Name: 적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 배우세요 적혈구 항체에 의한 보체 활성을 정량적으로 측정하는 방법입니다. 유세포 분석과 용혈 분석을 통해 면역학 및 혈액학 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 브로 멜라 인 처리 적혈구의 준비 <ol><li> 세척 0 형식의 적혈구는 1X PBS (2 ~ 5 분 664 XG에 원심 분리)으로 3 배. </li><li> 37 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 브로 멜라 인 솔루션의 두 개의 볼륨으로 포장 적혈구의 1 볼륨을 품다 </li><li> 세포는 1X PBS로 3 배 씻으십시오. </li><li> 세포는 1 주일 이상 1X PBS에서 39 ° C에서 3 % 용액으로 저장 될 수있다. </li></ol> 2. FACS에 의한 적혈구에 C3와 C4 증착 분석 <ol><li> 56 ℃에서 30 분 동안 샘플을 가열함으로써 환자 혈청의 필요량 (또는 다른 안티 RBC 항체 소스) 열 불 활성화 </li><li> (5 mM의 Veronal, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 %의 젤라틴의 pH 7.4)과 VBG는 + +에서 그들을 재현 탁 - VBG에 브로 멜라 인 처리 적혈구를 세 번 씻으십시오 (VBG - + 2 mM의 MgCl2를 2 + 10 mM의 염화칼슘 2)에게주는 0.5 % 용액. </li><li> (F 유리 진주 둥근 바닥 판에 다음과 같은 구성 요소를 피펫또는 적절한 혼합) : 25 ㎕의 0.5 % 적혈구, 37.5 ㎕의 신선한 AB 혈청 (보수 원) 37.5 ㎕를 200 ㎍ / ㎖의 항-C5. 안티-C5는 비싼 구하기 어려울 수 있습니다. 하나는 C5-/C6-/C7- 또는 C8-결핍 혈청 대신 AB 혈청 및 안티-C5를 사용하여 고려할 수 있습니다. </li><li> 0.1-33 %의 최종 농도에 잘 당 환자의 혈청을 추가합니다. 올바른 열 불 활성화 AB 혈청을 사용으로 인해 잘 당 혈청 농도의 차이. 물론 150 μL /의 최종 볼륨을 얻기 위해 VBG + +를 ​​추가합니다. ELISA 호일 닫기 판. </li><li> 흔들리는 동안 37 ° C에서 1.5 시간을 품어. </li><li> PBS + 0.5 % BSA (2 분 664 XG에 원심 분리)과 적혈구 세 번 씻으십시오. </li><li> 추가 형광으로 표지 된 항-C3 및 항-C4 단클론 항체 또는 Fab 단편은 1 ㎍ / ml의 최종 농도로 PBS + 0.5 % BSA에서 (응집을 감소시키기 위하여). 여기에 사용자 정의 앤티 C3-알렉사 플 루어 488 개발 및 안티-C4-알렉사 플 루어 647 단일 클론 항체를 사용, 살전의 선택전자 형광 라벨 FACS에 의해 C3과 C4의 동시 탐지 할 수 있습니다. </li><li> 부드러운 흔들림과 실온에서 30 ~ 45 분을 품어. </li><li> PBS + 0.5 % BSA와 함께 세척 적혈구 배. </li><li> 재현 탁 적혈구 (150) PBS +0.5 %의 BSA의 μL과 (FACS 분석을하기 전에 유리 진주를 제거하는) 새 접시에 그들을 피펫. </li><li> FACS 분석을 수행합니다. 분산하려 FSC-A의 이중선에서 분리 한 세포는, 하나의 적혈구에 게이트를 설정, 형광 신호 (예 : FITC 및 APC)에 대한 적절한 감지 채널을 선택합니다. </li><li> 평균 형광 강도를 사용하여 결과를 정량화. </li></ol> 주 : 이소 타입 컨트롤 (예, 항-IL6 형광 쥐의 IgG1 표지 된)을 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 환자의 혈청 (만 AB 혈청)없이 또는 보완 소스 (열 불 활성화 AB 혈청 및 열 - 불 활성화 된 환자의 혈청)없이 적혈구를 배양하여 예를 들어 진정한 부정적인 컨트롤을 포함하는 것이 좋습니다D 다음 같은 항-C3-알렉사 플 루어 488 및 안티-C4-알렉사 플 루어 647 항체 이러한 얼룩. 이러한 상이한 조절은 일반적으로 동일한, 부정적인 결과를주고 있지만 이것은, 적혈구 (12)의 경우, 이소 제어보다 더 유효하게 제어 할 수 있습니다. 3. 양 용혈성 분석 <ol><li> 56 ° C에서 샘플 30 분 가열하여 환자의 혈청 필요한 금액 (또는 다른 항 적혈구 항체 소스) 열 불 활성화 </li><li> VBG로 세척 적혈구 배 - 한 번 VBG와 + +. </li><li> (적절한 혼합을위한) 유리 진주 둥근 바닥 판에 다음과 같은 구성 요소를 피펫 35 μL 3 % 적혈구, 25 ㎕의 신선한 AB 혈청 (보완 소스) 및 1~50% 환자의 혈청. 열 - 불 활성화 된 AB 혈청을 이용한 혈청 농도의 차이를 보정. 물론 150 μL /의 최종 볼륨을 얻기 위해 VBG + +를 ​​추가합니다. ELISA 호일 닫기 판. </li><li> 진탕 1.5 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> C감소 감속 (2 ~ 3 분에 완전 정지 등 감속)와 5 분 664 XG에 entrifuge 판. </li><li> 조심스럽게 새로운 마이크로 플레이트에 90 ㎕의 상층 액을 피펫. 이 기포를 방지하고 세포 손상을 따라 취할 것을 방지하기 위해이 단계에서 중요하다. </li><li> 적당한 분광 광도계에 A414/690을 측정합니다. </li><li> 순수로 샘플 적혈구의 용해의 비율로 용해를 표현한다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

