Name: Polysome 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 포리솜 프로파일링을 이용한 스트레스 조건에서 포유류 세포의 번역 개시 분석 방법을. 초당심 분리와 웨스턴 블롯으로 번역 활성을 평가하여 암 치료 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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PA는 라발 대학의 의학부에서 장학금 &quot;피에르 듀 런드&quot;의 수상자이다. 이 작품은 polysom​​e의 분별이 RMR M 새로운 CIHR 조사 급여 상을 보유하고 혁신 보조금에 대한 캐나다 재단 (MOP - GF091050)를 통해 획득 한 RM은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (MOP - CG095386)에 의해 지원되었다. 우리는 박사 부부에게 감사의 말씀을 전합니다. 도움이 조언 E. Khandjian, I. Gallouzi, S. 디 마르코와 A. Cammas.

프로토콜 지침을 따른다 라발의 윤리 심사위원회의 승인을. 1. 세포 배양의 준비 및 뇌 조작 <ol><li> 포유류와 초파리 세포 <ol><li> 미국 타입 컬쳐 컬렉션에서 권장하는 헬라에게 자궁 경부암 세포와 슈나이더 초파리 배아 세포를 성장. 낮은 통로에서 세포와 함께 작동합니다. </li><li> 80 % 합류에게 실험 일에 도달하기 위해 플레이트 세포. 최상의 결과를 위해, 각각의 실험 조건에 대한 세포의 ~ 12 × 10 6를 사용합니다. polysom​​e 분석을 위해 추출을하기 전에 적어도 90 분 동안 신선한 완전 배지를 추가하여 변환을 자극한다. </li></ol></li><li> 뇌의 분리 : 생후 9, 16 일 사이에서 나이 든 쥐에서 뇌를 분리합니다. 안락사는 마취 및 자궁 경부 탈구 후 CO 2 흡입을 포함한다. 희생에 따라, 전체 뇌와 어느 장소를 격리 나T -80 ° C에서 직접 즉시 사용할 차가운 PBS 1X로 전송합니다. </li></ol> 2. 밀도의 준비 그라데이션 분별 시스템 <ol><li> 5 분 동안 0.1 % SDS와 튜브 시스템을 씻으십시오. </li><li> DEPC의 물로 세척하기 전에 5 분 동안 RNaseZAP 용액으로 한 후, 5 분 동안 70 % 에탄올로 튜브 시스템을 씻는다. </li><li> 장치의 배관 시스템을 건조시키기 위해 공기 펌프. </li></ol> 자당 그라디언트의 3. 준비 <ol><li> 20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.4, 1.25 mM의 MgCl2를 2, 150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT의 15 % 및 55 % 자당 솔루션을합니다. </li><li> 생성 제조자의 지시에 의해 설명 된 것처럼 이전시키면서 ISCO 모델 160 구배를 사용하여 선형 15-55% 자당 구배. 그러나, 그라디언트 기포 나 난류의 생성을 방지하기 위해 잘 TRIS 연동 펌프 속도를 제어하는​​ 것이 중요하다. 사용할 때까지 4 ° C에서 그라디언트를 유지합니다. </li><li> 그라데이션 메이커 프로그램이 실행되는 시간 동안 4 ° C.에 초 원심 분리기를 냉각 </li></ol> 4. 셀의 제조 및 마우스 뇌 추출물 <ol><li> 세포 추출물의 제조 <ol><li> 얼음과 세척 세포에 장소 접시 (들)은 차가운 PBS 1X로 3 배. </li><li> 수확 세포의 pH 7.4, 1.25 mM의 MgCl2를 2, 150 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 DTT, 1 % Nonidet의 P40, 5 U / ㎖의 RNase 억제제, 보충에 1 ㎖의 용해 완충액 (20 mM 트리스 - 염산에 (~ 12 × 10 6) 완전한 미니 EDTA없는 프로테아제 억제제 칵테일 정제), 에펜 도르프 튜브로 전송하고, 1CC의 U100 인슐린 주사기 28 G 1 / 2를 통해 그들에게 15 배를 전달하여 잘 섞는다. 세포 용 해물을 15 분 동안 얼음 위에서 쉬게. </li><li> 10X 대물 렌즈를 이용하여 위상차 현미경으로 관찰하여 세포 용해를 평가하기 위해 슬라이드에 세포 용 해물의 몇 방울을 넣어. 만 핵은 볼 수 있어야 더 세포막은 세포 용해 볼 증명 없어야합니다. 컨트롤로 관찰unlysed 세포. