Name: 의 정렬 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 셀 펠렛 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 Streptomyces 균사 펠렛을 COPA 대형 입자 유세포 분석기로 크기별 정렬하는 방법을. 이 고처리량 기술은 생장 이질성을 연구하고 다른 실사균에도 적용할 수 있습니다.

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이틀 된 액체 성장 문화 종류의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 알약을 분석하는 절차를 개략적으로 그림 1에 표시됩니다. 방법에 대한 세부 정보는 다음과 같습니다. 1. (미디어 및 버퍼의 준비 포함) 성장 <ol><li> 배 인산염 완충 생리 식염수 1 L 준비 (PBS를, 80g의 NaCl, 2g의 KCl, 14.4 g 2 HPO 4, pH를 7.4로 조정 증류수 1 L에 2.4 g의 KH 2 PO 4 나). 사용시 PBS의 1 L를 얻기 위해 증류수 900 ml로 10 배 PBS 100 ㎖를 추가합니다. </li><li> YEME 매체의 1 L를 준비 (3g 디프 효모 추출물, 5g 박토 펩톤, 3g Oxoid 맥아 추출물, 10g 포도당, 340g의 자당, 1 L에 증류수까지) 및 2.5 M MgCl2를 100 ㎖. 고압 증기 멸균하여 두 솔루션을 소독. 다른 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 미디어 4,14를 사용할 수 있습니다. </li><li> 100 ㎖의 YEME 매체 및 0.2 ml의 2.5 M MgCl2를 추가멸균 된 250 ㎖의 삼각 플라스크 금속 코일 스프링을 탑재. 공부하는 세균 샘플만큼 플라스크를 준비합니다. </li><li> 106 포자 / ㎖의 포자 농도를 구하는 스트렙토 10 8 포자 각 플라스크에 접종한다. 180 rpm으로 흔들어 동안 30 ° C에서 2 일 동안 박테리아를 성장. </li></ol> 2. 샘플링 <ol><li> 멸균 5 ML 피펫을 사용하여 15 ML 팔콘 튜브에 각 문화에서 5 ㎖ 샘플을 전송합니다. 샘플은 전체 문화를 대표하도록 샘플을 복용하는 동안 부드럽게 진탕 배양. </li><li> 샘플 COPAS 즉시 분석하는 경우에는 샘플 준비 단계를 수행 할 필요가 없습니다. 얼음에 샘플을 유지하고이 프로토콜의 3.1 단계로 진행합니다. 샘플은 이후 시점에서 분석 할 때, 단계 2.3-2.5이 프로토콜에 설명 된 펠릿을 고정한다. 제대로 분석가 후 청소하지 않을 경우 고정도 튜브 시스템에서 박테리아의 성장을 방지합니다에스. 포름 알데히드는 다운 스트림 분석을 방해하지 않습니다와 그 고정을 확인합니다. 예를 들어, RNA는 포름 알데히드로 고정 후 곰팡이 알약에서 분리 할 수​​ 없습니다. 대조적으로, RNA 성공적 70 % 에탄올 (12)와 고정 후 단리 하였다. </li><li> 샘플 5 ㎖에 37 %의 포름 알데히드 600 μl를 추가하고 튜브 배를 반전 섞는다. 30 분 동안 얼음에 샘플을 고정합니다. </li><li> 원심 분리기 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 회 전자에 2,500 XG에 샘플. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 PBS의 5 ㎖로 알약을 씻으십시오. </li><li> 펠렛은 PBS 2 배로 세척 그래서 2.4 단계를 반복합니다. 샘플은 몇 주 동안 4 ° C에서 PBS에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. COPAS 분석 <ol><li> COPAS 플러스, 펌프, 컴퓨터와 488 nm의 아르곤 레이저가 켜져 있고 Biosort 소프트웨어를 시작하고 있는지 확인하십시오. 켜져 있지만, 레이저는 여전히 대기 잠정 될 것이다. </li><li> 칼집 유체 병이 가득하고 있는지 확인폐기물 병이 비어 있습니다. </li><li> 에에 대기 모드에서 488 nm의 아르곤 레이저를 전환 한 후 &#39;START&#39;와 &#39;RUN&#39;을 클릭합니다. 레이저가 켜져있을 때 후 약 60 초, &#39;완료&#39;를 클릭합니다. </li><li> 압력 게이지를 확인합니다. &#39;칼집&#39;에 대한 압력은, &#39;샘플&#39;, &#39;분류기&#39;와 &#39;청소&#39;으로 각각 4.0, 0.5, 2.7, 10.9을 읽어야합니다. </li><li> 다음으로 &#39;압력 OK&#39;에 확인란을 클릭합니다. 