위의 분석을 재현하고 강력한 있습니다. 그들은 수행하기 쉽고 그것이 (96 - 웰 플레이트에서) 동시에 많은 샘플들을 수행 할 수있다. 따라서,이 방법은 ELISA 로봇 시스템 예를 들어, 완전 자동화 된 시스템에 적합하다. 현재 사용되는 기술과 대조적으로, 이러한 분석은 정량적이며 이것은 보체 억제제 효과의 연구에서 예를 도울 것이다. 또한, 해석은 현재 사용되는 분석법에 비해 개선하는 목적이다. 두 분석은 하나의 중요한 단계가있다. 그들은 하나의 이벤트로 계산되기 때문에 응집 적혈구는 인위적으로 높은 신호를 제공하기 때문에 FACS 분석에서 중요, 하나의 적혈구에 게이트입니다. 낮은 농도는 여전히 좋은 신호를 제공하기 때문에 그것은 낮은 환자의 혈청 농도를 사용하여 응집을 방지하기 위해 더 나은입니다. 용혈성 분석에서, 신중 상청액을 전송하는 데있어 매우 중요새 접시에 따고 배양은, 적혈구의 이월 때문에 (뜻 기포 등) 신뢰할 수없는 신호로...

적혈구 (적혈구)에 대한 항체는받는 사람의 적혈구에 존재하지 않는 항원을 발현하는 적혈구의 수혈에 의해 유발 될 수있다. 이러한 알로 - 항체는 다음과 같은 수혈 5에 활성화를 보완에 의한 중증 급성 용혈성 수혈 반응을 일으킬 수 있습니다. 자가 면역 용혈성 빈혈 (AIHA), 환자는 자신의 적혈구에 대한 자동 항체가있다. 이것은 비장 및 / 또는 간 6,7 보체 수용체 활성화를 통해 보완 할 수 자동 항체의 경우 식세포상의 Fcγ 수용체에 결합하여 적혈구의 IgG의 상호 작용을 통해 세포의 가속 간극에 이르게한다. 혈관 내 용혈의 결과로 전격 보체 활성화는 드물지만 종종 치명적이다. 가속, 급성 빈혈 알로 또는 항체 결과, 따라서 잠재적으로 치명적인 조직의 저산소증 중 하나에 의해 유도 된 매개 RBC 파괴를 보완. AIHA의 자동 항체 dependin, 따뜻하고 차가운 항체로 분류된다그들은 적혈구 (각각 37 ° C 이하)에 바인딩 최적의 온도에 g. 따뜻한 항체의 IgG 아이소 타입의 일반적이며, IgM 항체의 차가운 항체는 8,9 이소. AIHA 예 : lymphoprolyferative 장애, 결합 조직 질환, 고형 종양, 감염이나 약물에 보조 할 수 있지만, 50 %의 경우에 AIHA 특발성 9입니다. gammaglobulins (예.의 IgG 또는 IgM 항체)의 검출 및 환자의 적혈구에 바인딩 보완은 반 정량적 직접 글로불린 (쿰스) 시험 (DAT)에 의해 수행된다. DAT에서 환자의 적혈구가 항-IgG의 또는 항-C3D와 함께 배양된다. RBC의 응집의 발생이 부착 보완 구성 요소 나 IgG의 바인딩의 존재를 보여줍니다. 알로 - 또는 환자의 혈청 내 항체의 검출은 간접 글로불린 테스트 (IAT)에 의해 수행된다. IAT에서, 브로 멜라 인 처리 테스트 적혈구는 환자의 혈청 배양 세척 한 후 항-H와 함께 배양하는IgG의 우만. 경우 적혈구 방지 RBC의 IgG 환자 혈청 응집에 존재 발생에 민감하게되었습니다. 적혈구에 대한 IgM 항체는 직접 환자의 혈청과 브로 멜라 인 처리 테스트 적혈구의 배양에 응집으로 이어질 것입니다. 직접 쿰스 시험이나 IAT에있는 RBC의 응집은 시각적으로 테스트 튜브에 눈 또는 크기 (1)에 의해 응집 및 단일 적혈구를 분리하는 작은 세파 덱스 컬럼에 샘플을로드하여 하나 평가한다. 적혈구의 보체 활성화를 측정하는 또 다른 자주 사용되는 기술은 브로 멜라 처리 적혈구 10의 (보완 중재) 용혈을 유도하는 환자 혈청의 능력이 평가되는 용혈성 분석 한 것이다. 원심 분리 후 상층 액 인해 출시 헤모글로빈에 빨간색 염색 무색 남아있는 경우 부정적인 것으로 간주 될 때 시험은 긍정적으로 기록됩니다. 글로불린 테스트 및 용혈성 분석 둘, 반 정량적이기 때문에 가장 높은 빼m은 희석 시험 여전히 양성되는 표시된다. 글로불린 테스트 및 용혈성 분석은 정기적으로 진단에 사용되는 강력한 분석이다. 이러한 분석은 반 정량적 및 보완 억제제의 효능을 평가할 때 필요에 따라 그들은 적혈구에 보체 활성화의 미묘한 차이를 연구하기에 적합하지 않은 분석을 수행하는 기술자의 경험에 의존하기 때문이다. 따라서, 우리는 우리가이 글에서 설명 할 것이다 적혈구로 (자동) 항체가 보체 활성화를 결정하는 두 개의 정량 분석​​법을 개발했다. 첫째, 우리는 적혈구에 보체 C3과 C4의 활성화 조각의 증착 (그림 1A)를 측정 할 수있는 분석을 개발했다. 