수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리
2015년 1월 16일
이 원고는 변형된 침전 기법을 사용하여 인간의 소변에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 소변에서 엑소좀을 분리하기 위한 빠르고 확장 가능하며 효과적인 대안을 제공하는 변형된 엑소좀 침전 방법을 설계하는 것입니다. 이는 먼저 원심분리를 통해 소변 샘플에서 큰 사체와 세포 파편을 제거하고, 요로 엑소좀이 포함된 스내트를 새 튜브로 옮겨 놓음으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 TAM 홀스 단백질을 제거하기 위해 DTT를 포함하는 분리 용액에 펠렛을 용해시킵니다.
그런 다음 추가 원심분리 후, TP free 상등액을 엑소 퀵 TC 시약으로 밤새 배양하여 다음날 엑소좀을 침전시킵니다. 엑소마 퀵 TC 시약으로 처리된 시료를 마지막으로 한 번 원심분리하여 엑소좀 펠릿을 얻습니다. 궁극적으로 웨스턴 블롯(Western blot) 및 실시간 QPCR과 같은 다운스트림 프로세스를 엑소좀에서 수행하여 관심 바이오마커를 식별할 수 있습니다.
초중집중화 여과 및 침전과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 arm 방법이 울트라 인증 단계가 필요하지 않고 비교적 빠르게 수행하기 쉬우면서도 소변 채취 전에 후속 분자 분석을 위해 상대적으로 순수한 높은 엑소좀 수율을 제공한다는 것입니다. 3.125 밀리리터의 갓 준비된 프로테아제 억제제 칵테일을 빈 멸균 용기에 넣은 다음 약 10 밀리리터의 첫 번째 공뇨를 용기에 모으십시오. 샘플을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
24시간 채취한 소변 샘플은 섭씨 4도에서 보관하여 엑소좀 분리에도 사용할 수 있습니다. 17, 000GS, 섭씨 37도에서 10분 동안 튜브를 돌려 요로 엑소좀에서 세포 파편을 제거하거나 분리합니다. 다음으로, 펠릿을 방해하지 않도록주의하면서 상등액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 500 마이크로 리터의 분리 용액에 다시 현탁시킵니다.
펠릿을 섭씨 37도에서 밀리리터당 200mg의 최종 농도로 10분 동안 DTT로 배양합니다. 2분마다 샘플을 볼텍싱합니다. 그런 다음 펠릿이 완전히 용해되면 샘플에 500마이크로리터의 분리 용액을 추가하고 생성된 현탁액을 즉시 스핀다운합니다.
상층액을 이전에 수집된 상등액과 합치고 새 펠릿을 50마이크로리터의 분리 용액에 재현탁탁합니다. 엑소좀을 분리하기 위한 SDS 페이지 분석의 경우, 먼저 11ml의 통합 상등액을 3.3ml의 exo quick TC 시약과 함께 섭씨 4도에서 최소 12시간 동안 배양합니다. 배양 후 시료를 원심분리한 다음 SDS 페이지 분석을 위해 상등액을 새 튜브로 옮기고 요로 엑소좀이 포함된 펠렛을 사용하여 D-N-A-R-N-A 또는 단백질을 추출하거나 영하 80도에서 보관합니다.
NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 여기에서 2마이크로리터의 샘플로 260 및 280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 각 추출의 DNA 및 RNA 농도를 측정합니다. 처리되지 않은 소변이 있는 레인에서 서양 혈액 분석을 사용한 SDS 페이지 분석 및 바이오마커 검출의 변형된 재현이 표시되었으며, 90-100킬로달톤에 해당하는 첫 번째 요로 펠렛 단백질 금지가 관찰되었으며, 이는 최종 상층액 및 엑소좀 펠릿 레인에서 각각 TAM 홀스 단백질의 존재 및 제거를 나타냅니다. TAM horse fall protein band는 관찰되지 않았는데, 이는 초기 단계에서 TAM horse fall protein이 제거되어 엑소좀 펠릿 수율이 증가했음을 나타냅니다.
이 실험에서는 소량의 시료를 사용한 경우에도 바이오마커 Alex 및 TSG 1 0 1이 검출되었으며, 이는 바이오마커 분석을 위한 매우 순수한 엑소좀 펠릿과 개발 후 TAM horse fall 단백질을 포함한 풍부한 용해성 단백질의 부재를 나타냅니다. 이 기술은 만성 신장 질환 분야의 연구자들이 당뇨병성 신병증의 조기 발견 및 진단을 위해 소변 분리 엑소좀을 사용할 수 있는 길을 열었습니다.
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개요
본 원고는 변형된 침전 기술을 이용하여 사람의 소변에서 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 엑소좀 분리를 위한 빠르고 확장 가능하며 효과적인 대안을 제공하는 것을 목적으로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 엑소좀 연구
배경
- 엑소좀은 세포 간 통신에 관여하는 작은 세포 외 소포입니다.
- 소변에서 엑소좀을 분리하면 다양한 생물학적 과정에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다.
- 현재의 방법들은 시간이 많이 소요되고 효율성이 낮을 수 있습니다.
- 변형된 침전 기술을 통해 엑소좀 회수율을 높일 수 있습니다.
