빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

본 절차의 전반적인 목표는 원하는 특이성을 가진 유전적으로 암호화된 유도성 인공 전사 인자(artificial transcription factors, ATF)를 제작, 테스트 및 검증하는 것입니다. 이는 먼저 단순한 효모 형질전환을 통해 ATF를 제작함으로써 수행되며, 이때 DNA 결합 도메인 PCR 산물을 포함시키면 인간 에스트로겐 수용체 및 VP 16과 프레임 내 융합(in-frame fusion)이 일어납니다. 본 절차의 두 번째 단계는 플라스미드 PMN 8의 결합 부위를 TF 표적 서열로 교체하여 ATF용 GFP 리포터 플라스미드를 제작하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 ATF의 GFP 리포터 활성화 능력을 분석하고, 성장 속도를 측정하여 효모 생리학에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 검증된 TF를 사용하여 내인성 게놈 표적을 조건부로 발현시키는 것입니다. 궁극적으로, 관심 있는 모든 표적 유전자를 조건부 활성 상태로 만들 수 있습니다.

갈락토스 매개 유전자 발현 유도와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 다면적 효과 없이 다양한 영양 및 생리적 조건 하에서 선택적 유도를 달성할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 원하는 유전자 생성물을 빠르고 가역적으로 도입함으로써 효모 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있으며, 기능 획득 및 상실 연구를 모두 가능하게 합니다. 우선, 고충실도 중합효소를 사용하여 관심 있는 DNA 결합 도메인(DBD)을 PCR로 증폭하십시오.

리튬 아세테이트 방법을 사용하여 1 µg 이상의 정제된 PCR 산물을 효모에 형질전환시킵니다. 형질전환 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 최고 속도로 15초 동안 원심분리하고, 형질전환 혼합물을 제거한 뒤 약 200 µL의 멸균수에 세포를 재부유시킨 후 yeast extract Pepto dextrose 또는 YPD 배지에 도말합니다. 다음 날, YPD 배지에서 5-fluoroorotic acid 배지로 복제 도말합니다.

2~4일 동안 배양한 후, 최소 5~10개의 콜로니를 YPD 배지에 다시 도말합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 기재된 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하고 시퀀싱을 통해 삽입 여부를 확인합니다. 원하는 결합 부위 올리고뉴클레오타이드를 등몰 농도로 희석합니다.

텍스트 프로토콜의 반응 조건에 따라 T4 polynucleotide kinase와 neo thermocycler를 사용하여 결합 부위를 인산화합니다. 다음으로, 약 1~2 µg의 PMN 8을 Not I HF와 Xba I로 37 °C에서 1시간 동안 제한효소 처리합니다.

백본 밴드를 정제하고, 정제된 백본을 10 nanograms per microliter로 희석합니다. 그런 다음, 이중 가닥 인산화 결합 부위를 백본 몰 농도의 5배가 되도록 microliter당 희석합니다. T4 DNA Ligase를 사용하여 실온에서 30분 동안 제한효소 처리된 백본에 결합 부위를 연결(ligation)합니다.

라이게이션 반응액의 절반을 50 µL의 표준 화학적 컴피턴트 EIA coli 세포에 첨가하여 형질전환을 수행하고, 텍스트 프로토콜에 기재된 절차를 따릅니다. 세포를 회복시킨 후, Luria Berti 또는 LB plus ampicillin 플레이트당 100에서 200 µL의 세포를 분주하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 LB plus ampicillin 액체 배지에서 E. coli를 배양하고, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 플라스미드 DNA를 수확합니다.

그런 다음 라이게이션 콜로니로부터 새로운 리포터 플라스미드의 서열을 검증합니다. 마지막으로 리튬 아세테이트 형질전환법을 이용하여 새로운 리포터 플라스미드를 TF를 포함하는 E 균주에 형질전환합니다. 먼저 TF와 리포터를 포함하는 균주를 우라실이 결핍된 5 mL의 합성 완전 배지에서 하룻밤 동안 배양합니다.

250 milliliters 용량의 쉐이킹 플라스크 9개를 준비하고, 각각에 SC minus URA 25 milliliters를 첨가합니다. 그다지 25 millimolar beta estradiol 스톡 용액을 10배 연속 희석하여, 텍스트 프로토콜에 명시된 서로 다른 희석 농도의 beta estradiol을 7개의 플라스크에 각각 준비합니다. 여기에 하룻밤 배양한 배양액 125 microliters를 이 7개의 플라스크에 접종합니다. 나머지 2개의 플라스크에는 GFP를 상시 발현하는 균주와 GFP가 없는 균주를 각각 접종합니다. 이는 유세포 분석기를 보정하는 데 필요합니다.