이 분석에서, 인간의 브로 멜라 인 처리 유형 0 적혈구는 열 불 활성화 된 환자의 혈청 (항 적혈구 항체 원), 신선한 AB 혈청 (보완 소스) 및 안티-C5의 단일 클론 항체 (Eculizumab)와 함께 배양된다. 이 INC 중환자 혈청 안티 RBC 항체를 활성화 보완이 포함 된 경우 ubation, C3와 C4 증착이 발생합니다. 하류 보체 활성화하여 RBC 용해를 방지하기 위해 차단 항-C5 단클론 항체를 첨가한다. 이어서, 적혈구의 C3 및 C4 증착은 각각 C3 및 C4와 반응시켜 형광 표지 된 모노클로 날 항체의 Fab-단편을 사용하여 FACS에 의해 검출된다. 하나의 적혈구에 게이팅 결과의 신뢰성을 확보하는 것이 중요합니다. 이 기술의 이점은 환자 물질의 소량이, 캐스케이드의 조기 활성화를 보완이 평가된다 필요하고 상기 방법은 재현성 및 정량적 인 것을 포함한다. C3와 C4 모두보고의 또 다른 장점은 구별이 클래식과 렉틴 경로 활성화 (C3와 C4 증착 모두) 및 대안 경로 활성화 (만 C3 증착) 사이에 할 수 있다는 것입니다. 대신 치료 적혈구 브로 멜라 인 처리 적혈구의 사용으로 감도를 증가말한다. 두 번째 분석은 현재 사용되는 용혈성 분석 (그림 1B)를 기반으로합니다. 인간 브로 멜라 인 처리 유형 0 적혈구는 열 불 활성화 된 환자의 혈청 (항 적혈구 항체 소스)와 신선한 AB 혈청 (보완 소스)와 함께 배양된다. 보완이 환자 안티 RBC 항체에 의해 활성화되는 경우, 농도 의존적​​ RBC의 용해는 헤모글로빈의 방출로 이어지는, 발생합니다. 릴리스 된 헤모글로빈의 양이 본래와 단편화 적혈구 회전을 멈추지 후 상등액 414 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량한다. 흡광도가 발생 용혈 량과 상관. 현재 사용 된 분석과는 대조적으로,이 프로토콜은 대물, 재현성 및 분석을 해석하는 사람에 의존하지 용혈의 양적인 값을 허용한다. 이러한 방법의 애플리케이션은 AIHA에서 보체 억제제로서 C1-억제제의 잠재적 인 사용을 해제이었다 (11)에 기재 한 내용tudied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>프레지니우스 카비</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>바르비탈</td><td>파그론</td><td>0261</td><td>이 화학 물질은 약물 규제의 대상입니다.</td></tr><tr><td>나트륨 바르비탈</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>이 화학 물질은 약물 규제의 대상입니다.</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>머크</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>머크</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 아민 반응성 염료</td><td>피어스</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 아민 반응성 염료</td><td>피어스</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&알파; C5 (에쿨리주맙)</td><td>알렉시온 제약</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>적절한 레이저가 있는 모든 FACS를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>분광 광도계(예: Multiskan 스펙트럼)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>올바른 파장 범위의 모든 분광광도계를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어 v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>호환 가능한 FACS 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Bromelain&nbsp;</td><td>산퀸</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

