Name: 마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 각막 신생 혈관화 연구를 위한 알칼리 화상 모델을 통해 항혈관신생 요법의 효과를 관찰하는 방법입니다. 이 기법은 각막 실명 치료를 위한 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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우리는 원고를 준비 박사 Xinyu의 리튬의 도움에 감사합니다. SW는 튤 레인 대학, UT 사우스 웨스턴 의료 센터, NIH 그랜트 EY021862, 실명 재단을 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 포상에서 대통령의 연구위원회의 새로운 탐정 수상, 및 연령 관련 황반 변성 연구에 밝은 초점 수상에서 시작 기금에 의해 지원되었다 .

참고 : 다음 프로토콜과 대표적인 결과는 예를 들어 화합물로 HDAC 억제제 SAHA를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 SAHA의 사용에 한정되는 것은 아니다, 각막 신생 혈관에 수용성 화합물의 효과를 테스트하는 일반적인 방법으로서 추천된다. 약간의 수정은 희석의 정도뿐만 아니라 주파수와 응용 프로그램의 기간 동안 할 필요가있을 것이다. 또한, 물에 쉽게 용해되는 화합물은 DMSO의 부재로 투여 될 수있을 것입니다. 윤리 정책 : 모든 동물 실험은 국가의 법률과 제도 규정에 따라 수행되어야한다. 이 프로토콜은 툴레 인 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었다. 1. (사용 순으로) 재료의 제조 <ol><li> 2mm 원에 셀룰로오스 종이 필터 (11 μM)의 조각을 잘라. </li><li> 로 NaOH를 1 M 용액을 준비500 ㎖의 증류수 H 2 O.에서의 NaOH 20g을 용해 상온에서 보관. 주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 알칼리 화상을 입을 수 있습니다. </li><li> 최종 20 ㎎ / ㎖ 마취제의 농도와 4 ㎎ / ㎖ 자일 라진에 1X PBS의 37.5 ㎖에 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진의 10 ~ 100 ㎎ / ㎖ 케타민 ㎖ 및 2.5 ㎖에 희석하여 마취 칵테일을 준비합니다. </li><li> 여과 PBS 100 ㎖의 proparacaine 염산염 500mg을 용해하여 (국소 마취를 위해) proparacaine 염산염의 0.5 % 용액을 준비한다. </li><li> 8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g 나 2 HPO 4 및 증류 H 2 O. 900 ml 중의 NaH 2 PO 4 0.23 g을 용해하여 1X PBS를 준비 7.4 pH로 조정합니다. 멸균을 위해 증류수 H 2 O 필터 및 1000 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다. </li><li> DMSO의 1 ml의 SAHA의 26.4 mg의 용해하여 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 ~ 100 ㎜에서 SAHA의 1,000 X 스톡 용액을 준비한다. 1X로 희석 (~ 10 μM)각 사용에 대한 필터링 된 PBS 용액. 최대 한 달 동안 -20 ° C에서 원액을 저장합니다. 주의 : DMSO 알려진 독소와 돌연변이입니다. </li><li> 고정 용 파라 포름 알데히드 (PFA)의 4 % 용액을 준비합니다. 화학 후드, PBS 90 ㎖에 PFA 4 g을 용해. 65 ° C에 혼합물을 가지고, 7.4의 pH를 적정한다. PFA가 용해되면, 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다. 최대 한 달 동안 4 ° C에 보관하십시오. 주의 : PFA는, 극성 발암 성, 독성 것으로 알려져. </li><li> PBS의 94.5 ㎖에 염소 혈청 5 ㎖ 및 트리톤 X-100의 500 UL를 희석하여 1X 차단 버퍼를 준비합니다. </li><li> PBS의 99.5 ㎖의 트리톤 (Triton) X-100의 500 UL를 희석하여 1X 세척 버퍼를 준비합니다. </li></ol> 2. 상해 및 화합물 처리에게 알칼리 굽기 <ol><li> 1 M의 NaOH 용액에, 직경 여과지의 원형 조각, 1 ~ 2 밀리미터를 적시십시오. </li><li> 뭐, 100 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine)과 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진 주사로 마우스를 마취무형 문화 유산은 ~ 25g 마우스 당 1.3 단계에서 마취 칵테일의 100 μL이다. 마취는 마취는 응답이 없어야합니다 충분한 지, 부드럽게 동물의 발가락이나 꼬리를 곤란에 의해 결정될 수있다 ~ 마취의 깊이 안으로 설정 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다. 참고 : 관리는 마우스가 마취 유도 저체온증에 굴복하지 않도록주의해야한다. </li><li> 스포이드를 사용하여 국소 지방 진통제 위해 각막 표면에 0.5 % proparacaine 염산염의 저하를 적용한다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여, NaOH를 적신 여과지의 조각을 선택합니다. 당신이 초과 된 NaOH에 집착하거나 여과지에서 떨어지는 통지하는 경우, 간단히 과잉을 흡수하는 필터 종이의 건조 조각에 적신 종이 필터를 누릅니다. 중심 각막에 NAOH 적신 여과지의 조각을 놓습니다. 지역에서 ~ 2 × 2mm 2의 급성 알칼리 화상을 생성하기 위해 30 초를 남겨주세요. 수술 현미경 제대로 종이 필터를 배치에 도움이됩니다. 참고 : 마우스의의 하나의 눈을해야할 것은 다른 컨트롤로 봉사와 부상을 입을 수. </li><li> 필터 용지를 제거합니다. 