연구 목적
- 소변에서 엑소좀을 신속하게 분리하는 방법을 개발하기 위함입니다.
- 엑소좀 추출의 확장성과 효율성을 개선하기 위함입니다.
- 바이오마커 식별과 같은 후속 응용 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 원심분리를 통해 소변 샘플에서 거대 세포와 잔해물을 제거합니다.
- DTT가 포함된 분리 용액에 펠렛을 용해합니다.
- 상층액을 exo quick TC 시약과 함께 하룻밤 동안 배양합니다.
- 최종 원심분리를 통해 엑소좀 펠렛을 얻습니다.
주요 결과
- 수정된 방법을 통해 소변에서 엑소좀을 성공적으로 분리합니다.
- 분리된 엑소좀은 Western blot 및 qPCR과 같은 하위 분석에 사용할 수 있습니다.
- 오염 물질을 효율적으로 제거하여 분리된 엑소좀의 순도를 높입니다.
- 본 프로토콜은 더 큰 샘플 크기에 맞게 확장 가능합니다.
결론
- 수정된 침전 기법은 엑소좀 분리에 유용한 방법입니다.
- 이 접근 방식은 다양한 생물학적 연구에서 엑소좀 연구를 효율화할 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 분리된 엑소좀의 추가적인 응용 분야를 탐색할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
요소 외소체(exosomes)를 분리하면 신장 질환에 대한 비침습적 바이오마커 발굴이 가능해지며, 이는 신장 치료제 개발 과정에서 조기 진단과 기전적 위험 완화를 지원합니다. 변형된 침전법은 초원심분리를 대체하여 확장 가능하고 수율이 높은 대안을 제공하며, 표적 검증 워크플로우의 재현성과 처리량을 향상시킵니다. 이러한 접근 방식은 오염을 줄이고 하위 분자 프로파일링을 위한 외소체 순도를 높임으로써 바이오마커 식별의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 네프론 분절에서 세포 유형별 화물을 반영하는 엑소좀을 분리함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 초원심분리 없이 엑소좀을 분리할 수 있는 신속하고 확장 가능한 방법을 제공하여 기술적 변동성을 줄여줍니다.
- 예측적 가치: 프로파일링을 위해 miRNA 및 mRNA가 농축된 고순도 엑소좀 펠렛을 생성함으로써 바이오마커 검출의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: Western blot 및 qPCR과 같은 하위 분석에서 질병 관련 바이오마커를 검출하기 위해 검증된 엑소좀 샘플을 준비합니다.
- 운영적 가치: 고처리량 샘플 처리에 적합한 침전 기반 워크플로를 통해 엑소좀 분리를 표준화합니다.
- 분석 준비도: RNA 추출 및 단백질 분석에 적합한 일관된 엑소좀 수율을 생성하여 재현 가능한 바이오마커 스크리닝을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 질환 관련 엑소좀 화물을 제공함으로써 소변 내 바이오마커 발굴부터 전임상 검증까지의 진행을 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 신장 기능 장애 시 변화된 엑소좀 함량을 검출할 수 있게 하여 병태생리학적 경로를 명확히 합니다.
- 예측 신뢰도: 엑소좀 바이오마커를 당뇨병성 신증의 조기 징후와 연결함으로써 리스크가 조정된 추진 결정을 용이하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 가설 검증부터 리드 물질 발굴에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 타겟 선정 및 전임상 연속성에 정보를 제공하는 비침습적 바이오마커 분리를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 요로 세포의 세포 기원 특이적 화물을 반영하는 엑소좀을 분리하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 바이오마커 분석법 개발 및 화합물 스크리닝에 적합한 재현 가능하고 정량적인 엑소좀 결과물을 제공합니다.
- 분석: qPCR 및 Western blot을 통해 엑소좀 관련 RNA 및 단백질 수치를 측정하여 조건별 비교 분석을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 질환 관련 화물 검출을 통해 요로 엑소좀 바이오마커를 신장 질환의 전임상 모델과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 소변 샘플 유형 및 연구 프로그램에 적용 가능한 확장 가능하고 표준화된 분리 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 바이오마커 프로파일링을 위한 순수 엑소좀 분리를 통해 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증을 강화합니다.
- 운용적 가치: 초원심분리 단계를 제거하고 워크플로우를 단순화하여 표준화 및 확장성을 개선합니다.
- 전략적 가치: 신장 질환의 조기 바이오마커 검출에 대한 신뢰도를 높여 보다 정확한 go/no-go 결정을 지원합니다.
- 포트폴리오 영향: 강력한 엑소좀 바이오마커 데이터를 기반으로 신장 치료제 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 선정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 엑소좀 생물학 및 RNA 추출, qPCR과 같은 분자 생물학적 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 원심분리기, ExoQuick TC 시약 및 RNA/DNA 정량을 위한 분광광도계 도구의 사용이 가능해야 합니다.
- 일관된 배양 시간, 온도 및 시약 취급을 보장하기 위해 팀 간의 표준화가 필요합니다.
- 본 방법을 서로 다른 소변 수집 프로토콜이나 저장 조건에 적용할 때 적절한 조정 고려 사항이 필요합니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 하룻밤 동안의 배양이 필요하며, 전송 과정 중 엑소좀 손실을 방지하기 위한 세심한 취급이 요구됩니다.
