 상실 연구를 모두 가능하게 합니다. 우선, 고충실도 중합효소를 사용하여 관심 있는 DNA 결합 도메인(DBD)을 PCR로 증폭하십시오.리튬 아세테이트 방법을 사용하여 1 µg 이상의 정제된 PCR 산물을 효모에 형질전환시킵니다. 형질전환 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 최고 속도로 15초 동안 원심분리하고, 형질전환 혼합물을 제거한 뒤 약 200 µL의 멸균수에 세포를 재부유시킨 후 yeast extract Pepto dextrose 또는 YPD 배지에 도말합니다. 다음 날, YPD 배지에서 5-fluoroorotic acid 배지로 복제 도말합니다.2~4일 동안 배양한 후, 최소 5~10개의 콜로니를 YPD 배지에 다시 도말합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 기재된 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하고 시퀀싱을 통해 삽입 여부를 확인합니다. 원하는 결합 부위 올리고뉴클레오타이드를 등몰 농도로 희석합니다.텍스트 프로토콜의 반응 조건에 따라 T4 polynucleotide kinase와 neo thermocycler를 사용하여 결합 부위를 인산화합니다. 다음으로, 약 1~2 µg의 PMN 8을 Not I HF와 Xba I로 37 °C에서 1시간 동안 제한효소 처리합니다.백본 밴드를 정제하고, 정제된 백본을 10 nanograms per microliter로 희석합니다. 그런 다음, 이중 가닥 인산화 결합 부위를 백본 몰 농도의 5배가 되도록 microliter당 희석합니다. T4 DNA Ligase를 사용하여 실온에서 30분 동안 제한효소 처리된 백본에 결합 부위를 연결(ligation)합니다.라이게이션 반응액의 절반을 50 µL의 표준 화학적 컴피턴트 EIA coli 세포에 첨가하여 형질전환을 수행하고, 텍스트 프로토콜에 기재된 절차를 따릅니다. 세포를 회복시킨 후, Luria Berti 또는 LB plus ampicillin 플레이트당 100에서 200 µL의 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 LB plus ampicillin 액체 배지에서 E. coli를 배양하고, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 플라스미드 DNA를 수확합니다.그런 다음 라이게이션 콜로니로부터 새로운 리포터 플라스미드의 서열을 검증합니다. 마지막으로 리튬 아세테이트 형질전환법을 이용하여 새로운 리포터 플라스미드를 TF를 포함하는 E 균주에 형질전환합니다. 먼저 TF와 리포터를 포함하는 균주를 우라실이 결핍된 5 mL의 합성 완전 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다.250 milliliters 용량의 쉐이킹 플라스크 9개를 준비하고, 각각에 SC minus URA 25 milliliters를 첨가합니다. 그다지 25 millimolar beta estradiol 스톡 용액을 10배 연속 희석하여, 텍스트 프로토콜에 명시된 서로 다른 희석 농도의 beta estradiol을 7개의 플라스크에 각각 준비합니다. 여기에 하룻밤 배양한 배양액 125 microliters를 이 7개의 플라스크에 접종합니다. 나머지 2개의 플라스크에는 GFP를 상시 발현하는 균주와 GFP가 없는 균주를 각각 접종합니다. 이는 유세포 분석기를 보정하는 데 필요합니다.플라스크를 200 RPM, 30 °C에서 12~18시간 동안 흔들어 배양합니다. 그런 다음 각 배양액에서 500 µL를 취해 각각의 1.7 mL 에펜도르프 튜브에 넣고 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛 형태의 세포를 유세포 분석 버퍼로 한 번 세척하고, 동일한 버퍼 1 mL에 세포를 재현탁합니다.다음으로, 9개의 falcon tube에 유세포 분석 버퍼(flow cytometry buffer) 1 mL를 넣습니다. 재부유시킨 세포를 버퍼가 들어 있는 falcon tube에 추가하여 최종 부피가 2 mL가 되도록 합니다. 마지막으로, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행합니다.전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 이용하여 효모 세포를 식별합니다. 유속을 초당 약 3000 cells로 설정합니다. 50 채널을 통해 GFP를 측정하고, 냉동 보관된 균주로부터 시작하는 텍스트 프로토콜에 따라 A TF 함유 균주와 A TF 결핍 균주를 각각 YPD 배지에 스트리킹(streak out)합니다. 2일간 배양한 후, 5 mL의 YPD 액체 배지가 담긴 각각의 배양 튜브에 접종하고 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.0.25 millimolar beta estradiol 스톡 용액을 100% ethanol에서 최대 10,000배까지 10배 연속 희석합니다. 