10 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 잔여 1 M NaOH를 씻어 두 번 1X PBS 10 mL로 눈을 세척하십시오. </li><li> 즉시 1X SAHA 작업 용액 (또는 PBS로 구성된 차량 제어가 더 SAHA를 포함하지 DMSO를 희석) 국소 적 각막에 한 방울을 적용합니다. 14 일 동안 프로그램 3x/day를 반복합니다. 참고 : 부상의 개발과 화합물의 전달을 방해 할 수 있으므로이 기간 동안 국소 항생제 연고는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 액체 항생제 용액과 같은 3 % 겐타 마이신 용액을 대신 사용합니다. </li><li> 임상 평가 (아래 프로토콜 3)로 직접 이동하거나 마우스를 희생 (아래 프로토콜 4) 또는 기존의 파라핀 / 냉동 조직 검사 각막 평면 마운트의 눈을 명백히하다. </li></ol> 3. 임상 평가 <ol><li> 수술 현미경으로 눈을 멀게 방식으로 마우스의 일일 검사를 수행하고 C 점수orneal NV는 각막 혼탁, NV, 및 선박의​​ 크기에 따라. 적어도 두 관찰자를 사용하고이 평균이다 최종 점수를 기록한다. <ol><li> 0-4의 규모에 각막 혼탁 점수. 0 = 완전 지우기; 1 = 약간 불투명, 홍채와 동공을 쉽게 볼 수; 2 = 약간 불투명, 홍채와 동공 여전히 감지; 거의 감지 3 = 불투명, 학생; 동공없이 볼 수있는 완전히 불투명 4 =. </li><li> 0-3의 규모에 NV 점수. 0 = neovessels; 각막 윤부에서 1 = neovessels; 각막 윤부에 걸쳐 각막 중심 접근 2 = neovessels; 각막 중심에 걸친 3 = neovessels. </li><li> 0-3의 규모에 선박의 크기를 점수. 0 = neovessels; 수술 현미경으로 검출 1 = neovessels; 쉽게 수술 현미경으로 본 2 = neovessels; 쉽게 현미경없이 볼 3 = neovessels. </li></ol></li><li> 디지털 카메라를 사용하여, 7 일, 14 일에 눈을 대표하는 이미지를 가지고. </li></ol> 4.각막 염색 및 평면 마운트 <ol><li> 4 ℃에서 최소 1 시간 동안 4 % PFA의 탈핵 눈 수정 </li><li> PBS를 1 배에서주의 깊게 초과 조직을 제거하는 집게를 사용하여 눈을 전송합니다. </li><li> 수술 현미경의 도움으로 (이 눈에서 유체를 해제해야합니다주의) 눈의 pericorneal 지역을 관통하는 바늘 (18 게이지) 또는 마이크로 칼을 사용합니다. <ol><li> 4.3.1에서 만든 천공의 뒤 부분에서 눈 (각막)의 앞쪽 부분을 절단하는 수술 가위를 사용합니다. </li></ol></li><li> 4 ℃에서 하룻밤 고정에 다시 4 % PFA로 각막을 전송 </li><li> (: PFA는 위험 및 기관 규정에 따라서 처리 할 것주의)와 잔여 PFA를 제거하는 1X PBS로 각막을 세 번 씻어 4 % PFA를 폐기하십시오. </li><li> 조직을 투과하고 차 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 실온에서 적어도 2 시간 동안 1X 블로킹 완충액 부화. <ol><li> 100 ~ 500 배 희석시, 1X 차단 버퍼에 차 항체를 적용합니다. 1:100에서 혈관을 검출하기위한 (예를 들어 쥐의 항 - 마우스-PECAM-1, 토끼 항 - 마우스 LYVE-1 식세포를 검출 1:500에서 림프관을 검출 및 / 또는 래트 anti-mouse-F4/80위한 1:100에서). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 완전히 언 바운드 일차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간 동안 1X 세척 버퍼마다 여섯 번 씻으십시오. </li><li> 1X는 500 ~ 1,000 배 희석에 버퍼를 차단에 차 항체를 적용합니다. (예를 들어, 488 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 쥐 IgG의 태그 또는 594 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 토끼 IgG의 태그). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 완전히 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간마다 1X PBS로 3 회 세척한다. </li></ol></li><li> 신선한 1X PBS로 각막을 전송하고, 수술 현미경의 도움으로 조심스럽게 %를 향해 주변에서 4 절개을어. 이 (결과 모양이 아니라 나비처럼한다) 약 동일한 크기의 네 개의 사분면으로 각막을 나누어 슬라이드에 평평하게 거짓말을 할 수 있도록해야합니다. </li><li> 형광 이미징을위한 설치 매체 적절한으로 마운트합니다. 최상의 결과를 위해, 샘플은 즉시 군데해야하며, 디지털 사진 촬영,하지만 4 ℃에서 빛으로부터 보호 몇 주 동안 저장 될 수있다 </li></ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment.</a> Br. J. Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2010).</li>
<li>Whitcher, J., Srinivasan, M., Upadhyay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Blindness%3A+A+Global+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Org%22%5BJournal%5D)">Corneal Blindness: A Global Perspective.</a> Bull. World Health Org. 79 (3), 214-221 (2003).</li>