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리하여 세포 용 해물을 명확히하고 폴리 리보솜을 포함하는 수용성 해물을 유지합니다. </li></ol></li><li> 마우스 뇌 추출물의 제조 <ol><li> 용해 완충액 2 ㎖와 얼음처럼 차가운 다운스 균질 10 스트로크에 의해 전체 격리 된 뇌 (~ 500 mg)을 균질화하고 4 ℃에서 15 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리하여 균질을 명확히 </li><li> 50 % 자당의 쿠션에 상층 액을 넣고 4 ℃에서 TH-641 초 원심 분리기의 회 전자를 사용하여 200,000 XG에서 2 시간 동안 침전 진행 </li><li> 용해 완충액 1 ㎖에서 폴리 리보솜을 포함하는 반투명 펠렛을 재현 탁하고 위아래로 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 그라디언트에로드하기 전에 30 분 동안 얼음에 서스펜션 나머지를 보자. </li></ol></li></ol> 5. 자당 그라디언트 및 초 원심 분리에 압축을 풉니 다 넣기 <ol><li> 농도를 측정분광 광도계를 사용하여 세포질 추출물에 존재하는 RNA의. 조심스럽게 천천히 15 % ~ 55 %의 자당 기울기에 ~ 추출물의 20 OD 260 단위를로드합니다. 사용 가능한 공간이 2 ~ 3 MM은 원심 분리하는 동안 튜브를 넘쳐 방지하기 위해 튜브의 표면에가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 TH-641 초 원심 분리기의 회 전자를 사용하여 230,000 XG에서 2 시간 30 분 동안 초 원심 분리기를 사용하여 그라데이션을 원심 분리기 원심 분리가 종료되면 튜브를 제거하고 그라디언트를 방해하지 조심스럽게 얼음에 배치합니다. </li></ol> Polysom​​es 프로파일에 대한 세포질 추출물 6. 분별 <ol><li> 제조자에 의해 설명 된대로 (0.5 ML 각) 자동화 밀도 분별 시스템에 자당의 그라디언트를 놓고 분수를 자동으로 분류 및 수집을 진행합니다. </li><li> 254 nm에서 흡광도를 지속적으로 모니터링하여 개별 에펜 도르프 튜브에 각 분획 (~ 500 μL)를 수집합니다. parall에서구배 분별 작업의 엘은 polyribosomal 프로파일 차트 용지에 편집한다. 대안 적으로, polysom​​e 프로파일의 전자 수집을받는 차트 레코더 부속 데이터 획득 유닛을 사용한다. </li><li> 각 실행의 끝에서, 드라이 아이스에 수집 Eppendorfs을 전송합니다. 이 때, 저장소 중 하나는 -80 ° C에서 분수를 수집 또는 다음과 같이 직접 단백질-RNA 복합체를 침전. </li></ol> 7. 단백질 추출 및 분석 <ol><li> 자당 기울기의 수집 된 각 부분에, 100 % 냉 에탄올의 2 볼륨을 추가하고 RNA-단백질 복합체가 -20 ° C 하룻밤에 침전 수 있습니다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 20 분 동안 11,000 XG에 각 RNA-단백질 침전물을 70 % 에탄올로 세척한다. 건조하고 (도 2 참조) 특정 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행하기 전에 SDS-PAGE 샘플 버퍼에 침전물을 재현 탁. </li></ol> 8. RNA 추출 및(분석) <ol><li> 7.1 절에서와 같이 RNA-단백질 복합체를 침전. SDS 0.1 %를 함유하는 용해 완충액에 각 RNA-단백질 침전물을 재현 탁. 55 ° C의 물을 욕조에 30 분 동안 2 ㎎ / ㎖ 테 K와 침전물의 단백질 성분을 소화. </li><li> &quot;클로로 페놀&quot;, 클로로포름 2 볼륨, 2 M의 NaOAc의 pH를 4 0.1 볼륨과 20 분 동안 4 ° C에서 10,000 XG에서 원심 분리의 1 볼륨을 추가하여 침전물의 RNA 구성 요소의 압축을 풉니 다. 이소프로판올 1 볼륨과 글리코겐의 0.2 ㎍ / μL를 추가하여 -20 ° C에서 하룻밤 각 샘플의 결과 수성 단계에서 RNA 침전물. 4 ℃에서 10,000 XG에서 1 시간 동안 침전 스핀 70 % 차가운 에탄올로 RNA 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 이는 RNAse 무료로 물을 작은 볼륨으로 RNA 펠렛을 Resuspend. 양을 평가 품질 RNA의 분광 광도계를 사용하여. </li></ol>