적혈구 (적혈구)에 대한 항체는 간 (혈관 외 용혈) 또는 적혈구의 혈관 내 용해에 이르는 보체 수용체를 통해 가속 정리의 결과로 활성화를 보완하기 위해가 발생할 수 있습니다. 혈관 내 용해 선도 특히 - - 활성화를 보완하기 위해 선도적 인 동종 항체 (자가 면역 용혈성 빈혈, AIHA에서 볼 수있는 것처럼) (예 ABO) 또는 적혈구 항원에 대한자가 항체가 잠재적으로 유해 할 수 있으며 치명적인 1. 현재 인해 적혈구에 (자동) - 항체 활성화를 보완은 RBC 또는 RBC 용해 1-4을 반영하는 nonquantitative 용혈성 분석에 의해 보완 증착을 반영하는 쿰스 테스트를 사용하여 체외에서 평가된다. 그러나, 보체 억제제의 효능을 평가하기 위해, 그것은 정량적 기법을 가지고 필수적이다. 여기에서 우리는 이러한 두 기술에 대해 설명합니다. 첫째, 환자의 혈청에서의 항체에 의해 유도되는 적혈구에 C3 및 C4 증착을 검출하는 분석법이다 사전하고 처리하며. 이를 위해, FACS 분석은 형광 표지 된 항-C3 또는 항-C4 항체로 사용된다. 이어서, 정량 분석​​ 용혈성 설명한다. 환자의 혈청에 의해 유도 된이 분석에 보완 - 중재 용혈이 발표 헤모글로빈의 분광 검출 만들기 사용을 측정한다. 이러한 분석은 모두 항체에 의한 보체 활성화의 연구를 촉진, 재현성과 정량이다.