<li>Gupta, D., Illingworth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatments+for+corneal+neovascularization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Treatments for corneal neovascularization: a review.</a> Cornea. 30 (8), 927-938 (2011).</li>
<li>Cursiefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement+on+indications+for+anti-angiogenic+therapy+in+the+management+of+corneal+diseases+associated+with+neovascularisation%3A+outcome+of+an+expert+roundtable%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Consensus statement on indications for anti-angiogenic therapy in the management of corneal diseases associated with neovascularisation: outcome of an expert roundtable.</a> Br. J. Ophthalmol. 96 (1), 3-9 (2012).</li>
<li>Delmonte, D., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+Physiology+of+the+Cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cataract+Refract.+Surg%22%5BJournal%5D)">Anatomy and Physiology of the Cornea.</a> J. Cataract Refract. Surg. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Cursiefen, C., Seitz, B., Dana, M. R., Streilein, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+lymphangiogenesis+in+the+cornea.+Pathogenesis%2C+clinical+implications+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Der+Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea. Pathogenesis, clinical implications and treatment options.</a> Der Ophthalmologe. 100 (4), 292-229 (2003).</li>
<li>Chang, J., Gabison, E., Kato, T., Azar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal Neovascularization.</a> Curr. Opin Ophthalmol. 12 (4), 242-249 (2001).</li>
<li>Ambati, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Avascularity+is+due+to+Soluble+VEGF+Receptor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corneal Avascularity is due to Soluble VEGF Receptor-1.</a> Nature. 443 (7114), 993-997 (2006).</li>
<li>Cursiefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+Stimulates+Lymphangiogenesis+and+Hemangiogenesis+in+Inflammatory+Neovascularization+via+Macrophage+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">VEGF-A Stimulates Lymphangiogenesis and Hemangiogenesis in Inflammatory Neovascularization via Macrophage Recruitment.</a> J. Clin. Invest. 113 (7), 1040-1050 (2004).</li>
<li>Jiri, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper+Strips+and+Rings+as+Simple+Tools+for+Standardization+of+Experimental+Eye+Injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthal.+Res%22%5BJournal%5D)">Paper Strips and Rings as Simple Tools for Standardization of Experimental Eye Injuries.</a> Ophthal. Res. 1975 (7), 363-367 (2009).</li>
<li>Ormerod, L., Abelson, M., Kenyon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Models+of+Corneal+Injury+Using+Alkali-Immersed+Filter+Discs+Invest%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Standard Models of Corneal Injury Using Alkali-Immersed Filter Discs Invest.</a> Ophthalmol. Vis. Sci. 30 (10), 2148-2153 (1989).</li>
