의 정렬 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 셀 펠렛

이 절차의 전반적인 목표는 대형 입자 COPA 유세포 분석기를 사용하여 필라멘트 스트렙토마이세스에 의해 형성된 균사체 펠릿을 크기에 따라 분류하는 것입니다. 이것은 먼저 원하는 박테리아 균주의 성장과 후속 샘플링에 의해 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 coppa로 샘플 변형률을 측정합니다.

그런 다음 데이터는 인실리코(in silico)로 분석되고 균사체 펠릿은 사용자 정의 매개변수에 따라 분류됩니다. 궁극적으로 이러한 분석은 펠릿 크기의 이질성을 추가로 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 스트렙토마이세스에 사용할 수 있지만 사상균과 같은 다른 유기체에도 적용할 수 있으며, 이 절차는 우리 연구실의 박사 과정 학생인 MaRous Petrus

먼저, 각 박테리아 샘플에 금속 코일 스프링이 장착된 1개의 멸균 250ml 삼각 플라스크에 100ml의 효모 추출물, 맥아 추출물 배지 및 0.2ml의 2.5몰 염화마그네슘을 첨가하여 배양물을 성장시킵니다. 그런 다음 각 플라스크에 스트렙토마이세스 포자 8개에 10을 1씩 접종하여 밀리리터당 6개의 포자에 10의 포자 농도를 얻고 180RPM으로 진탕하면서 섭씨 30도에서 박테리아를 성장시킵니다. 이틀 후, 멸균 5ml 피펫을 사용하여 각 배양액에서 5ml 샘플을 채취하면서 플라스크를 부드럽게 흔들어 세포가 고르게 분포되도록 합니다.

그런 다음 각 샘플을 개별 15ml 원추형 튜브에 분주합니다. 코퍼스 분석으로 샘플을 평가하려면 코퍼스 플러스 펌프 컴퓨터와 488 나노미터 아르곤 레이저가 켜져 있는지 확인한 다음 바이오 소스 소프트웨어를 엽니다. 칼집 액체 병이 가득 찼고 폐기물 병이 비어 있는지 확인한 다음 시작 및 실행을 클릭합니다.

약 60초 후에 488나노미터 아르곤 레이저를 대기 상태에서 켜기로 전환하면 레이저가 준비된 것입니다. 클릭, 완료 및 압력 게이지를 확인합니다. pressure 옆에 있는 확인란을 클릭합니다.

그런 다음 시스템이 플로우 셀을 프라임한 후 지연 설정이 11이고 너비가 7인지 확인합니다. 신호의 경우 임계값을 50으로, 최소 비행 시간의 경우 40으로 설정합니다. 그런 다음 샘플 컵에서 남은 물을 제거합니다.

PBS 약 50ml를 넣은 다음 연쇄구균 데미 샘플 중 하나를 0.1ml씩 컵에 넣습니다. 컵이 제대로 닫혔는지 확인한 다음 획득을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 최소 2, 500개의 이벤트가 수집된 경우 초당 30개에서 50개 사이의 이벤트를 얻을 수 있도록 흐름 속도를 관리합니다.

클릭, 중지 및 저장하여 각 샘플에 대한 박테리아 펠릿을 분류하기 위한 후속 통계 분석을 위해 데이터를 저장합니다. 먼저 정렬 한계를 설정하고 최소 및 최대 비행 시간 값에 대한 세부 정보를 입력합니다. 또는 영역을 선택한 다음 게이트 영역을 정의하여 원하는 치수와 속성을 가진 펠릿을 선택하기 위한 영역을 만듭니다.

50ml 튜브를 배치하여 분류 매개변수를 충족하는 펠릿을 수집합니다. 그런 다음 정렬할 펠릿 수를 설정하고 수동으로 정렬을 클릭하여 선택한 매개변수를 정렬합니다. 분류 후 남은 샘플을 제거하고 샘플 컵을 물로 두 번 헹굽니다.

copus를 종료하기 전에 70% 에탄올이 함유된 샘플 컵을 청소하십시오. 이제 시스템을 두 번 실행합니다. 한 번은 염소 처리 된 물로, 한 번은 일반 물로 오버 플로우 용기를 비우십시오 청소 후 중지를 클릭하여 시스템의 압력을 해제하십시오.

모터가 멈추면 프로그램을 닫고 퍼지하지 않고 종료를 클릭합니다. 그런 다음 컴퓨터, 코파, 레이저 및 펌프 스트렙토마이세스 폼을 끕니다. 다양한 크기의 균사체 펠릿 및 액체 배양물.

펠릿 크기 분포를 분석하기 위해 2일 된 액체에서 자란 스트렙토마이세스 실라 색상 배양에 1mm 노즐이 장착된 copus plus 프로파일러를 사용하여 큰 입자 유세포 분석을 수행했습니다. 여기에서는 일반적인 copus output 산점도가 표시됩니다. x축은 비행 시간을 나타냅니다.

항소가 클수록 레이저 빔을 통과하는 데 시간이 더 오래 걸립니다. Y축은 물체의 광학 밀도를 나타내는 소멸을 나타내며, 의 각 점은 레이저 빔을 통과하는 단일 펠릿에 해당합니다. 데이터 점을 히스토그램으로 그리면 이 대표 표본의 크기가 정규 분포를 따르지 않았음을 나타낼 수 있습니다.

분포가 올바른 로그로 치우친 것으로 보입니다. 또한 데이터 세트를 변환해도 두 개의 정규 분포가 혼합되어 있다고 가정하여 크기 분포를 설명할 수 있는지 여부를 평가하기 위한 정규 분포로 이어지지 않았으며, 데이터는 수학적으로 모델링되었습니다. 모델링은 실제로 평균 크기가 248마이크로미터인 모든 펠릿의 92%로 구성된 작은 펠릿 개체군과 평균 크기가 319마이크로미터인 모든 펠릿의 8%로 구성된 큰 펠릿 개체군을 나타냈습니다.

여기에는 큰 펠릿 개체군과 작은 펠릿 개체군에서 분류된 마이크로 콜로니의 대표적인 분석이 표시됩니다. 두 모집단의 평균 펠릿 크기는 두 크기 분포의 겹치는 부분에서 펠릿의 정렬을 제한하기 위해 정렬을 위한 경계를 정의하는 데 사용되었으며, 248마이크로미터보다 작은 펠릿은 작은 펠릿 개체군에서 온 것으로 간주되는 반면, 319마이크로미터보다 큰 펠릿은 큰 펠릿 개체군에서 나온 것으로 간주되었습니다. 분류된 펠릿의 현미경 분석은 이 절차에 따라 뚜렷한 크기를 확인했습니다.

차세대 염기서열분석 또는 단백질체학(proteomics)과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 이질성의 기본 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.