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수 크로스 구배에서 polysome 프로파일 분석은 세포 나 조직으로부터 분리 9,11-14 polysomes의 농도를 분석하여 번역 개시의 측정을 허용한다. 이 기술은 최고 접근 (없는 독특한 경우) 생체 내에서 번역 개시를 측정합니다. 이것은 세포주기 (15) 동안 세포를 성장의 병진 상태를 모니터링하고, 번역 개시에, 바이러스 감염, 저산소증 13,16, 방사선 (17), 화학 약물 요법에 사용되는 (18) 등의 스트레스의 다양한 유형의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 이 기술은 세포 배양과 같은 뇌 및 간 같은 특정 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 잘 작동하는 동안 그러나, 그것은 병든 조직 및 종양 대 정상의 번역 개시를 비교하는데 사용될 수있는 경우에 설립 될 남아있다. polysom​​e 프로파일의 변화는 번역 연신율을 변경 조건에서 발생할 수 있습...

진핵 세포는 지속적으로 빠른 적응 세포 반응을 필요 유해한 생리 학적 및 환경 스트레스 조건의 범위를 발생. 세포 스트레스 반응은 안티 - 생존과 프로 생존 행동 요인 사이의 정확한 균형을 포함한다. 이 균형을 방해하는 것은 암과 신경 퇴행성 질환 등 인간의 병리의 개발을 선도하는 돌이킬 수없는 결과를 초래할 수 있습니다. 스트레스 반응의 제 1 단계를 실시하는 동안, 세포는 mRNA의 번역 수준에서의 유전자 발현의 변화의 조정 제어를 포함하는 계의 생존 경로를 활성화. 진핵 생물의 mRNA의 번역은 번역 개시 인자 (EIFS), 특정 RNA 결합 단백질 (RBDS), 그리고 RNA 분자에서 1 사이의 조정의 상호 작용을 포함하는 복잡한 세포 과정이다. 개시, 신장, 및 종료 : mRNA의 번역은 세 가지 단계로 구분된다. 모두 3 단계 REGU 대상이지만병진 제어 메커니즘 따라서이 단백질 합성의 속도 - 제한 단계를 구성하는 대부분의 번역 개시 위상을 표적 곡선 띠의 외곽에 있음을 주목 메커니즘. 번역 개시 내가 사전 개시 복합체의 형성에 선도적 인, 삼원 복잡하고 40S 리보솜 서브 유닛에 그 이후의 바인딩을 만난 eIF2a.GTP.Met-tRNA의 형성으로 시작하는 높은 주문 프로세스입니다. 다음 단계는 그러한 eIF4F eIF3와 같은 번역 개시 인자의 활성을 수반의 mRNA에 preinitiation 착체의 채용이다. 이렇게 형성된 48S preinitiation 단지는 AUG 개시 코돈을 인식 할 때까지의 mRNA의 5&#39;-비 번역 영역을 스캔을 시작하기 위해이 기계를 가능하게 특정 구조적 변화를 겪는다. 번역 개시 인자의 대부분이어서 해제되고 60S 소단위가 80S을 형성하도록 채용되어 리보솜 복합체 번역, 관할t 어떤 점 단백질 합성의 시작 (그림 1). 상세 한 80S보다 monosome는 소위 polysom​​es (또는 폴리 리보솜)의 제조시에 동일의 mRNA를 번역 할 수있다. 의 mRNA에 polysom​​es의 밀도는 개시, 신장 및 종료 속도를 반영하고, 따라서 특정 성적 증명서의 번역 가능성의 척도이다. 그러나 polysom​​e 프로필은 주로 개시 단계에서 mRNA의 번역의 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 번역 개시 억제제와 같은 프로 테아 좀 억제제를 사용했습니다. 이 약물을 가진 암 세포의 치료는 번역 개시 인자 eIF2a 3 인산화 HRI라는 스트레스 키나아제의 활성화에 의해 특징 스트레스 반응을 유도한다. eIF2a의 인산화는 포유 동물 세포 4의 번역 개시의 억제로 이어지는 주요 행사 중 하나입니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa 자궁경부암 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션 (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila 배아 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션(버지니아주 매나사스; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">배양 배지 및 보충제</td></tr><tr><td>슈나이더' s Drosophila 중간</td><td>시그마-알드리치</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>생명 기술</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>피셔 과학자</td><td>과학자 SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">자당 용액</td></tr><tr><td>D-수크로오스</td><td>피셔 사이언티스트</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>피셔 사이언티스트</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">용해 버퍼</td></tr><tr><td>트리스 HCl</td><td>피셔 사이언티스트</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>테크니사이언스</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase 억제제 (RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제)</td><td>생명 기술</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티프로테아제 (완전, 미니, EDTA 무료)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA 추출</td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>생명 기술</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페놀 : 클로로포름</td><td>피셔 과학자</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 과학자</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>아크로스 유기물</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">항체</td></tr><tr><td>anti-FMRP 항체</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