<li>Saika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+adenoviral+gene+transfer+of+bone+morphogenic+protein-7+on+a+corneal+alkali+injury+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of adenoviral gene transfer of bone morphogenic protein-7 on a corneal alkali injury model in mice.</a> Lab. Invest. 85 (4), 474-486 (2005).</li>
<li>Ferrari, G., Bignami, F., Giacomini, C., Franchini, S., Rama, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+topical+infliximab+in+a+mouse+model+of+ocular+surface+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of topical infliximab in a mouse model of ocular surface scarring.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (3), 1680-1688 (2013).</li>
<li>Sosne, G., Christopherson, P., Barrett, R., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymosin-beta4+modulates+corneal+matrix+metalloproteinase+levels+and+polymorphonuclear+cell+infiltration+after+alkali+injury.Invest%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thymosin-beta4 modulates corneal matrix metalloproteinase levels and polymorphonuclear cell infiltration after alkali injury.Invest.</a> Ophthalmol. Vis. Sci. 46 (7), 2388-2395 (2005).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Multiple+Pathogenic+Pathways+by+Histone+Deacetylase+Inhibitor+SAHA+in+a+Corneal+Alkali-Burn+Injury+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Multiple Pathogenic Pathways by Histone Deacetylase Inhibitor SAHA in a Corneal Alkali-Burn Injury Model.</a> Mol. Pharm. 10 (1), 307-318 (2013).</li>
<li>Yoeruek, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety%2C+penetration+and+efficacy+of+topically+applied+bevacizumab%3A+evaluation+of+eyedrops+in+corneal+neovascularization+after+chemical+burn%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Safety, penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn.</a> Acta Ophthalmol. 86 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Bucher, F., Parthasarathy, A., Bergua, A., Onderka, J., Regenfuß, B., Cursiefen, C., Bock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+Ranibizumab+inhibits+inflammatory+corneal+hem-+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Topical Ranibizumab inhibits inflammatory corneal hem- and lymphangiogenesis.</a> Acta Ophthalmol. , (2012).</li>
<li>Hajrasouliha, A., Sadrai, Z., Chauhan, S., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b-FGF+induces+corneal+blood+and+lymphatic+vessel+growth+in+a+spatially+distinct+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">b-FGF induces corneal blood and lymphatic vessel growth in a spatially distinct pattern.</a> Cornea. 31 (7), 804-809 (2012).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+albino+mutation+of+tyrosinase+alters+ocular+angiogenic+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The albino mutation of tyrosinase alters ocular angiogenic responsiveness.</a> Angiogenesis. 16 (3), 639-646 (2013).</li>
<li>Connor, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1565-1573 (2009).</li>
</ol>