그림 2A는 적혈구의 대표 산점도를 보여줍니다. FSC-A 플롯 (P1) - 하나의 적혈구에 적합한 게이트 드 FSC-W에서 볼 수 있습니다. 적혈구의 보통 약 95 %는이 P1 게이트 (단일 세포) 내에 있지만, 환자 혈청의 높은 비율을 사용하는 경우 안티 RBC IgM 항체가 환자의 혈청에 존재 특히,이 70 ~ 80 %로 떨어 뜨릴 수 있습니다. C4 증착에 AIHA 환자 혈청의 효과에 대한 대표적인 결과는 그림 2B 및 그림 2C에서 C3 증착에 표시됩니다. 이들 도면에서 알 수있는 바와 같이, 예상되는 바와 같이, 더 많은 환자 혈청 자세한 보완 증착에 이르게한다. 이상하게도, 보수 증착은 두 가지 긍정적 인 피크에서 발생합니다. 적혈구가 하나의 기증자로부터 인출되어 있기 때문에 이것은 아마도, RBC 인구의 이질성에 의해 발생하지 않습니다. 우리는 아직이 현상의 원인을 조사하...

여기에서 우리는 적혈구에 대한 항체에 의해 유도 된 보체 활성화를 측정하기위한 두 가지 분석을 설명합니다. 현재의 분석을 통해 가장 큰 장점은 양적 및 쉬운 해석하는 성격이다.