시스템은 유동 세포를 소수가 사용 준비가 된 것입니다. </li><li> 기본 설정은 11에서 &#39;지연&#39;과 &#39;폭&#39;7 간주됩니다. 임계 값은 시간의 비행을 대표하는 TOF와 함께, &#39;TOF 최소&#39;에 대한 &#39;신호&#39;에 대한 50, 40로 설정되어 있습니다. (완전성에 대한 모든 &#39;이익&#39;이 1로 설정되고, 트리거는 2.50 ㎒의 선택 &#39;스캔 속도를 선택합니다&#39;EXT (소멸)에 그리고 아래의 &#39;설정&#39;탭에서 설정 우연의 일치가 &#39;강화&#39;로 설정되어 있습니다.). </li><li> 샘플 컵에서 남은 물을 제거D 함께 (50 ㎖ 정도) PBS와 단계 2.2 컵 2.5에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 샘플의 0.1 ML를 추가합니다. 확인 샘플 컵이 제대로 닫혀 있습니다. </li><li> 데이터 수집을 시작하려면 &#39;획득&#39;을 클릭합니다. 초당 30 ~ 50 이벤트 사이에서 얻을 흐름 속도를 관리 할 수​​ 있습니다. 흐름이 너무 높으면, 시료 컵에 PBS를 추가한다. 유속이 너무 낮 으면, 더 많은 샘플을 추가한다. </li><li> 적어도 2,500 이벤트는 클릭 &#39;STOP&#39;을 수집합니다. 모든 데이터를 클릭 &#39;스토어&#39;를 저장하고 이후의 통계 분석을 위해 파일을 저장합니다. Biosort 소프트웨어에만. txt 파일은 후속 분석을 위해 사용되는 그중, 네 개의 파일에 데이터를 저장할 것이다. </li><li> 50 ML의 주사기와 물 2 배 세척과 샘플을 제거하여 샘플 컵을 청소합니다. </li><li> 모든 샘플이 분석 될 때까지 반복 3.7-3.10 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> . txt 파일을 열고 (예 : MS Excel 용 사용) (25)보다 낮은 EXT 데이터를 폐기합니다. 이4,12 (아스 페르 길 루스에 니제르 (150)보다 낮은 EXT 모든 데이터가 삭제됩니다) 파편과 느슨한 균사 조각에 해당한다. &#39;. TXT&#39;다음 (: 많은 데이터 파일이에서 사용할 수있는 프로그래밍 언어 R에 자동화 할 수있는 일반에 하나의 컬럼에 파일을 모든 TOFs을 저장 <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> 확인 SciLab은 (버전 5.3.2 이상 버전 http://www.scilab.org/부터)에서 함께 설명서에 사용할 수있는 &#39;fittools&#39;도서관,,,와 함께 설치되어 있는지 확인합니다 : http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual % 20fittools.pdf </li><li> SciLab를 시작하고 데이터를 모델링하는 fittools 라이브러리의 필요한 기능을 실행합니다. 즉 : (한 번만 필요) 사용 설명서에 표시된 fittools 라이브러리를 설치합니다. <ol><li> fittools 라이브러리를로드합니다. </li><li> SciLab로 데이터 ( &#39;. TXT&#39;파일)을 참조하십시오. </li><li>(자연 로그 기본 로그 함수 인) 데이터를 변환 로그. </li><li> 데이터에 2 인구의 모델을 장착한다. </li><li> 히스토그램 및 모델 (옵션)와 함께 그래프를 그린다. </li><li> 데이터 (1000 회 반복)를 부트 스트랩. </li><li> 부트 스트랩 데이터 세트에 모델을 장착한다. </li><li> 신뢰는 5 매개 변수의 추정 구간들 받으세요. 이는 인구, 그들의 2 수단 (μ 1, μ 2) 및 첨부 표준 편차 (α 1, 2 α)의 참여 비율 (P)에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 95 %의 신뢰 구간은 12,13,15를 (1,000 회 반복)를 부트 스트랩 한 후 모델을 재 장비에 의해 결정됩니다. 수단의 신뢰 구간이 중복되지 않고 (P)의 신뢰 구간이 0.025-0.975 사이에서있을 때 데이터 집합은 정규 분포의 두 개체군의 조합으로서 설명 될 수있다. (일을 참고큰 알약의 참여가 1 인 반면 작은 펠릿의 참여 부분에서 p는 것입니다 -. P) TOF 및 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 직경 사이의 관계는 0.57 × TOF + 159 μm의 4 같습니다. </li></ol></li><li> 경우 두 집단은 상부로 COPAS의 매개 변수를 정렬로 사용하는 평균 TOFs을 발견하고 이후 크고 작은 알약을 정렬 하한. 또한 다른 정렬 파라미터는 사용자의 요구에 따라 선택 될 수 있음을주의한다. </li></ol> 5. 