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여기에 제시된 프로토콜은 이러한 세 가지 (상호) 과정을 연구하는 이상적인 시스템 만들기, hemangiogenesis, 림프관, 염증의 재현 수준의 결과. 이 방법은 중앙 각막 NV, 펠렛 (18)을 표현하는 성장 인자를 각막 (17), 즉 봉합 더 감독 NV을 유발하기 위해 개발하고 이식 된 여러 가지 방법을 생성하는 동안, 또한 관심이있을 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 또한 더 큰 포유 동물에 대한 아직 사용할 수없는 분자 및 유전자 변형 기술의 호스트를 최대한 활용하기 위해 실험실을 허용하면서 동물 모델을 사용하기 쉽게 제공하는 성인 마우스에 사용하기 위해 설계되었습니다. 위의 프로토콜과 대표적인 결과 세부 C57BL/6J 배경에 마우스의 사용. 흰둥이 쥐도 적합 할 것이다 쉽게 영상을 제공 할 수있다; 그러나, 최근의 연구는 흰둥이 쥐의 신생 혈관 응답이 19 드라마틱하지 않을 수 있음을 나타냅니다. 또한, 여러 달리다른 신생 혈관 모델은 각막 NV는 수술 ...

각막 실명 모든 경우 (1)의 약 4 %에 대한 책임이 실명의 네 번째 가장 흔한 원인이다. 각막 신생 혈관 (NV)가 포진 각막염 (웨스트에서 실명의 주요 감염 원인)와 트라코마 (전세계 전염성 실명의 주요 원인) 2를 포함하여 이러한 병리의 많은에 중요한 역할을한다. 현재 치료는 스테로이드, 비 스테로이드 성 항 염증성 약물 (NSAIDs), 항 VEGF 치료, 및뿐만 아니라 기존의 또는 레이저 수술 기법 3 시클로 스포린 (가) 있습니다. 그러나 각막 NV 기반 병리의 심한 쇠약 자연, 수술 각막 NV 치료를 할 수있는 시설, 강력하게 수행하는 약리 옵션의 부족의 소수는, 현존하는 치료에도 불구하고, 기본적인 의료 필요를 그 결론을 내릴 수있는 최근의 전문가 원탁 회의를 주도 이러한 병리 제시는 4 충족 남아있다. 인간의 각막5 층, 3 층 세포 (상피, 각막 내피 세포)와 2 인터페이스 (보우만 막과 데스 메 막)으로 구성되어 있습니다. 그것은 눈을위한 기계적인 장벽과 굴절 표면으로 작동합니다. 그것의 투명한 자연의 구성 요소의 미묘한 균형의 결과이며 적절한 기능 5에 필수적이다. 일반적으로 무 혈관, 각막은 섬모와 안과 동맥에서 공급되는 바깥 쪽 가장자리를 따라 실행 미세 혈관에서 혈액을 받는다. 자극이 그들을 각막의 중심을 향해 성장하고, 따라서 비전 6을 제한 할 수 있도록 이러한 혈관의 혈관 신생을 촉진 할 때 각막 NV가 발생합니다. 각막 신생 혈관이 각막의 중심을 향해 윤부 혈관 아케이드에서 혈관과 림프 혈관의 증식을 초래할하는 hemangiogenesis과 림프관을 포함한다. 이것은 각막 &quot;혈관 특권&quot;, 각막 혼탁 및 섬유증의 증가, 각막 라의 중단의 고장에 이르게yers를, 부종 7. 각막 NV의 정확한 트리거는 기존의 의약품, 산업용 화학 물질, 또는 화학 요원 전쟁의 원인이 전염성 질병에 대한 응답에서 이러한 결막염과 같​​은 화학적으로 유도 된 상태에 이르기까지, 수많은 있습니다. 이 과정의 분자 메커니즘은 아직 완전히 특징으로하지 않습니다; 그러나, 몇 가지 주요 선수가 확인되었습니다. 정상적인 조건에서 각막 (예 : 수용성 VEGF-R1과 같은) 항 혈관 신생 인자 (8)의 중복 배열에 의해 유지되는 고유 한 &#39;혈관 신생 특권&#39;을 가지고 있습니다. 그러나, (예컨대 부상 등) 외부 자극에 응답하여, 친 혈관 생성 인자 (예를 들어 VEGF-A)의 로컬 상향 조절이있을 것이다. 이 팁 각막의 혈관 신생 권한을 기초, 따라서 각막 병리, 심지어 실명 9 일으키는 hemangiogenesis, lymphangeogenesis, 염증에 이르게 프로 및 항 혈관 신생 인자의 균형. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content는&quot;&gt;이 매우 쇠약 병리의 충족 의료 필요 감안할 때, 그것은 각막 NV의 신뢰할 수있는 동물 모델을 가지고 현장에 관심입니다. 제어 알칼리 화상을 입지 : 여기에서 우리는 같은 모델을 제시한다. 필터 종이 반지를 사용하여 기반의 다양한 눈 부상 모델은 1970 년대 10 년부터 사용되어왔다. 1989 년에, 하버드 의과 대학의 안과의 그룹은 수산화 나트륨 (NaOH를) 원형 필터 종이를 담글 및 특정 범위의 각막에 적용을 기반으로 토끼 각막 알칼리 화상 손상의 표준 모델을 특성화 농도 11. 그 이후로,이 기술은 마우스 12-14에서 사용하기 위해 적응되어있다. 최근, 왕 연구소는 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델 (15)를 사용하여 각막 NV의 병인에서 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제 SAHA의 치료 효과를 연구했다. 여기에 제시된 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델의 방법론은 내장 된주로 두 가지 다른 논문 (14, 16)의 사전 작업에.

