의 정렬

이 절차의 전반적인 목표는 대입자 COPA 유세포 분석기를 사용하여 사상균 스트렙토미세스(streptomyces)에 의해 형성된 균사체 펠렛을 크기별로 분류하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 박테리아 균주를 배양하고 후속 샘플링을 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 COPA를 통해 샘플 균주를 측정합니다.

그 다음 데이터는 인실리코(in silico)로 분석되며, 균사 펠렛은 사용자가 정의한 매개변수에 따라 분류됩니다. 궁극적으로 이러한 분석은 펠렛 크기의 불균일성을 추가로 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 스트렙토미세스(streptomyces)에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 사상균과 같은 다른 생물체에도 적용 가능하며, 본 실험실의 박사 과정 학생인 MaRous Petrus가 이 절차를 시연하겠습니다.

먼저, 각 세균 시료를 위해 금속 코일 스프링이 장착된 멸균 250 milliliter 삼각 플라스크에 100 milliliters의 효모 추출물 말트 추출물 배지와 0.2 milliliters의 2.5 molar 염화마그네슘을 넣어 배양합니다. 그 다음, 각 플라스크에 1 × 10⁸ 개의 streptomyces 포자를 접종하여 1 × 10⁶ spores/milliliter의 포자 농도를 맞추고, 30 °C에서 180 RPM으로 진탕 배양합니다. 2일 후, 플라스크를 가볍게 흔들어 세포를 균일하게 분산시킨 상태에서 멸균 5 milliliter 피펫을 사용하여 각 배양액에서 5 milliliter의 시료를 채취합니다.

그 다음 각 시료를 개별 15 milliliter 원추형 튜브에 분배합니다. copus 분석으로 시료를 평가하려면, copus plus 펌프 컴퓨터와 488 nanometer 아르곤 레이저가 켜져 있는지 확인한 후 bio source 소프트웨어를 엽니다. 시스액 병이 가득 차 있고 폐액 병이 비어 있는지 확인한 다음, start and run을 클릭합니다.

약 60초 후에 488 nanometer argon 레이저를 대기 상태에서 켜짐 상태로 전환하면 레이저가 준비됩니다. '완료'를 클릭한 다음 압력계를 확인하십시오. '압력' 옆의 체크박스를 클릭하십시오.

시스템이 플로우 셀을 프라이밍한 후, 지연 설정값이 11인지, 너비 설정값이 7인지 확인하십시오. 임계값은 신호의 경우 50으로, 최소 비행 시간의 경우 40으로 설정하십시오. 그런 다음 샘플 컵에서 남은 물을 제거하십시오.

PBS 약 50 milliliters를 넣은 다음, strep demy 샘플 중 하나 0.1 milliliter를 컵에 넣습니다. 컵이 제대로 닫혔는지 확인하고 acquire를 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 최소 2,500 events가 수집되었을 때 초당 30에서 50 events 사이가 되도록 유속을 조절합니다.

클릭하고 정지시킨 다음, 저장하여 이후의 통계 분석을 위해 각 샘플의 박테리아 펠릿을 분류할 데이터를 저장합니다. 먼저 분류 한계를 설정하고 최소 및 최대 비행 시간(time of flight) 값에 대한 세부 정보를 입력합니다. 또는 영역을 선택한 다음 게이트 영역을 정의하여 원하는 크기와 특성을 가진 펠릿을 선택할 영역을 생성합니다.

분리 파라미터에 부합하는 펠릿을 수집하기 위해 50 milliliter 튜브를 배치합니다. 그다음 분리할 펠릿의 수를 설정하고, 선택한 파라미터에 따라 분리하도록 수동 분리를 클릭합니다. 분리가 완료되면 남은 샘플을 제거하고 샘플 컵을 물로 두 번 헹굽니다.

코퍼스를 종료하기 전에 샘플 컵을 70% ethanol로 세척하십시오. 이제 시스템을 두 번 가동합니다. 한 번은 염소화된 물로, 다른 한 번은 일반 물로 가동한 후 오버플로우 컨테이너를 비우십시오. 세척 후, 정지 버튼을 클릭하여 시스템의 압력을 해제하십시오.

모터가 정지하면 프로그램을 종료하고 퍼징(purging) 없이 셧다운(shut down)을 클릭하십시오. 그런 다음 컴퓨터, copa, 레이저 및 펌프를 끄십시오. streptomyces 형태의 균사체 펠릿과 액체 배양물은 크기가 매우 다양합니다.

펠렛 크기 분포를 분석하기 위해, 액체 배지에서 2일 동안 배양한 streptomyces cila color 배양액을 1mm 노즐이 장착된 copus plus profiler를 사용하여 대형 입자 유세포 분석법으로 분석하였습니다. 여기 전형적인 copus 출력 산점도가 제시되어 있습니다. x축은 비행 시간을 나타냅니다.

입자의 크기가 클수록 레이저 빔을 통과하는 시간이 더 오래 걸립니다. Y축은 소광도를 나타내며 이는 대상의 광학 밀도를 의미하고, 각 점은 레이저 빔을 통과하는 개별 펠릿 하나에 대응합니다. 데이터 지점들을 히스토그램으로 도식화한 결과, 이 대표 샘플의 크기는 정규 분포를 따르지 않는 것으로 나타났습니다.

분포는 로그 값 기준 오른쪽으로 치우친 것으로 나타났습니다. 데이터셋을 변환한 후에도 정규 분포로 이어지지 않았기에, 크기 분포가 두 개의 정규 분포 혼합으로 설명될 수 있는지 평가하기 위해 데이터를 수학적으로 모델링하였습니다. 모델링 결과, 전체 펠릿의 92%를 차지하는 평균 크기 248 micrometers의 작은 펠릿 집단과 전체 펠릿의 8%를 차지하는 평균 크기 319 micrometers의 큰 펠릿 집단이 있음이 실제로 확인되었습니다.

여기 대형 및 소형 펠릿 집단에서 분류된 마이크로 콜로니의 대표적인 분석 결과가 제시되어 있습니다. 두 집단의 평균 펠릿 크기를 사용하여 분류 경계를 정의함으로써, 두 크기 분포의 중첩 부분에서 펠릿이 분류되는 것을 제한하였습니다. 248 µm보다 작은 펠릿은 소형 펠릿 집단으로 간주하였고, 319 µm보다 큰 펠릿은 대형 펠릿 집단으로 간주하였습니다. 분류된 펠릿의 현미경 분석을 통해 이 절차 이후 이들의 크기가 뚜렷하게 구분됨을 확인하였습니다.

이러한 이질성의 근본적인 메커니즘을 밝히기 위해 차세대 염기서열 분석이나 단백질 체학(proteomics)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.