펠렛 정렬 <ol><li> 단계 3.7에 설명 된대로 정렬 할 필요가 스트렙토 샘플을로드합니다. </li><li> &#39;제한을 정렬&#39;으로 설정하고 최소 (LO) 및 최대 (HI) TOF 값에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 또한, &#39;지역&#39;다음 원하는 크기 나 특성을 가진 펠릿을 선택하는 &#39;게이트 영역을 정의&#39;를 선택하여 영역을 설정합니다. </li><li> 50 ML 튜브에 배치정렬 매개 변수를 충족 여러 개의 알약을 수집합니다. 다르게는, 마이크로 타이 터 플레이트는 개별 펠렛을 정렬하는데 사용될 수있다. 여러 펠렛 (10 4 -10 5) DNA 및 단백질 추출을 위해 필요합니다. 단일 펠릿은 유전자 발현의 qPCR 분석을 위해 충분하지만, 체류 펠릿 RNA 시퀀싱을 위해 필요하다. </li><li> 결정하고 정렬 할 필요가 알약의 수를 설정하고 선택한 매개 변수에 대한 정렬 정렬 수동 &#39;을 클릭합니다. 펠릿의 설정 량에 도달하면, 자동 정렬이 종료된다. </li><li> 샘플 컵에서 50 ML의 주사기와 샘플을 통해 왼쪽을 제거하고 물 2 배와 컵을 세척한다. 다른 샘플을 정렬 할 필요가있는 경우를 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. </li><li> 종료하기 전에 COPAS 남은 알약을 제거하고 70 % EtOH로 및 / 또는 물에 2 % 차아 염소산 샘플 컵을 청소하기 위해 물을 샘플 컵을 씻어. 전체 시스템을 청소하고, 물이 반복 염소화 물 샘플을 실행. 빈 t그는 용기 청소를 오버플로 또는이 컨테이너에있는 필터를 교체합니다. </li><li> 완료되면, 시스템에서 압력을 해제하는 &#39;STOP&#39;을 클릭합니다. 모터 정지 프로그램을 닫고 &#39;정화하지 않고 종료&#39;를 클릭합니다. 그런 다음 컴퓨터, COPAS, 레이저 및 펌프를 끕니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

클론 인구 6 이질성에 대한 우리의 이해에 기여 단일 세포의 많은 수의 고속 분석을 가능하게했습니다 유동 세포 계측법. 일반 유동 세포 계측법은 streptomycetes 및 곰팡이의 균사 다세포 펠릿의 분석에 적합하지 않습니다. 우리의 작업은 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 높은 처리량 분석 COPAS를 사용 가능한 것을 보여 주었다. 여기에 설명하는 절차는 간단하고, 빠르고, 높은 재현성이다. 기기의 동작시주의해야 할 중요한 매개 변수 (스텝이 프로토콜 3.8) 100 이벤트 / 초를 초과하지 않아야 흐름 속도입니다. 펠릿 농도, 따라서 또한 유속이 너무 높게되면 기기가 개별 펠렛을 감지하지 못하기 때문에, TOF 값이 잘못 계산 될 것이다. 충분히 PBS를 첨가하여 시료를 희석하면이 문제를 극복한다. 제한 COPAS 플러스 사용<html> D 여기에 30-700 μm의에 이르기까지 크기로 입자를 측정하기에 적합하다 1mm의 노즐의 직경을 갖는다. 이 노즐은 따라서 streptomycetes에 의해 형성된 펠릿을 측​​정 할 수 있습니다. 사상균의 경우 마이크로 콜로니 COPAS 플러스의 일반적인 적용 가능성을 제한하는, 더 클 수있다. COPAS XL 크기는 1,500 μm의 최대 입자를 측정 할 수 있지만 직경의 낮은 범위의 감도는 COPAS 플러스에 비해 적습니다. COPAS 플러스 및 COPAS XL 모두 30 μm의보다 작은 입자를 분석 할 수 없습니다. 이것은 개별 미생물 포자 또는 세포를 분석 할 수 없다는 것을 의미한다. 또한, COPAS 정확하게 포자 세포 또는 아주 작은 마이크로 식민지의 작은 집계를 분석 할 수 있습니다. 이 경우, 정규 셀 분석기가 사용되어야한다. 이 제한은 1-1,500 μm의 범위에서 입자를 분석 할 수있는 연합 Biometrica의 Biosorter에 의해 극복된다. 구매 상품 그러나 높다. T &quot;&gt; 문제 해결 COPAS는 조작하기 쉬운 강력한 도구이다. 그러나, 때로는 펠렛 샘플 컵에 샘플을로드하고 측정을 시작하면 검색되지 않습니다. 원인은 일반적으로 쉽게 &#39;깨끗한&#39;명령을 가압에 의해 해결 될 수있는 항목이 막힌 관이다. 이것은 샘플 컵에 다시 튜브 시스템에서 펠릿을 강제 할 것이다. 다른 이유는 뚜껑이 제대로 샘플 컵에 배치되지 않도록 할 수 있습니다. 이것은 압력 손실 및 펠렛을 검출 수반 장애에 이르게한다. 의의 및 향후 방향 우리는 여기에서 펠릿 크기의 분석에 초점을 맞추고 있지만, COPAS 설정도 분석 할 수와 종류의 형광 및 밀도에 기반하고 있습니다. 