<table><tbody><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18 G 바늘</td><td>BD</td><td>305918</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>BD</td><td>306575</td><td></td></tr><tr><td>25 G 바늘</td><td>BD</td><td>305916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (쥐 안티 마우스)</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA497RT</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LYVE-1 (토끼 안티 마우스)</td><td>Abcam</td><td>ab14917</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (쥐 안티 마우스)</td><td>BD</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 488 (염소 안티 마우스)</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IgG Alexa 594 (염소 안티 토끼)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Tucsen</td><td>TCC 5.0 ICE</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D4540-1L</td><td>주의: 돌연변이원, 독성</td></tr><tr><td>겸자(둔기), Iris</td><td>WPI</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>겸자(날카로움), Dumont #4</td><td>WPI</td><td>500340</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>케타민 용액</td><td>MedVet</td><td>RXKETAMINE</td><td>규제 물질, 사용에 적절한 라이선스 필요.</td></tr><tr><td>현미경용 광원</td><td>AmScope</td><td>LED-14M-YA</td><td></td></tr><tr><td>현미경(스테레오 7X-45X)</td><td>AmScope</td><td>SM-1B</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체, VECTASHIELD</td><td>벡터</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>주의: 부식성</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td></td><td>P6148-500G</td><td>주의: 알레르기성, 발암성, 독성</td></tr><tr><td>프로파라카인 염산염</td><td>시그마</td><td>P4554-1G</td><td></td></tr><tr><td>가위(5mm 블레이드), Vanas</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>MPBio</td><td>92939249</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 1등급 여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-6508</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 솔루션</td><td>MedVet</td><td>RXANASED-20</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

