적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 환자 혈청에서 적혈구 또는 적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성화를 평가하는 것입니다. 이는 적혈구 표면에 C, 4 및 C3 침착을 유도하기 위해 차단된 항 C 5 항체가 있는 상태에서 환자 혈청과 함께 적혈구를 배양함으로써 달성됩니다. 다음으로, 적혈구를 형광 표지된 anti C four 및 anti C3 항체로 염색하고, 적혈구에 대한 보체 침착의 양은 대체 방법으로 유세포 분석으로 분석할 수 있습니다.

적혈구는 보체 매개 용해를 유도하기 위해 anti C five가 없는 경우 환자 혈청과 함께 배양됩니다. 그런 다음 용해된 적혈구의 비율은 분광법으로 세포에서 방출되는 헤모글로빈의 양을 측정하여 결정할 수 있습니다. 일상적인 진단에 사용되는 용혈 또는 항글로불린 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 새로운 기술의 주요 장점은 본질적으로 정량적이며 보체 활성화에서 차선의 차이를 감지할 수 있다는 것입니다.

연구실의 Elizabeth Brook 박사후 연구원은 다음과 같은 절차를 시연할 것입니다: PBS로 0형 적혈구를 세 번 세척한 다음 세포를 3번 더 세척한 후 섭씨 37도에서 10분 동안 0.5% Roma lane 용액에 펠릿을 1:2 비율로 배양하고, 섭씨 4도의 새로운 PBS에 3% 용액으로 보관하여 유세포 분석을 통해 적혈구의 보체 침착을 분석합니다. 첫 번째 가열: 혈청이 열처리되는 동안 섭씨 56도에서 30분 동안 원하는 양의 환자 혈청을 비활성화합니다. 브롤라 처리된 적혈구를 최종 세척 후 Roal buffer에서 3회 세척합니다.

Resus는 펠릿을 vbg plus plus에 0.5% 희석하여 현탁시킵니다. 다음으로 유리 진주에서 0.5 % RBC의 25 마이크로 리터, 신선한 AB 세럼의 37.5 마이크로 리터 및 밀리리터 당 200 마이크로 그램의 37.5 마이크로 리터, 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 5 개의 안티 C. 그런 다음 적절한 농도의 열 비활성화 환자 혈청을 각 웰에 추가하고 필요에 따라 열 비활성화 AB 혈청을 보충하고 음성 대조군도 포함합니다.

VBG plus plus를 사용하여 각 웰을 최종 부피 150 마이크로 리터로 가져온 다음 E IA 호일로 덮인 플레이트를 섭씨 37도에서 1 시간 반에서 2 시간 동안 배양 후 흔들어 배양합니다. 0.5%BSA가 보충된 PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 밀리리터당 1마이크로그램으로 세포에 태그를 지정합니다. 형광 표지 된 항 C3 및 항 C 4 개의 단일 클론 항체는 실온에서 부드러운 흔들림으로 30-45 분 동안 세포를 배양 한 다음 플레이트를 3 회 세척 한 후 150 마이크로 리터의 PBS와 0.5 % BSA에 적혈구를 재현탁시킵니다.

세포 현탁액을 새로운 96웰 원형 바닥 플레이트로 잘 옮긴 다음 플레이트를 유세포 분석기에 로드하고 전방 산점도를 사용하여 이중선에서 단일 세포를 분리합니다. 단일 RBC에 게이트를 설정한 다음 형광 신호에 적합한 검출 채널을 선택합니다. 정량적 용혈 분석을 위해 중앙값 형광 강도를 사용하여 결과를 정량화하고, 환자 혈청을 가열 및 활성화하고, 방금 시연한 대로 로메인 처리된 적혈구를 세척합니다.

그런 다음 방금 설명한 것처럼 보체 및 환자 혈청으로 적혈구를 배양한 후 anti C five가 없으면 감속을 줄이면서 664GS에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다. 다음으로, 90 마이크로 리터의 상등액을 새로운 마이크로 타이터 플레이트로 조심스럽게 옮기고, 손상되지 않은 세포가 전달되지 않도록주의하고 기포가 생성되지 않도록주의한 다음 분광 광도계 익스프레스에서 4 14-6 90에서 흡수를 측정합니다. 순수한 물에서 배양된 적혈구 샘플의 용해에 대한 백분율로서의 용혈

이 첫 번째 그림에서, 브롤라 처리된 적혈구에 대한 대표적인 산점도는 단일 적혈구에 대한 적절한 게이팅이 여기에서 볼 수 있음을 보여줍니다. 일반적으로 적혈구의 약 95%가 이 단일 세포 게이트 내에 속합니다. 이 히스토그램에서 자가면역 용혈성 빈혈 또는 aha의 효과에 대한 대표적인 결과입니다.

C 4 및 C3 침착에 대한 환자 혈청이 예상대로 표시되며, 더 많은 환자 혈청이 더 많은 보체 침착으로 이어집니다. 흥미롭게도, 보체 증착은 두 개의 뚜렷한 positive peaks에서 발생합니다. 이는 적혈구가 단일 공여자로부터 추출되기 때문에 적혈구 집단의 이질성에 의한 것이 아닐 수 있지만, 이 현상의 원인은 아직 조사 중이지만 샘플의 중앙값 형광 강도는 C 4 및 C3 증착 분석의 재현성을 보여주기 위해 이러한 선 그래프에 표시됩니다.

다양한 AH H 환자 샘플의 증착에서 큰 차이를 주목하십시오. 마지막으로, 적혈구에 대한 자가항체를 함유한 ahha 환자 혈청 샘플의 용혈 분석 데이터를 이 그래프에서 관찰할 수 있습니다. 혈청 샘플을 사용한 적정은 anti C five와 같은 적절한 보체 억제제로 명확하고 재현 가능한 곡선을 생성합니다.

용혈 신호는 이 그래프에서 입증된 바와 같이 적정하여 제거할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 C3 또는 C 4 증착의 유세포 분석 또는 정량적 용혈 분석을 통해 적혈구 특이적 항체에 의한 보체 활성화를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.