mRNA의 번역의 정확한 제어는 특히 생리 학적 및 병리학 적 스트레스에 대한 응답으로, 진핵 세포의 항상성을 위해 필수적입니다. 이 프로그램의 변경은 암 발달의 특징, 또는 신경 퇴행성 질환에서와 같이 조기 세포의 죽음에 손상된 세포의 성장으로 이어질 수 있습니다. 병진 제어를위한 분자 기초 관련된 알려진 정보의 대부분은 밀도 구배 분별 시스템을 사용 polysom​​e 분석으로부터 수득되었다. 이 기술은 선형 자당 기울기에 세포질 추출물을 원심 분리에 의존합니다. 스핀이 완료되면, 시스템은 다른 번역에 대응하는 원심 분리 영역 분별하고 정량화 따라서 polysom​​e 프로파일의 결과 인구 리보솜 허용한다. polysom​​e 프로파일의 변화는 스트레스의 여러 유형에 대한 응답으로 발생 번역 개시의 변화 또는 결함을 나타내는 수 있습니다. 이 기술은 또한 일을 평가 할 수 있습니다전자 번역 개시에 특정 단백질의 역할, 특정의 mRNA의 번역 활동을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 정상 또는 스트레스도 성장​​ 조건에서 진핵 세포와 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 polysom​​e 프로파일을 수행하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

전술 한 바와 같이, polysome 프로필은 스트레스 조건 하에서 번역 개시의 변화의 분석. 한 이전 번역 개시 복합체의 정렬 어셈블리를 포함하는 다단계 공정되는 바와 같은 번역 개시의 개략적 인도 허용한다. 정상적인 성장 조건에서 번역 개시 복합체는 그 검출 polysome 프로파일에 의해 활성 번역 개시 (; 처리되지 않은 그림 2)에 대한 증명 폴리 리보솜으로 변환됩니다. 스트레스 조건에서하지만, 번역 개시는 80S monosomes의 축적과 polysome 피크의 감소 (, 프로 테아 좀 억제제 그림 2)의 결과로 차단됩니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51164/51164fig1highres....