정상적인 조건 하에서, 각막은 무 혈관이며,이 투명도가 양호한 시력을 유지하는데 필수적이다. 외상, 각막 또는 감염성 질병에 의해 야기 될 수있는 각막의 혈관 신생 (NV)은 각막의 소위 &#39;혈관 신생 특권&#39;분해 심지어 실명을 초래할 수있는 다수의 카메라 병리 기초를 형성한다. 사용할 수있는 여러 가지 치료 방법이 있지만, 각막 신생 혈관 병변에 의해 제공되는 기본적인 의료 필요 충족 남아있다. 안전하고, 효과적이며 타겟 요법을 개발하기 위하여, 각막 NV 및 약리학 적 개입의 안정적인 모델이 요구된다. 여기서, 우리는 마우스에서 알칼리 화상을 입지 각막 혈관 신생 모델을 설명한다. 이 프로토콜은 각막, 또한 약리학 화합물을 투여하고, 그 결과의 시각화를 제어 알칼리 화상 손상의 애플리케이션에 대한 방법을 제공한다. 이 방법은 계장 증명할 수탈 각막 NV 및 기타 신생 혈관 질환에 개입 메커니즘 기회를 공부.

알칼리 화상 부상 후 각막 NV는 예측 가능한 시간에 의존하는 방식으로 발생합니다. 1 처리되지 않은 동물 (그림 1A)와 HDAC 억제제 SAHA (그림 1B로 치료 동물 사이에 신생 혈관 및 각막 혼탁 모두에서 뚜렷한 차이를 보여줍니다 그림 ) 7 일간 시점에서. 도 2a 및도 2b는 기본 PECAM-1과 LYVE-1 염색 및 보조 알렉사 플 루어 488 및 594 염색 (각각)로 치료를받지 않은 눈의 각막 평면 마운트를 보여 주는. 2C 및 2D는 매일 치료 눈에서 동일한 염색을 보여준다 HDAC 억제제 SAHA는 hemangiogenesis 및 림프관 모두에서 극적인 감소를 확인합니다. <p class="jove_conte...

각막의 혈관 신생 (NV)는 여러 시각 병리를 복잡하게 할 수 있습니다. 제어, 알칼리 화상을 입지 모델을 활용, 각막 NV의 정량화 수준은 신생 혈관 질환에 대한 잠재적 인 치료의 각막 NV 및 평가의 기계 론적 연구를 위해 생성 될 수있다.

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

본 실험의 전반적인 목표는 각막 신생혈관 마우스 모델에서 항혈관신생 치료의 효과를 관찰하는 것입니다. 이를 위해 1 M 수산화나트륨 용액을 마우스의 눈에 짧게 도포하여 조절된 수준의 각막 신생혈관 형성을 유도합니다. 두 번째 단계로, 항혈관신생 화합물을 매일 투여하여 손상된 각막으로 새로운 혈관이 성장하는 것을 억제합니다.다음으로, 마우스를 안락사시킨 후 손상된 안구를 적출하고 절개하여 면역 염색을 수행합니다. 신생혈관 형성 및 염증 수준을 정량화하기 위해, 임상적 관찰과 면역 염색 모두를 바탕으로 신생혈관 형성이 정량적으로 감소했음을 결과로 보여줍니다. 이 기술은 새로운 화합물 및 치료법을 테스트할 수 있는 재현 가능한 수준의 신생혈관 형성을 제공하므로, 각막 실명에 대한 새로운 치료법으로 그 활용 가능성이 확장됩니다.따라서 이 방법은 병리적 각막 신생혈관 형성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 일반적인 혈관 형성 및 염증 기전을 탐구하는 모델로 활용할 수 있습니다. 알칼리 화상 손상 준비를 위해 제 실험실에서 이 절차를 시연하겠습니다.직경 약 2 mm의 원형 여과지를 1 M 수산화나트륨 용액에 담가 적시는 것으로 시작합니다. 그런 다음 마우스에 케타민 100 mg/kg과 자일라진 5 mg/kg을 주사하여 마취시킵니다. 1~2분 후, 동물의 발가락이나 꼬리를 부드럽게 꼬집어 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이를 테스트합니다.스포이드를 사용하여 0.5% propane hydrochloride 한 방울을 안구의 각막 표면에 국소 도포하여 국소 마취를 실시하고, 생쥐를 수술용 현미경 아래에 둡니다. 다음으로, 멸균 핀셋을 사용하여 수산화나트륨(sodium hydroxide)에 적신 거름종이 조각을 집어 현미경으로 관찰하며 각막 중심부에 거름종이를 올립니다.약 2x2 mm² 크기의 급성 알칼리 화상을 유도하기 위해 30초 동안 그대로 둡니다. 마우스의 반대편 눈은 손상시키지 않으며, 이를 내부 대조군으로 사용합니다. 거름종이를 제거한 후, 주사기를 사용하여 10 mL의 1×PBS로 눈을 두 번 부드럽게 씻어내어 잔류 1 M 수산화나트륨을 제거합니다.세척 후, 즉시 1X Saha 작동액 한 방울을 각막에 국소적으로 도포합니다. 대조군 생쥐의 경우, 이 도포 과정을 1일 3회씩 14일 동안 반복합니다. 알칼리 화상 및 PBS로의 2회 헹굼 단계 이후, saha가 포함되지 않은 PBS 희석 DMSO를 14일 동안 매

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 프로토콜, 마우스의 눈 표면에 마모를 및 상처 치유 과정 그 후에 따라 메서드를 설명 합니다. 프로토콜은 부분적으로 anaesthetized 쥐에서 눈의 표면 상피를 제거 하는 눈 버 합니다.