플라스크를 200 RPM, 30 °C에서 12~18시간 동안 흔들어 배양합니다. 그런 다음 각 배양액에서 500 µL를 취해 각각의 1.7 mL 에펜도르프 튜브에 넣고 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 펠렛 형태의 세포를 유세포 분석 버퍼로 한 번 세척하고, 동일한 버퍼 1 mL에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 9개의 falcon tube에 유세포 분석 버퍼(flow cytometry buffer) 1 mL를 넣습니다. 재부유시킨 세포를 버퍼가 들어 있는 falcon tube에 추가하여 최종 부피가 2 mL가 되도록 합니다. 마지막으로, 유세포 분석(flow cytometry)을 수행합니다.

전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter)을 이용하여 효모 세포를 식별합니다. 유속을 초당 약 3000 cells로 설정합니다. 50 채널을 통해 GFP를 측정하고, 냉동 보관된 균주로부터 시작하는 텍스트 프로토콜에 따라 A TF 함유 균주와 A TF 결핍 균주를 각각 YPD 배지에 스트리킹(streak out)합니다. 2일간 배양한 후, 5 mL의 YPD 액체 배지가 담긴 각각의 배양 튜브에 접종하고 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

0.25 millimolar beta estradiol 스톡 용액을 100% ethanol에서 최대 10,000배까지 10배 연속 희석합니다. 각 하룻밤 배양액 40 microliters를 10 milliliters의 YPD 액체 배지에 첨가합니다. 각 균주당 희석된 세포 96 microliters를 96 well plate의 18개 well에 첨가합니다.

그 다음 세포에 beta estradiol 4 µL를 첨가합니다. 중요한 점은 각 웰의 총 에탄올 양이 동일하도록 하는 것입니다. 각 균주당 세 개의 웰을 에탄올만 처리한 대조군으로 설정하여 3회 반복 실험을 수행하십시오.

대조군은 가스 투과성 막으로 96웰 플레이트를 덮습니다. 플레이트 리더기를 사용하여 600 nanometers의 광학 밀도에서 성장을 모니터링합니다. 최대 기울기를 찾는 방법 등 다양한 방법을 사용하여 성장률을 정량화합니다.

텍스트 프로토콜 PCR에 안내된 대로 플라스미드를 준비한 후, can MX 프로모터 카세트를 증폭하십시오. 리튬 아세테이트법을 사용하여 PCR 생성물을 A TF 발현 균주에 형질전환하고, 형질전환된 세포를 YPD 플레이트에 도말한 후 다음 날 YPD plus G 418 항생제 플레이트로 복제 도말하십시오. 마지막으로, 프로모터가 교체된 유전자의 내부 리버스 프라이머와 포워드 프라이머를 사용하여 프로모터가 적절하게 삽입되었는지 확인하십시오.

최종 PCR 산물은 약 1.2 KB이며, 여기에는 1 µM beta estradiol에 반응하여 시간에 따라 세 가지 서로 다른 a TF 프로모터 쌍인 Z four EV, Z three EV 또는 GEV에 의해 GFP가 유도되는 모습이 나타나 있습니다. 비효모 DNA 결합 도메인을 포함하는 ATF에 반응하여 GFP 생산이 증가함에 주목하십시오. 이는 이러한 인자들이 효모 게놈 내에서 단일 유전자 특이성을 확보한 결과일 수 있습니다.

GEV 유도만으로는 수백 개의 유전자가 활성화 또는 억제되지만, Z three EV와 Z four EV는 적절한 결합 부위를 포함하는 합성 프로모터 하단에 배치된 표적 유전자의 발현만을 활성화합니다. 여기서는 0 nM beta estradiol과 18시간 유도 후 1 µM beta estradiol에 반응하여 Z three EV에 의해 GFP가 유도되는 것을 보여줍니다. Z three EV 시스템의 정밀한 조절을 설명하기 위해 GFP가 결핍된 세포에서 또한 형광을 측정하였습니다. 다양한 beta estradiol 농도 범위에서 GFP를 유도하는 Z three EV의 능력이 여기에 제시되어 있습니다.

분포의 평균 형광 값은 유도제 농도와 발현 출력 사이의 관계가 힐 계수(hill coefficient) 약 1의 점진적 반응을 보임을 나타내며, 이는 Z three EV의 독립적인 결합을 의미합니다. 이 절차 이후, 단일 유전자의 발현 변화가 게놈 전체의 유전자 발현 패턴에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 유전자 발현 마이크로어레이와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인공 전사 인자를 설계, 테스트하고 그 효능을 검증하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 인공 전사 인자들은 적절한 DNA 표적 서열 하위에 위치한 유전자들의 발현을 조건부로 제어합니다.