감소 이트라코나졸의 농도와 지속 시간은 치료의 성공

이 절차의 전반적인 목표는 항진균 화학요법제인 triazole을 사용하여 양서류 키트 곰팡이인 Bera key tridium, dendro, he 또는 BD에 감염된 양서류를 치료하는 것입니다. 이는 먼저 BD 배양물을 성장시키고 동물에 곰팡이 병원균을 접종함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 피부 스왑에 대해 DNA 추출 및 QPCR을 실시하여 동물의 BD 감염 여부를 확인하는 것입니다.

다음으로, 감염된 동물들을 0.0025% econazole 용액에 하루 5분씩 6일 동안 침지시켜 치료합니다. 마지막 단계는 치료 완료 후 최소 4주 동안 피부 스왑에 대해 QPCR 분석을 수행하여 치료된 동물의 감염 상태를 모니터링함으로써 치료가 성공적으로 이루어졌는지 확인하는 것입니다. 이 절차는 항진균제 itraconazole의 농도를 낮추고 치료 기간을 단축해도 bd 감염 동물 치료에 효율적임을 보여줍니다. 11일 동안 0.01% itraconazole 용액을 사용하는 권장 치료 용량보다 이 치료 요법을 사용했을 때의 주요 장점은, 권장 용량의 4분의 1로 낮춘 농도와 6일로 단축된 치료 기간만으로도 BD 감염을 효과적으로 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 권장 치료 용량 사용 시 발생하는 부정적인 부작용을 최소화할 수 있다는 점입니다.

본문 프로토콜에 기술된 대로 tritone 배지에서 BD를 배양하고 Zo 포자의 움직임을 확인한 후, 각 플레이트에 노후 수돗물 5 mL를 가득 채우고 Zo 포자가 배지로 들어갈 수 있도록 10분 동안 기다립니다. 다음으로, Zo 포자 현탁액을 휴대용 용기에 붓습니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 Zo 포자 농도를 추정한 후, 노후 수돗물로 혼합액을 3 mL당 1×10⁶개의 농도로 희석하여 여기 보이는 Latoria vei Alpina와 같은 동물에 접종합니다.

50 mL 용기 위에 잡고 접종 혼합물 3 mL를 복부 위에 붓습니다. 그런 다음 접종액이 흘러내린 용기 안에 동물을 넣습니다. 용기에 뚜껑을 덮고 감염이 확실히 이루어지도록 접종 용기 안에 동물을 24시간 동안 둡니다.

BD 병원체에 의한 오염을 방지하기 위해, 사용한 장갑을 벗어 폐기 전 오토클레이브 멸균 처리합니다. 새 장갑을 착용한 후, 다음 동물에게 접종을 진행합니다.

접종 24시간 후, 동물들을 각각 소독된 사육장으로 옮겨 2주 동안 유지합니다. 2주 후 용액을 10% bleach 농도로 만들어 모든 액체 폐기물을 폐기 전 반드시 소독해야 함을 유의하십시오. 멸균 면봉으로 동물을 스와빙하여 BD 감염 성공 여부를 테스트합니다.

면봉을 긋는 동안과 긋는 사이사이에 부드럽게 회전시킵니다. 복부 양측, 각 허벅지, 그리고 4개의 사지 각각을 5회씩 닦아 총 45회 스와빙을 수행합니다. 면봉은 1.5 milliliter 마이크로 튜브에 담아 -20 °C에서 보관합니다.

시판되는 DNA 분리 키트를 사용하여 면봉에서 게놈 DNA를 추출하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 QPCR을 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 itraconazole의 세 가지 투여량 각각에 해당하는 세 개의 처리 수조를 준비합니다. 다음으로, 소독된 수조에 양서류를 개별적으로 넣습니다.

35 mL의 처리 용액이 담긴 50 mL 캔 용기를 준비합니다. 동물 개체 사이에 장갑을 교체하는 것을 잊지 말고, 용기를 가끔씩 부드럽게 흔들어 동물이 5분 동안 완전히 잠겨 있도록 합니다. 5분 후, 동물을 소독된 구역으로 되돌려 놓습니다.

5분간의 처리를 5일 더 매일 반복합니다. 처리가 끝난 일주일 후와 이후 4주 동안 매주 한 번씩 동물들을 다시 검사하여 감염이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 처리가 완료된 후에도 해당 동물들은 여전히 오염 위험이 있는 것으로 간주하여 취급해야 함에 유의하십시오.

감염 후 최소 한 달 동안은 동물들을 별도의 구역에 격리하여 보관해야 합니다. 치료가 성공적이지 않은 경우, 치료를 반복해야 합니다. 종과 생애 단계에 따라 감염 및 치료 요법에 대한 반응이 서로 다르므로, 광범위하게 시행하기 전에 치료법에 대한 시험을 거쳐야 합니다.

BD는 생물학적 위험 물질이므로, 매주 테라리움과 처리 용기를 10% 표백액 용액에 담가 개별 테라리움을 소독하십시오. 최소 30초 동안 담근 후, 물로 두 번 헹구어 표백액을 씻어내고 용기를 24시간 동안 건조시킨 후 개구리를 다시 투입하십시오. 여기에서는 BD 처리 11일 후 또는 BD 처리 6일 후의 모습이 제시되어 있습니다.

검은색 화살표는 치료 마지막 날을 나타냅니다. 실선은 대조군의 생존율을 나타냅니다. 검은색 실선은 BD 양성이었으나 BD 치료를 받지 않은 동물을 나타냅니다.

그리고 실선 회색선은 BD 음성이며 BD 치료를 받지 않은 동물들을 나타냅니다. 점선은 표시된 농도의 econazole을 투여받은 치료군의 생존율을 보여줍니다. 6일 동안 0.0025% 농도로 네뷸라이저 치료를 받은 모든 동물은 치료 종료 4주 후 BD 음성으로 판명되었으며, 따라서 이 치료는 성공적인 것으로 간주되었습니다.

또한, 이 용량의 econazole 처리군은 BD 양성 대조군과 비교했을 때 사망률에서 유의미한 차이를 보이지 않았습니다. 0.01% 및 0.005% econazole로 11일 동안 처리했을 때는 BD 양성 대조군에 비해 사망률이 유의미하게 증가했다는 점에 유의하십시오. 진균 병원체인 BD는 생물학적 위험 물질이므로 장갑 착용 및 교체, 모든 고체 폐기물의 오토클레이브 멸균 및 소독과 같은 생물안전 주의사항을 반드시 준수하시기 바랍니다.

본 절차를 수행할 때 모든 액체 폐기물 처리를 실시해야 합니다.