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

이 프로토콜은 마우스의 알칼리 화상 유발 각막 신생혈관화에 중점을 둡니다. 이 방법은 병리학적 혈관신생 및 관련 분자 메커니즘을 연구하고 각막 신생혈관을 예방하기 위한 새로운 약리학적 제제를 테스트하기 위해 재현 가능하고 제어 가능한 각막 질환 모델을 생성합니다.

알칼리 화상에 의한 각막 신생혈관 형성을 위한 마우스 모델

이 프로토콜은 마우스 모델에서 정확하고 재현 가능한 각막 및 윤부 알칼리 손상을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 고도로 구부러진 쥐의 각막과 변두리에 고르게 분포된 손상을 허용하기 때문에 유리합니다.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

여기에 설명된 신허혈증 재관류 손상의 마우스 모델은 급성 신장 손상을 초래하는 허혈증을 유도하기 위해 제어 조직을 제공하는 오른쪽 신장 절제술과 왼쪽 신장 척추를 고정하는 것으로 구성됩니다. 이 모델은 한 번의 절개를 통해 모든 단계를 수행하는 정중선 개복술 접근법을 사용합니다.

신장 허혈 재관류 상해 : 상해의 마우스 모델 및 재생

여기에서는 신생혈관 연령 관련 황반변성(AMD)의 혈관 특징을 재현하는 실험 모델인 마우스 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(CNV) 프로토콜을 제시합니다. 일단 마스터하면 다양한 실험 측정을 테스트하기 위한 모델 시스템으로 CNV를 안정적이고 효과적으로 유도할 수 있습니다.

레이저에 의한 맥락막 신생 혈관에 대한 마우스 모델

운동 선수는 매년 수백 건의 경증 외상성 뇌 손상 (mTBI) / 뇌진탕을 흡수합니다. 그러나 뇌에 대한 이들의 결과는 제대로 이해되지 못했습니다. 따라서 임상 적으로 적절한 증상을 반복적으로 반복하는 단일 및 반복 mTBI의 동물 모델은 mTBI 및 뇌진탕의 연구를 발전시킬 수있는 수단을 제공합니다.

단일 및 반복적 인 경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델

아이리스 neovascularization, 허 혈 성 망막 질환의 일반적인 합병증은 신생 녹 내장 시력을 위협 하 될 수 있습니다. 여기, 우리는 신생 변조 물질의 비 침범 성 평가 위해 사용할 수 있는 실험 아이리스 neovascularization를 유도 하는 murine 프로토콜을 설명 합니다.

마우스 모델 Rubeosis Iridis의 아이리스 Neovascularization 펑크 유발

선법 myograph 혈관 부드러운 근육 기능과 화면 새로운 약물을 조사 하는 데 사용 됩니다. 우리 보고 마우스 mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정 및 혈관 평활 근의 새로운 relaxants 심사에 대 한 자세한 프로토콜.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

이 연구는 레이저 반점 대비 이미징 여 인간의 구강 점 막에는 미세 측정 하기 위한 프로토콜을 소개 합니다. 모니터링 상처 치유 후 vestibuloplasty 함께 xenogenic 콜라겐 이식 임상 사례에 제공 됩니다.

새로운 접근 방식을 접목 Neovascularization 인간의 Gingiva에 모니터링

배우세요 마우스 각막 신생 혈관화 연구를 위한 알칼리 화상 모델을 통해 항혈관신생 요법의 효과를 관찰하는 방법입니다. 이 기법은 각막 실명 치료를 위한 새로운 치료 전략 개발에 활용됩니다.

마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

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