Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

이 절차의 전반적인 목표는 폴리솜 프로파일링에 의한 포유류 세포 및 조직의 번역, 시작에 대한 스트레스 조건의 영향을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 포유류의 암세포를 항암제로 처리한 다음 세포 추출물을 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 자당, 그라디언트를 만드는 것입니다.

다음으로, 세포 추출물을 자당, 그래디언트에 로드하고 초원심분리하여 리보솜 분획을 분리합니다. 최종적으로, 테스트된 단백질과 폴리솜의 연관성을 평가하기 위해 특정 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이 수행됩니다. 대사 라벨링과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 번역의 시작 단계에서 스트레스 조건의 영향을 평가할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 항암제가 번역 시작에 영향을 미치는지 여부와 어떻게 영향을 미치는지와 같은 스트레스 치료 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 번역 시작의 새로운 조절 경로를 밝히는 데 도움이 되기 때문에 암 치료로 확장됩니다. 이 방법은 세포 배양에서 번역 시작 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 뇌 및 종양을 포함한 격리된 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

자동 밀도 구배 분별 시스템을 먼저 준비하려면 장치의 튜빙 시스템을 0.1% SDS로 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 튜빙 시스템을 70% 에탄올로 5분 동안 세척한 다음 RNA Zap 용액으로 5분 동안 세척합니다. 마지막으로 DEPC를 사용하여 시스템에 공기를 펌핑하여 튜브 시스템을 건조시킵니다.

다음으로, 15% 및 55% 자당 용액을 준비하여 ISCO 모델 1개의 60 구배 포머를 사용하여 선형 15 내지 55% 자당 구배를 생성합니다. 제조업체의 지침에 따라 그라디언트 메이커 프로그램이 울트라 원심분리기를 섭씨 4도로 냉각하는 동안 그라디언트에 기포나 난류가 생성되지 않도록 트리스 연동 펌프 속도를 신중하게 제어하는 것이 중요합니다. 이 실험은 이전에 도금되어 80% 합류점에 도달하기 위해 도금된 저계면 helo 경추 암 세포를 사용할 때까지 구배를 섭씨 4도로 유지합니다.

실험 당일. 이 과정에서 신선한 세포에서 추출하고 RNA 오염을 방지하는 것이 중요하며, 항암제를 추가하기 90분 전에 세포의 배지를 신선하고 완전한 배지로 교체합니다. 번역을 촉진하려면 세포를 인큐베이터로 되돌려 보냅니다.

항암제를 대조군 첨가물로 세포 배양액에 직접 첨가합니다. DMSO는 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하고 4시간 후 이산화탄소를 5%로 배양한 후 얼음 위에 플레이트를 놓고 1ml의 용해 완충액에서 차가운 PBS 수확 세포로 세포를 3회 세척하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 각 실험 조건에 대해 약 1,200만 개의 세포를 사용합니다.

스크랩한 플레이트의 세포를 einor tube로 옮기고 주사기를 통해 15회 통과시켜 잘 혼합합니다. 세포 용해물을 얼음 위에서 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로, 세포 용해물 몇 방울을 슬라이드에 떨어뜨리고 10 x 대물렌즈를 사용하여 위상차 현미경으로 세포 용해를 평가합니다.

일단 세포 용해가 확인되면, 11, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 GS에 원심 분리에 의하여 세포 용해물을 명백하게 하십시오. 폴리 리보솜을 함유한 용해성 용해물을 새 튜브로 옮기고 세포질 추출물을 자당 구배에 로드하기 전에 얼음 위에 보관합니다. 분광 광도계를 사용하여 존재하는 RNA의 농도를 주의 깊게 측정하고 약 20 OD 2개의 60 단위의 추출물을 15 - 55% 자당 구배에 천천히 로드합니다.

원심분리 중에 튜브가 넘치지 않도록 튜브 표면에 2-3mm의 사용 가능한 공간이 있는지 확인하십시오. 튜브를 로터에 로드합니다. 로터를 울트라 원심분리기에 놓고 섭씨 4도에서 2시간 30분 동안 230, 000G의 기울기를 원심분리합니다.