각 하룻밤 배양액 40 microliters를 10 milliliters의 YPD 액체 배지에 첨가합니다. 각 균주당 희석된 세포 96 microliters를 96 well plate의 18개 well에 첨가합니다.그 다음 세포에 beta estradiol 4 µL를 첨가합니다. 중요한 점은 각 웰의 총 에탄올 양이 동일하도록 하는 것입니다. 각 균주당 세 개의 웰을 에탄올만 처리한 대조군으로 설정하여 3회 반복 실험을 수행하십시오.대조군은 가스 투과성 막으로 96웰 플레이트를 덮습니다. 플레이트 리더기를 사용하여 600 nanometers의 광학 밀도에서 성장을 모니터링합니다. 최대 기울기를 찾는 방법 등 다양한 방법을 사용하여 성장률을 정량화합니다.텍스트 프로토콜 PCR에 안내된 대로 플라스미드를 준비한 후, can MX 프로모터 카세트를 증폭하십시오. 리튬 아세테이트법을 사용하여 PCR 생성물을 A TF 발현 균주에 형질전환하고, 형질전환된 세포를 YPD 플레이트에 도말한 후 다음 날 YPD plus G 418 항생제 플레이트로 복제 도말하십시오. 마지막으로, 프로모터가 교체된 유전자의 내부 리버스 프라이머와 포워드 프라이머를 사용하여 프로모터가 적절하게 삽입되었는지 확인하십시오.최종 PCR 산물은 약 1.2 KB이며, 여기에는 1 µM beta estradiol에 반응하여 시간에 따라 세 가지 서로 다른 a TF 프로모터 쌍인 Z four EV, Z three EV 또는 GEV에 의해 GFP가 유도되는 모습이 나타나 있습니다. 비효모 DNA 결합 도메인을 포함하는 ATF에 반응하여 GFP 생산이 증가함에 주목하십시오. 이는 이러한 인자들이 효모 게놈 내에서 단일 유전자 특이성을 확보한 결과일 수 있습니다.GEV 유도만으로는 수백 개의 유전자가 활성화 또는 억제되지만, Z three EV와 Z four EV는 적절한 결합 부위를 포함하는 합성 프로모터 하단에 배치된 표적 유전자의 발현만을 활성화합니다. 여기서는 0 nM beta estradiol과 18시간 유도 후 1 µM beta estradiol에 반응하여 Z three EV에 의해 GFP가 유도되는 것을 보여줍니다. Z three EV 시스템의 정밀한 조절을 설명하기 위해 GFP가 결핍된 세포에서 또한 형광을 측정하였습니다. 다양한 beta estradiol 농도 범위에서 GFP를 유도하는 Z three EV의 능력이 여기에 제시되어 있습니다.분포의 평균 형광 값은 유도제 농도와 발현 출력 사이의 관계가 힐 계수(hill coefficient) 약 1의 점진적 반응을 보임을 나타내며, 이는 Z three EV의 독립적인 결합을 의미합니다. 이 절차 이후, 단일 유전자의 발현 변화가 게놈 전체의 유전자 발현 패턴에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 유전자 발현 마이크로어레이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인공 전사 인자를 설계, 테스트하고 그 효능을 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 인공 전사 인자들은 적절한 DNA 표적 서열 하위에 위치한 유전자들의 발현을 조건부로 제어합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

여기에서는 세포 기반 리포터 유전자 분석을 3' UTR을 통해 발휘되는 전사 후 제어 메커니즘을 조절하는 화합물에 대한 화학 라이브러리를 스크리닝하는 유용한 도구로 설명합니다.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

예로서, 뮤린 ABC 수송 Bcrp1 (ABCG2)을에 실리 프로토콜은 마우스 조직에서 발현하는 유전자로 대체 프로모터 사용량을 검출하고, 리포터 분석법을 사용하여 확인 된 다른 프로모터의 기능을 평가하기 위해 제공된다.

방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 &gt; 1000 TFs 단일 실험에서.

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

전사 인자의 새로운 조절자를 확인하기 위해, 우리는 이중 luciferase 기반 의 전사 기자 분석을 사용하여 배열 된 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 RNAi 라이브러리를 선별하는 접근 법을 개발했습니다. 이 방법은 단일 실험에서 수백 개의 후보를 선별하는 빠르고 비교적 저렴한 방법을 제공합니다.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

학습하세요 인공 전사 인자(ATF)를 합성하고 GFP 기반 기자를 이용하여 효모에서 유전자 발현을 조절하는 방법을. 이 기법은 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

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