적혈구에 대한 항체에 의한 보체 활성의 정량 검출하는 방법

다음 실험의 전반적인 목적은 환자 혈청 내 적혈구(RBC)에 대한 항체에 의한 보체 활성화를 평가하는 것입니다. 이는 적혈구를 차단용 anti-C5 항체가 존재하는 상태에서 환자 혈청과 함께 배양하여 적혈구 표면에 C4 및 C3 침착을 유도함으로써 달성됩니다. 그다음, 적혈구를 형광 표지된 anti-C4 및 anti-C3 항체로 염색하며, 대안적인 방법으로 유세포 분석법을 통해 적혈구의 보체 침착량을 분석할 수 있습니다.

보체 매개 용혈을 유도하기 위해 anti C5가 없는 상태에서 환자 혈청과 함께 RBC를 배양합니다. 이후 분광광도법으로 세포에서 방출된 헤모글로빈의 양을 측정하여 용혈된 RBC의 백분율을 결정할 수 있습니다. 일상적인 진단에 사용되는 용혈 검사나 항글로불린 검사와 같은 기존 방법과 비교했을 때, 이 새로운 기술의 주요 장점은 정량적 특성을 가지며 보체 활성화의 미세한 차이를 감지할 수 있다는 점입니다.

저희 실험실의 박사후 연구원인 Elizabeth Brook이 절차를 시연하겠습니다. 먼저 O형 적혈구를 PBS로 3회 세척한 다음, 0.5% Roma lane 용액과 1:2 비율로 섞어 37°C에서 10분 동안 펠릿을 배양합니다. 세포를 3회 더 세척한 후, 유세포 분석법으로 적혈구의 보체 침착을 분석하기 위해 신선한 PBS 내 3% 용액 상태로 4°C에서 보관합니다. 먼저 필요한 양의 환자 혈청을 56°C에서 30분 동안 가열 불활성화합니다. 혈청이 열처리되는 동안, brola 처리된 적혈구를 Roal 버퍼로 3회 세척하고 마지막 세척 단계까지 완료합니다.

펠렛을 vbg plus plus에 0.5% 희석 농도로 재현탁합니다. 그다음, 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 0.5% RBCs 25 µL, 신선한 AB 혈청 37.5 µL, 그리고 200 µg/mL anti C five 37.5 µL를 유리 구슬과 함께 첨가합니다. 그런 다음, 각각의 웰에 적절한 농도의 열불활성화된 환자 혈청을 첨가하며, 필요에 따라 열불활성화된 AB 혈청으로 보충하고 음성 대조군도 함께 포함시킵니다.

VBG plus plus를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 150 µL로 맞춘 다음, EIA 포일로 플레이트를 덮고 37 °C에서 1.5~2시간 동안 흔들어주며 배양합니다. 배양이 끝나면 0.5% BSA가 보충된 PBS로 세포를 3회 세척하고, 1 µg/mL의 형광 표지 anti-C3 및 anti-C4 단클론 항체로 세포를 표지합니다. 세포를 실온에서 부드럽게 흔들어주며 30~45분 동안 배양한 다음, 플레이트를 3회 세척하고 RBC를 웰당 150 µL의 PBS plus 0.5% BSA에 재현탁합니다.

세포 현탁액을 새로운 96-well round bottom plate로 옮긴 후, 플레이트를 유세포 분석기에 로드하고 전방 산란광(forward scatter) 플롯을 사용하여 단일 세포와 더블렛(doublets)을 분리합니다. 단일 RBC에 게이트를 설정한 다음, 형광 신호를 위한 적절한 검출 채널을 선택하십시오. 정량적 용혈 분석을 위해 중앙값 형광 강도(median fluorescence intensity)를 사용하여 결과를 정량화하고, 환자 혈청을 가열 및 활성화하며, 방금 시연한 대로 로마인(romaine) 처리된 RBC를 세척하십시오.

앞서 시연한 것과 같이 항 C5 없이 보체 및 환자 혈청과 함께 RBC를 배양한 후, 감속도를 낮춘 상태에서 664 g로 5분간 세포를 원심 분리합니다. 다음으로, 손상되지 않은 세포가 옮겨지지 않도록 주의하고 기포가 생기지 않게 하면서 상층액 90 µL를 새로운 마이크로타이터 플레이트로 조심스럽게 옮긴 후, 분광광도계로 414~690 nm에서 흡광도를 측정합니다. 용혈 정도는 순수 물에서 배양한 RBC 샘플의 용해 비율에 대한 백분율로 표시합니다.

첫 번째 그림에서는 brola 처리된 RBC의 대표적인 산점도가 나타나 있으며, 단일 RBC를 위한 적절한 게이팅을 여기서 확인할 수 있습니다. 일반적으로 RBC의 약 95%가 이 단일 세포 게이트 내에 포함됩니다. 이 히스토그램들은 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia, aha)의 영향에 대한 대표적인 결과입니다.

C4 및 C3 침착에 대한 환자 혈청 결과가 예상대로 나타났으며, 환자 혈청의 양이 많을수록 보체 침착이 더 많이 발생합니다. 흥미롭게도, 보체 침착은 두 개의 뚜렷한 양성 피크로 나타납니다. RBC를 단일 공여자로부터 채취했으므로 이는 아마도 RBC 집단의 불균질성에 의한 것은 아니겠으나, 이 현상의 원인은 현재 조사 중입니다. C4 및 C3 침착 분석의 재현성을 보여주기 위해 샘플의 중앙값 형광 강도를 이 선 그래프에 도식화하였습니다.

다양한 AH H 환자 샘플의 침착 정도가 매우 다양함에 유의하십시오. 마지막으로, RBC에 대한 자가항체를 포함하는 ahha 환자 혈청 샘플의 용혈 분석 데이터가 이 그래프들에서 관찰될 수 있습니다. anti C five와 같은 적절한 보체 억제제를 사용하여 혈청 샘플을 적정하면 명확하고 재현 가능한 곡선을 얻을 수 있습니다.

이 그래프에서 보여주는 것처럼 용혈 신호는 적정하여 제거할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 C3 또는 C4 침착에 대한 유세포 분석법이나 정량적 용혈 분석법을 통해 적혈구 특이 항체에 의한 보체 활성화를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.