형광 검출은 GFP로 기자를 기반으로 유전자 발현을 분석하는 가능하게한다. 또한, 세포의 조성물을 평가할 수있다. 더욱 강력한 이러한 매개에 따라 알약을 분리하는 옵션입니다TERS. 정렬 펠릿은 모든 오 믹스 연구 등의 다운 스트림 분석, 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 이전에 60,000 대와 20 만 작은 알약을 정렬하고 프로테옴 크고 작은 펠릿 4 사이에 유의 한 차이 것을 보여 주었다. 이 기술은 따라서 세포 공장으로 streptomycetes을 개선하기 위해 새로운 단서를 제공한다. COPAS 기술의 주요 장점은 시간입니다. 세포 펠렛에 대한 이전의 연구는 현미경을 사용하여 수행하고, 이것은 수백 16 개까지 분석 할 수있는 펠릿의 수를 제한 하였다. 현미경 연구는 이미 액체 성장 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 문화 (16)의 펠릿의 두 집단의 존재를 제안했다. 실제로, 펠렛이 집단은 상이한 streptomycetes 4의 다수에 관계없이 배양 조건의 검출 하였다. 이 크기 이질성은 사상균 streptomycetes에 한정되지 않고, 또한 사상균 12에서 관찰되었다 &lt;/ SUP&gt;. 모든 경우에, 이성의 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 알약을 정렬 할 가능성이 크기와 형광에 따라 이러한 메커니즘을 해명하는 가능하게한다.

Streptomycetes는 사상 토양 아니라 항생제를 만들기 위해 자신의 능력에 대해 알려진 박테리아뿐만 아니라 면역 억제제 나 곰팡이 감염이나 암 1,2을 방지하는 데 사용할 수있는 화합물이다. 또한, 이러한 유기체는 산업 애플리케이션 (3)의 넓은 범위에 대해 관심있는 효소를 생산한다. 이러한 상업적으로 흥미로운 화합물의 대부분은 생물 반응기에서 생산됩니다. 생물 반응기에서 streptomycetes의 성장은 대단히 짧은 시간 또는 펠렛으로 알려진 상호 균사의 복잡한 구조의 형성이 특징입니다. 이러한 다세포 구조는 사이즈 4에 대한 매우 이질적인 및 대장균 또는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 등의 단세포 박테리아보다보다 백만 배 더 큰 크기에 도달 할 수 있습니다. 이성이 자연적인 생물학적 시스템 5에 유리한 특성으로 간주되지만, 그것은 산업의 생산 함정으로 간주됩니다. 바이오원자로 cultivati​​ons가 가장 높은 수율을 얻을 재현하고 제어해야합니다. 생물 반응기에서 펠렛 형태의 각각의 역할의 상세한 이해는 세포 공장 등 streptomycetes을 향상시키는 것이 중요하다. 유동 세포 계측법은 일반적 인구 6에서 개별 세포를 분석하는데 사용된다. 유동 세포 계측기를 동시에 (같은 크기, 밀도 및 다색 형광 등) 세포의 특성을 측정함으로써 multiparametric 정보를 취득 할 수있다. 이러한 방법으로, 세포의 특성을함으로써 우리의 문화 내에서 이질성의 이해와 셀 6의 독특한 집단의 존재에 기여 상관 관계 될 수있다. 보다 전문적인 장비는 사용자 정의 매개 변수에 따라 가능한 세포를 정렬 할 수 만들었습니다. 예를 들어, 돌연변이 검사를 할 수 있습니다. 정렬 후, 이러한 돌연변이 세포가 더 특성화 재배 할 수 있습니다. 이것은 이미 다른 사람의 사이에, 유용한 것으로 입증되었습니다,변종 7,8의 생산성을 향상시킬 수 있습니다. 유동 세포 계측기의 노즐은 일반적으로 약 10 ㎛의 최대 직경이 세포의 통과를 위해 수 있습니다. 따라서 streptomycetes의 펠릿을 일정한 유동 세포 계측기로 분석 될 수 없다. 그러나 이들은 복합 오브젝트 파라미터 분석기 및 분류기 (COPAS)으로 분석 할 수있다. 일정한 흐름 세포 계측기와 마찬가지로 COPAS는 높은 처리량 방식으로 입자의 multiparametric 데이터를 수집 할 수 있습니다. COPAS의 유형에 따라 10-1,500 μm의 입자 크기를 분석 할 수있다. 또, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질의 분리 등의 재배 또는 하류 분석에 사용될 수있는 개별 입자의 선별을 허용한다. COPAS은 초기에 선충 예쁜 꼬마 선충 (9), Drosophila의 배아 및 유충 (10) 작은 다세포 생물의 분석 및 정렬을 위해 설계되었습니다. 악기는 제브라 피쉬 (11)에 사용 된차 사상균 (12, 13)에 대한. 후자의 생물은 사상 박테리아에 의해 형성된 그보다 더 큰 균사체 펠렛을 형성한다. 우리는 최근에 COPAS의 사용도 streptomycetes 4 가능한 것을 증명하고있다. 