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

다음 실험의 전반적인 목적은 환자 혈청 내 적혈구(RBC)에 대한 항체에 의한 보체 활성화를 평가하는 것입니다. 이는 적혈구를 차단용 anti-C5 항체가 존재하는 상태에서 환자 혈청과 함께 배양하여 적혈구 표면에 C4 및 C3 침착을 유도함으로써 달성됩니다. 그다음, 적혈구를 형광 표지된 anti-C4 및 anti-C3 항체로 염색하며, 대안적인 방법으로 유세포 분석법을 통해 적혈구의 보체 침착량을 분석할 수 있습니다.보체 매개 용혈을 유도하기 위해 anti C5가 없는 상태에서 환자 혈청과 함께 RBC를 배양합니다. 이후 분광광도법으로 세포에서 방출된 헤모글로빈의 양을 측정하여 용혈된 RBC의 백분율을 결정할 수 있습니다. 일상적인 진단에 사용되는 용혈 검사나 항글로불린 검사와 같은 기존 방법과 비교했을 때, 이 새로운 기술의 주요 장점은 정량적 특성을 가지며 보체 활성화의 미세한 차이를 감지할 수 있다는 점입니다.저희 실험실의 박사후 연구원인 Elizabeth Brook이 절차를 시연하겠습니다. 먼저 O형 적혈구를 PBS로 3회 세척한 다음, 0.5% Roma lane 용액과 1:2 비율로 섞어 37°C에서 10분 동안 펠릿을 배양합니다. 세포를 3회 더 세척한 후, 유세포 분석법으로 적혈구의 보체 침착을 분석하기 위해 신선한 PBS 내 3% 용액 상태로 4°C에서 보관합니다. 먼저 필요한 양의 환자 혈청을 56°C에서 30분 동안 가열 불활성화합니다. 혈청이 열처리되는 동안, brola 처리된 적혈구를 Roal 버퍼로 3회 세척하고 마지막 세척 단계까지 완료합니다.펠렛을 vbg plus plus에 0.5% 희석 농도로 재현탁합니다. 그다음, 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 0.5% RBCs 25 µL, 신선한 AB 혈청 37.5 µL, 그리고 200 µg/mL anti C five 37.5 µL를 유리 구슬과 함께 첨가합니다. 그런 다음, 각각의 웰에 적절한 농도의 열불활성화된 환자 혈청을 첨가하며, 필요에 따라 열불활성화된 AB 혈청으로 보충하고 음성 대조군도 함께 포함시킵니다.VBG plus plus를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 150 µL로 맞춘 다음, EIA 포일로 플레이트를 덮고 37 °C에서 1.5~2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 배양이 끝나면 0.5% BSA가 보충된 PBS로 세포를 3회 세척하고, 1 µg/mL의 형광 표지 anti-C3 및 anti-C4 단클론 항체로 세포를 표지합니다. 세포를 실온에서 부드럽게 흔들어주며 30~45분 동안 배양한 다음, 플레이트를 3회 세척하고 RBC를 웰당 150 µL의 PBS plus 0.5% BSA에 재현탁합니다.세포 현탁액을 새로운 96-well round bottom plate로 옮긴 후, 플레이트를 유세포 분석기에 로드하고 전방 산란광(forward scatter) 플롯을 사용하여 단일 세포와 더블렛(doublets)을 분리합니다. 단일 RBC에 게이트를 설정한 다음, 형광 신호를 위한 적절한 검출 채널을 선택하십시오. 정량적 용혈 분석을 위해 중앙값 형광 강도(median fluorescence intensity)를 사용하여 결과를 정량화하고, 환자 혈청을 가열 및 활성화하며, 방금 시연한 대로 로마인(romaine) 처리된 RBC를 세척하십시오.앞서 시연한 것과 같이 항 C5 없이 보체 및 환자 혈청과 함께 RBC를 배양한 후, 감속도를 낮춘 상태에서 664 g로 5분간 세포를 원심 분리합니다. 다음으로, 손상되지 않은 세포가 옮겨지지 않도록 주의하고 기포가 생기지 않게 하면서 상층액 90 µL를 새로운 마이크로타이터 플레이트로 조심스럽게 옮긴 후, 분광광도계로 414~690 nm에서 흡광도를 측정합니다. 용혈 정도는 순수 물에서 배양한 RBC 샘플의 용해 비율에 대한 백분율로 표시합니다.첫 번째 그림에서는 brola 처리된 RBC의 대표적인 산점도가 나타나 있으며, 단일 RBC를 위한 적절한 게이팅을 여기서 확인할 수 있습니다. 일반적으로 RBC의 약 95%가 이 단일 세포 게이트 내에 포함됩니다. 이 히스토그램들은 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia, aha)의 영향에 대한 대표적인 결과입니다.C4 및 C3 침착에 대한 환자 혈청 결과가 예상대로 나타났으며, 환자 혈청의 양이 많을수록 보체 침착이 더 많이 발생합니다. 흥미롭게도, 보체 침착은 두 개의 뚜렷한 양성 피크로 나타납니다. RBC를 단일 공여자로부터 채취했으므로 이는 아마도 RBC 집단의 불균질성에 의한 것은 아니겠으나, 이 현상의 원인은 현재 조사 중입니다. C4 및 C3 침착 분석의 재현성을 보여주기 위해 샘플의 중앙값 형광 강도를 이 선 그래프에 도식화하였습니다.다양한 AH H 환자 샘플의 침착 정도가 매우 다양함에 유의하십시오. 마지막으로, RBC에 대한 자가항체를 포함하는 ahha 환자 혈청 샘플의 용혈 분석 데이터가 이 그래프들에서 관찰될 수 있습니다. anti C five와 같은 적절한 보체 억제제를 사용하여 혈청 샘플을 적정하면 명확하고 재현 가능한 곡선을 얻을 수 있습니다.이 그래프에서 보여주는 것처럼 용혈 신호는 적정하여 제거할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 C3 또는 C4 침착에 대한 유세포 분석법이나 정량적 용혈 분석법을 통해 적혈구 특이 항체에 의한 보체 활성화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

methods-for-quantitative-detection-antibody-induced-complement

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

고전 경로는 항체에 의해 활성화되고 대상 세포 용해에 culminates 있습니다.

