빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

이 절차의 전반적인 목표는 원하는 특이성을 가진 유전적으로 인코딩된 유도 가능한 인공 전사 인자 또는 ATF를 생성, 테스트 및 검증하는 것입니다. 이는 먼저 A DNA 결합 도메인 PCR 산물을 포함하면 인간 에스트로겐 수용체 및 VP 16과 프레임 내 융합이 발생하는 간단한 효모 형질전환을 통해 A TF를 생성함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 플라스미드 PMN 8의 결합 부위를 TF 표적화 염기서열로 대체하여 A TF에 대한 GFP 리포터 플라스미드를 생성하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 GFP 리포터를 활성화하고 성장률을 측정하여 효모 생리학에 미치는 영향을 평가하는 ATF의 능력을 분석하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 검증된 TF를 사용하여 네이티브 게놈 표적을 조건부로 발현하는 것입니다. 궁극적으로, 관심있는 모든 표적 유전자는 조건부로 활성화될 수 있습니다.

유전자 발현의 갈락토오스 매개 유도와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 다발성 효과 없이 다양한 영양소 및 생리학적 조건에서 선택적 유도를 달성할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 원하는 유전자 산물의 빠르고 가역적인 도입을 통해 효모 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 기능의 획득 및 손실에 대한 연구를 가능하게 합니다. 먼저 PCR은 고충실도 중합효소를 사용하여 관심 있는 DNA 결합 도메인 또는 DVD를 증폭합니다.

1마이크로그램 이상의 정제된 PCR 산물을 리튬 아세테이트 방법을 사용하여 효모로 변형시킵니다. 형질전환 후 마이크로 원심분리기에서 15초 동안 최고 속도로 세포를 회전시키고 형질전환 혼합물을 제거한 다음 효모 추출물에 도금하기 전에 약 200마이크로리터의 멸균수에 세포를 재현탁합니다. 펩토 포도당 또는 YPD 매체 다음날 YPD의 복제 플레이트를 5 개의 플루오로 에로틱 산 플레이트에 놓습니다.

2-4일 동안 성장한 후 최소 5-10개의 집락을 YPD에 다시 심습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜 및 염기서열의 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하여 함유를 확인합니다. 원하는 결합 영역 올리고를 등몰 농도로 희석합니다.

T4개의 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 결합 영역을 인산화한 다음 텍스트 프로토콜의 반응 조건에 따라 neo thermocycler를 사용합니다. 다음으로, 약 1-2마이크로그램의 PMN 8을 HF와 xb가 1개 없이 소화합니다. 섭씨 37도의 젤에서 1시간 동안 1개.

백본 밴드를 정제하고 정제된 백본을 마이크로리터당 10나노그램으로 희석합니다. 그런 다음 이중 가닥 인산화 결합 부위를 마이크로리터당 백본의 몰 농도의 5배로 희석합니다. T 4 DNA 리가아제를 사용하여 30분 동안 실온에서 소화된 골격에 결합 부위를 접합합니다.

50마이크로리터의 표준 화학적 적질성 EIA 대장균 세포에 결찰 반응의 절반을 추가하고 텍스트 프로토콜에 나열된 절차를 따라 형질전환을 수행합니다. 세포를 회수한 후 luria berti 또는 lb 당 100-200마이크로리터의 세포와 암피실린 플레이트를 추가하고 밤새 배양합니다. 다음 날, 대장균과 lb 및 암피실린 액체를 배양하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드 DNA를 수확합니다.

그런 다음 ligation colony에서 새로운 리포터 플라스미드를 염기서열적으로 확인합니다. 마지막으로 리튬 아세테이트 형질전환을 사용하여 새로운 리포터 플라스미드를 E 균주를 포함하는 A TF로 변환합니다. 시작하려면 우라실이 결핍된 5밀리리터의 합성 완전 배지에 하룻밤 동안 균주를 함유한 TF 플러스 리포터를 성장시킵니다.

9 250 밀리리터를 얻고, 플라스크를 흔들고, 25 밀리리터의 SC 마이너스 URA를 각각 첨가한다. 그런 다음 하룻밤 배양의 125 마이크로 리터에서 25 밀리 몰 베타 에스트라 디올 스톡의 10 배 연속 희석에서 2 개의 나머지 플라스크에 대한 7 개의 플라스크에 대한 텍스트 프로토콜에 나열된 베타 에스트라 디올의 다른 희석을 가진 플라스크 중 7 개를 준비하고, 구성적인 GFP 생성 균주 및 GFP가 결핍 된 균주를 접종합니다. 이는 유세포 분석기를 교정하는 데 필요합니다.