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

이 절차의 전반적인 목표는 폴리솜 프로파일링을 통해 포유류 세포 및 조직의 번역 개시와 스트레스 조건의 영향력을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 포유류 암세포를 항암제로 처리한 후 세포 추출물을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 수크로스 구배를 만드는 것입니다.다음으로, 세포 추출물을 수크로스 기울기(sucrose gradient)에 로딩하고 초원심분리하여 리보솜 분획을 분리합니다. 최종적으로, 특정 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 테스트 대상 단백질과 폴리솜(polysome)의 결합 상태를 평가합니다. 대사 표지법(metabolic labeling)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 스트레스 조건이 번역의 개시 단계에 미치는 영향을 평가할 수 있다는 점입니다.이 방법은 항암제가 번역 개시에 영향을 미치는지 여부와 그 방식과 같이 스트레스 치료 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 함의는 번역 개시의 새로운 조절 경로를 밝히는 데 도움을 주기 때문에 암 치료로까지 확장됩니다. 이 방법은 세포 배양에서의 번역 개시 조절에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 뇌와 종양을 포함한 분리된 조직과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.자동 밀도 구배 분획 시스템을 준비하기 위해, 먼저 장치의 튜브 시스템을 0.1% SDS로 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 튜브 시스템을 70% ethanol로 5분 동안 세척하고, 이어서 RNA Zap 용액으로 5분 동안 세척합니다. 마지막으로, DEPC-treated water로 세척한 후 시스템에 공기를 펌핑하여 튜브 시스템을 건조합니다.다음으로, ISCO model one 60 gradient former를 사용하여 15% 및 55% sucrose 용액을 준비하고 15%에서 55%까지의 선형 sucrose gradient를 생성합니다. 제조사의 지침에 따라, gradient maker 프로그램이 실행되는 동안 gradient 내에 기포나 난류가 발생하는 것을 방지하기 위해 tris 연동 펌프(peristaltic pump)의 속도를 주의 깊게 조절하는 것이 중요합니다. 초원심분리기를 4 °C로 냉각하십시오. 사용 전까지 gradient를 4 °C로 유지하십시오. 본 실험에서는 이전에 도말하여 80% confluence에 도달한 low passage HeLa cervical cancer cells를 사용합니다.실험 당일, 신선한 세포에서 추출물을 얻고 이 과정에서 RNA 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 항암제를 첨가하기 90분 전에 세포의 배지를 신선한 완전 배지로 교체하십시오. 번역을 촉진하기 위해 세포를 다시 인큐베이터로 옮기십시오.대조군으로 항암제를 세포 배양액에 직접 첨가합니다. DMSO와 함께 37°C, 5% CO₂ 조건에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 플레이트를 얼음에 놓은 다음 차가운 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 최상의 결과를 얻으려면 1 mL의 용해 버퍼(lysis buffer)로 세포를 회수하십시오. 각 실험 조건당 약 1,200만 개의 세포를 사용하십시오.스크레이핑한 플레이트의 세포를 에펜도르프 튜브로 옮기고, 시린지를 통해 15회 통과시켜 잘 섞어줍니다. 세포 용해물을 얼음 위에서 15분 동안 방치합니다. 다음으로, 슬라이드 글라스 위에 세포 용해물을 몇 방울 떨어뜨리고 10배 대물렌즈를 이용한 위상차 현미경으로 세포 용해 여부를 확인합니다.세포 용해가 확인되면, 4°C에서 11,000 Gs로 20분 동안 원심분리하여 세포 용해물을 청징화합니다. 폴리리보솜(polyribosomes)이 포함된 가용성 용해물을 새 튜브로 옮기고, 세포질 추출물을 수크로스 밀도 구배에 로딩하기 전까지 얼음 위에 보관합니다. 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고, 추출물 약 20 OD 260 단위를 15~55% 수크로스 구배 위에 조심스럽게 천천히 로딩합니다.원심분리 중 튜브가 넘치는 것을 방지하기 위해 튜브 표면에 2~3 mm의 여유 공간이 있는지 확인하십시오. 튜브를 로터에 장착합니다. 로터를 초원심분리기에 거치하고, 4 °C에서 230,000 Gs로 2시간 30분 동안 농도 구배를 원심분리합니다.원심분리가 완료되면 튜브를 꺼내어 농도 구배가 흐트러지지 않도록 주의하며 얼음에 배치하십시오. 