50 % Haemolytic 보완 (CH 측정 50</sub혈청>) 활동

출처: Nagre, N. 외 마우스의 폐포 대식세포 섭취와 박테리아 제거. J. Vis. Exp. (2019).이 영상은 IgM과 보보체로 옵소니시된 양 적혈구를 이용한 보체 수용체 매개 식구 평가를 시연하며, 이후 쥐 대식세포에 의한 흡수를 보여줍니다. 식의 정도는 헤모글로빈 촉매에 의해 산화된 디아미노플루렌의 청색색 생성 산물을 측정하여 정량화됩니다.

옵소니즈드 적혈구를 이용한 보체 매개 식세포작용 모델 in vitro

이 동영상은 혈청에 존재하는 항체의 보체 매개 살균 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 이 접근법은 분리된 혈청과 병원성 박테리아 및 외인성 보체 단백질을 결합합니다. 배양 시, 박테리아는 한천 플레이트에서 성장하고, 생산된 콜로니는 혈청 살균 역가를 측정하기 위해 정량화됩니다.

항체의 보체 매개 박테리아 활성을 위한 혈청 박테리아 분석

이 비디오는 특정 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 혈응집 억제 분석을 보여줍니다. 테스트 웰에서의 적혈구 응집 억제 및 대조군 웰에서의 적혈구 응집의 확인은 뚜렷한 시각적 패턴을 통해 달성됩니다. 이 분석은 면역 반응, 백신 효과를 평가하고 바이러스학 및 면역학에서 바이러스 감염을 연구하는 데 중요한 역할을 합니다.

표적 항원에 대한 혈청 항체를 검출하기 위한 Hemagglutination Inhibition Assay

이 비디오는 T 세포 효과기 기능의 항체 매개 활성화를 측정하는 분석을 보여줍니다. HA를 발현하는 형질주입된 포유류 세포에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 특이적 단일클론 항체를 추가하면 HA와 함께 면역 복합체가 형성됩니다. Fc 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 루시페라제 리포터를 도입하면 T 세포는 항체-HA 복합체에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 루시페라제 기질을 추가하고 생성된 생물 발광을 측정하여 검출됩니다.

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

이 비디오는 모유 식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 항원-항체 복합체에 접합된 형광 표지된 미세구는 모유에서 분리된 세포 현탁액과 결합되어 식세포 백혈구에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 유도합니다. 세포를 일반 백혈구 항원(CD45)에 대한 항체로 라벨링할 때, 유세포 분석법을 사용하여 미세구 양성 생존 가능한 식세포 백혈구의 형광 강도를 측정하여 ADCP 활성 수준을 나타냅니다.

식세포에 의한 항체 의존성 세포 식세포작용을 측정하기 위한 시험관 분석

단핵구 단층 분석법(MMA)은 포유류 말초 전혈에서 얻은 분리된 1차 단핵구를 사용하여 Fcγ 수용체(FcγR) 매개 식세포작용을 평가하는 체외 분석법입니다.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.

유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.

적혈구 단백질의 동적 변화에 대한 면역염색 기반 검출

당사는 기존 단핵구-단층 분석법(MMA)에 대한 개선 사항을 개발하고 방법을 업데이트했으며, 이 분석에서는 대식세포를 사용하여 수혈 의학 및 면역학에서 적혈구 동종 항체의 임상적 관련성을 더 잘 예측하는 데 도움을 줍니다. 이 분석법은 단핵구-대식세포 분석법(M-MA)이라고 합니다.

Monocyte-Macrophage Assay를 이용한 적혈구 항체 유의성 예측(Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay)

배우세요 적혈구 항체에 의한 보체 활성을 정량적으로 측정하는 방법입니다. 유세포 분석과 용혈 분석을 통해 면역학 및 혈액학 연구에 활용할 수 있습니다.

적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

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