플라스크를 200RPM과 섭씨 30도에서 12-18시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 각 배양액을 500마이크로리터씩 제거하고 별도의 1.7ml einor 튜브에서 스핀다운합니다. 상층액을 흡인시킨 후, 펠릿화된 세포를 유세포 분석 버퍼로 한 번 헹구고, 동일한 완충액 1ml에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 1ml의 유세포 분석 버퍼를 nine falcon two에 추가합니다. 2 밀리리터와 같은 최종 부피에 대해 falcon 튜브를 포함하는 버퍼에 재현탁 세포를 추가합니다. 마지막으로 유세포 분석을 수행합니다.

전방 산란(forward scatter) 및 측면 산란(side scatter)을 사용하여 효모 세포를 식별합니다. 유속을 초당 약 3000셀로 설정합니다. 50 채널을 통해 GFP를 측정하고 냉동 주식의 텍스트 프로토콜에서와 같이 진행하여 A TF 함유 균주와 A TF 결핍 균주를 YPD에 모두 줄무늬 표시한 후 2일간의 성장 후 5ml의 YPD 액체를 포함하는 별도의 배양 튜브를 접종하고 각 균주를 섭씨 30도에서 밤새 성장시킵니다.

0.25 밀리몰 베타 에스트라디올 원액의 10배 연속 희석을 100%에탄올로 최대 10, 000개, 접어서 수행하십시오. 각 하룻밤 배양 40마이크로리터를 YPD 액체 10ml에 첨가합니다. 각 균주에 대해 96마이크로리터의 희석된 세포를 96웰 플레이트의 18웰에 추가합니다.

그런 다음 4마이크로리터의 베타 에스트라디올을 세포에 추가합니다. 요점은 각 우물에 동일한 양의 총 에탄올이 있는지 확인하는 것입니다. 각 균주에 대해 3개의 웰이 에탄올만 있는 상태에서 3회를 수행합니다.

제어 장치는 가스 투과성 멤브레인의 96웰 플레이트를 덮습니다. 플레이트 리더에서 600나노미터의 광학 밀도로 성장을 모니터링합니다. 최대 기울기 찾기와 같은 여러 방법을 사용하여 성장률을 정량화합니다.

텍스트 프로토콜 PCR의 지시에 따라 플라스미드를 준비한 후 can MX promoter cassette를 증폭합니다. 다음날 리튬 아세테이트 방법 플레이트를 사용하여 PCR 산물을 A TF 발현 균주로 변환하고, 세포를 YPD로, 복제 플레이트를 YPD와 G four 18 항생제로 변환합니다. 마지막으로, promoter가 교체된 유전자 내부에 forward primer와 reverse primer를 사용하여 promoter의 적절한 삽입을 확인합니다.

최종 PCR 산물은 약 1.2 KB이며, 여기에 도시된 것은 1개의 마이크로몰 베타 에스트라디올에 대한 반응으로 시간이 지남에 따라 3개의 서로 다른 TF 프로모터 쌍 Z, 4개의 EVZ, 3개의 EV 또는 GEV에 의한 GFP의 유도입니다. 비 효모 DNA 결합 도메인을 포함하는 ATF에 대한 반응으로 GFP 생산이 증가하는 것을 주목하십시오. 이는 효모 게놈에서 단일 유전자 특이성을 달성하는 이러한 요인으로 인해 발생할 수 있습니다.

GEV 유도는 단독으로 수백 개의 유전자를 활성화하거나 억제하는 반면, Z 3 EV 및 Z 4 EV는 적절한 결합 부위를 포함하는 합성 프로모터의 다운스트림에 배치된 표적 유전자의 발현만 활성화합니다. 여기서, 제로 나노몰 베타 에스트라디올에 대한 반응으로 Z 3 EV에 의한 GFP의 유도 및 18시간 유도 후 1개의 마이크로몰 베타 에스트라디올이 Z 3 EV 시스템의 엄격한 조절을 설명하기 위해 GFP가 결핍된 세포에서 형광도 측정되었습니다. 베타 에스트라디올 농도 범위에서 GFP를 유도하는 Z three EV의 능력이 여기에 나와 있습니다.

분포의 평균 형광은 유도 물질 농도와 발현 출력 사이의 관계가 Z 3 EV의 독립적 인 결합을 나타내는 약 1의 언덕 계수로 등급이 매겨진다는 것을 보여줍니다.이 절차에 따라 유전자 발현 마이크로 어레이와 같은 다른 방법을 수행하여 단일 유전자의 발현을 변경하는 것이 유전자 발현의 게놈 와인 패턴에 미치는 영향과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인공 전사 인자의 효능을 엔지니어링, 테스트 및 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이러한 인공 전사 인자는 적절한 DNA 표적 염기서열의 하류에 배치된 유전자의 발현을 조건부로 제어합니다.