세포질 추출물의 분별을 시작하려면, 수크로스 농도 구배를 자동 밀도 분별 시스템에 넣고 제조사에서 설명한 대로 자동 분별 및 분획 수집을 진행하십시오. 농도 구배 분별 작업과 병행하여 250 nm에서의 흡광도를 지속적으로 모니터링하면서 각 0.5 mL 분획을 개별 einor 튜브에 수집하십시오. 각 실행이 끝날 때 폴리리보솜 프로파일이 차트 용지에 기록될 것입니다.수집된 분획이 담긴 eend 튜브를 얼음 위에 옮깁니다. 이 절차를 시작하려면, 수집된 각 분획에 2배 부피의 100% 차가운 ethanol을 첨가하고, RNA 단백질 복합체가 -20 °C에서 하룻밤 동안 침전되도록 둡니다. 단백질 추출을 위해, 70% ethanol로 세척한 후 각 RNA 단백질 침전물을 4 °C에서 11,000 Gs로 20분 동안 원심 분리하고, 공기 건조 후 침전물을 재현탁합니다.SDS-PAGE 시료 완충액. RNA 추출을 위한 웨스턴 블롯 분석을 진행하기 전에, 각 RNA 단백질 침전물을 0.1% SDS가 포함된 용해 완충액에 현탁하고, 2 mg/mL Proteinase K로 침전물의 단백질 성분을 30분 동안 소화시킵니다. 55 °C 항온수조에서 페놀-클로로포름 1부피, 클로로포름 2부피 및 2 M sodium acetate (pH 4) 0.1부피를 첨가합니다. 이를 얼음 위에서 15분 동안 방치합니다.4°C에서 10,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 각 샘플의 상층액을 수집하고, 1배 부피의 isopropanol과 0.2 µg/µL의 glycogen을 첨가한 후 -20°C에서 하룻밤 동안 보관하여 RNA를 침전시킵니다. 다음 날, 침전물을 4°C에서 10,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 70% cold ethanol로 RNA 펠렛을 세척한 후, 소량의 RNAse-free water에 RNA 펠렛을 재현탁합니다. 분광광도계를 사용하여 RNA의 양과 질을 평가합니다.여기에 세포질 추출물로부터 얻은 대표적인 폴리솜 프로파일이 제시되어 있습니다. 정상 조건에서 배양하거나 프로테아좀 억제제로 4시간 동안 처리한 HeLa 세포로 준비하였으며, 15~55% 부피-중량 선형 수크로스 구배를 통해 원심분리를 수행하였습니다. 각 프로파일에서 40S 리보솜, 60S 리보솜, 80S 모노솜 및 폴리솜의 위치가 표시되어 있습니다.그래디언트의 상단부터 하단까지의 분획이 왼쪽에서 오른쪽으로 표시되어 있으며, 각 분획을 수집하여 거대 리보솜 L 28 단백질과 정상 성장 조건에서 폴리솜 무결성의 대조군 역할을 하는 폴리솜 결합 단백질 FMRP에 대한 항체를 이용해 웨스턴 블롯으로 분석하였습니다. 번역 개시 복합체는 폴리리보솜으로 전환되며, 여기서 관찰된 바와 같이 폴리솜 프로파일링을 통한 폴리리보솜 검출은 활발한 번역 개시가 일어나고 있음을 나타냅니다. 프로테아좀 억제제 처리 시 폴리솜 피크가 감소함과 동시에 80S 모노솜이 증가하는데, 이는 번역 개시가 억제되었음을 의미합니다. 본 절차를 수행할 때, RNA 분해 효소가 없는 환경에서 작업하고 그래디언트를 주의 깊게 다루며 세포 용해를 제어하는 것이 중요합니다.특정 단백질이나 mRNA의 폴리솜 결합이 항암제 투여 후 어떻게 영향을 받는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 웨스턴 블롯(western blot) 및 노던 블롯(northern blot)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 번역 조절 분야의 연구자들이 암 및 신경퇴행성 질환과 같은 인간 질병에서 번역 개시 인자 조절의 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

이 프로토콜은 결합된 리보솜의 수를 기준으로 식물 조직에서 전사체를 추출하고 분획하는 쉬운 방법을 설명합니다. 이를 통해 translation activity의 전반적인 추정치와 특정 mRNA의 translational status 결정을 수행할 수 있습니다.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.

Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

여기에 제시된 프로토콜은 리보솜과 관련된 mRNA인 translatome을 자당 밀도 구배 원심분리 를 통해 애기장대 에서 비폴리솜 및 폴리솜 RNA로 분리하기 위한 폴리솜 프로파일링을 포함합니다. 이 방법은 열 스트레스 애기장대(heat-stressed Arabidopsis)의 번역 효율성을 보여줍니다.

열 스트레스 하에서 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test

배우세요 포리솜 프로파일링을 이용한 스트레스 조건에서 포유류 세포의 번역 개시 분석 방법을. 초당심 분리와 웨스턴 블롯으로 번역 활성을 평가하여 암 치료 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

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