원심분리가 완료되면 튜브를 제거하고 기울기를 방해하지 않고 조심스럽게 얼음 위에 놓습니다. 세포질 추출물의 분획을 시작하려면 자동 밀도 분획 시스템에 자당 그래디언트를 배치하고 제조업체가 설명한 대로 자동 분획 및 분획 수집을 진행합니다. 구배 분별 작업과 병행하여 250나노미터에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하여 각 0.5 밀리리터 분획을 개별 einor 튜브에 수집하면 폴리 리보솜 프로파일이 각 실행이 끝날 때 차트 용지에서 편집됩니다.

수집된 분획이 있는 eend 튜브를 얼음 위에 옮깁니다. 이 절차를 시작하려면 수집된 각 분획에 100% 저온 에탄올 두 부피를 추가하고 RNA 단백질 복합체가 하룻밤 동안 섭씨 영하 20도에서 침전되도록 합니다. 단백질의 적출을 위해, 11, 70%ethanol 공기로 세척한 후에 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 GS에 각 RNA 단백질 침전물을 건조시키고 침전물을 refuset 원심 분리하십시오.

SDS 페이지 샘플 버퍼: RNA Resus 추출을 위한 웨스턴 블롯 분석을 진행하기 전에 0.1% SDS를 포함하는 용해 버퍼에 각 RNA 단백질 침전물을 현탁시키고 30분 동안 밀리리터 단백질 분해 효소 K당 2밀리그램으로 침전물의 단백질 성분을 분해합니다. 섭씨 55% 수조에 페놀 클로로포름 1량, 클로로포름 2량, pH pH 4 2몰 아세트산나트륨 0.1부피를 추가합니다. 얼음 위에서 15분 동안 그대로 둔다.

10, 000 GS에서 20 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리기. 한 부피의 이소프로판올과 마이크로리터당 0.2마이크로그램의 글리코겐을 첨가하고 밤새 섭씨 영하 20도로 두어 각 샘플의 생성된 수성상을 수집합니다. 다음 날에, 10, 1 시간 동안 4 섭씨 온도에서 000 Gs에서 침전물을 회전시킵니다.

상등액을 제거하고 RNA 펠릿을 70% 차가운 에탄올로 세척하고 RNA 펠렛을 소량의 RNA로 재현탁합니다. 무료 물. 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양과 품질을 평가합니다.

여기에 표시된 것은 세포질 추출물의 대표적인 폴리솜 프로파일입니다. 정상 조건에서 성장하거나 프로테아좀 억제제로 4시간 동안 처리한 후 원심분리를 수행하여 15-55% 부피의 선형 자당 구배를 준비합니다. 40 s 리보솜 60 s, 리보솜 80 s, monos 및 polysome의 위치가 각 프로필에 표시되어 있습니다.

구배의 위에서 아래로 분획은 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되며, 분획은 정상적인 성장 조건에서 다염색체 무결성에 대한 대조군 역할을 하는 폴리솜 관련 단백질 FMRP뿐만 아니라 큰 리보솜 L 28 단백질에 대한 항체가 있는 웨스턴 블롯으로 수집 및 분석되었습니다. 번역 개시 복합체는 폴리솜 프로파일링에 의한 검출이 여기에서 관찰된 바와 같이 활성 번역 시작을 테스트하는 폴리리보솜으로 변환됩니다. 프로테아솜 억제제(proteasome inhibitor)를 사용한 치료는 다염색체 피크(polysome peaks)를 감소시키며, DS Monos의 증가는 번역 시작의 억제를 나타냅니다 이 절차를 수행하는 동안, 구배를 주의 깊게 처리하고 세포 용해를 제어하기 위해 r nase가 없는 환경에서 작업하는 것이 중요합니다.

특정 단백질의 연관성 또는 M MNA와 폴리솜이 개발 후 항암 치료의 영향을 받는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 서양 혈액 및 북혈과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 아리 번역 분야의 연구자들이 암 및 신경 퇴행성 질환과 같은 인간 질병에서 번역 시작 인자를 조절하는 것의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.