우리는 여기에 크기에 따라 알약을 정렬하는 방법에 대한 세부 사항을 포함하여, 스트렙토 coelicolor의 펠릿 이질성을 평가하기 위해 COPAS를 사용하기위한 실험 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 펠릿 형성 streptomycetes의 분석에 이용 될 수 있다는 점에 유의하시기 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>COPAS Plus</td><td>Union Biometrica</td><td>PLUS</td><td>레이저 및 소프트웨어를 포함한 대형 입자 유세포 분석기</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>PBS 구성 요소</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>PBS 구성 요소</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>PBS 구성 요소</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td>PBS 성분</td></tr><tr><td>Difco 효모 추출물</td><td>BD Biosciences</td><td>210933</td><td>미디어 성분</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>Media 성분</td></tr><tr><td>옥소이드 맥아 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXLP0039B</td><td>Media 성분</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G8270</td><td>배지 구성 요소</td></tr><tr><td>: 설탕,</td><td>시그마, Aldrich</td><td>S9378</td>, <td>미디어 구성</td></tr><tr><td>요소: MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>미디어 구성 요소. 오토클레이빙 후 추가합니다.</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>펠릿 고정</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71696</td><td>기기 세척용</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20816.367</td><td>기기 세척용</td></tr><tr><td>삼각 플라스크(250ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>214-1132</td><td>스트렙토미세스</td></tr><tr><td>스프링스</td><td>Verenfabriek De Spiraal</td><td>맞춤형</td> 재배용 배양 <td>플라스크 배양 플라스크에 사용됩니다. RVS1.4401/길이 210 mm/지름 17 mm/피치 5 mm</td></tr><tr><td>멸균 원심분리기 튜브(15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>주사기(50 ml)</td><td>Sigma</td><td>Z683698</td><td></td></tr></tbody></table>

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes 효소 및 항생 물질의 생산을위한 산업에서 사용되는 필라멘트 토양 박테리아이다. 생물 반응기에서 재배 할 경우,이 생명체의 크기는 이질적인 펠릿으로 알려진 상호 균사의 네트워크를 형성한다. 여기에 우리가 분석하는 방법을 설명하고 종류 균사체 펠렛은 복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기 (COPAS)를 사용하여. 자세한 설명은 기기와 데이터의 통계적 분석의 기본적인 사용을 나타낸다. 우리는 또한 이러한 RNA 또는 단백질 함량의 분석과 같은 다운 스트림 처리를 가능하게하는 사용자 정의 설정에 따라 펠릿을 정렬 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여 기계 장치 기본 이종 성장에 태클을 할 수 있습니다. 이것은 생산성 펠릿의 크기와 관련이 있다는 사실을 고려하여, 세포 공장으로 streptomycetes 향상을위한 수단이 될 것입니다.

스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛 COPAS 측정 Streptomycetes 사이즈의 넓은 범위가 액체 문화 균사체 펠렛을 형성한다. 펠릿의 크기 분포를 분석하기 위해 2 일된 액체 성장 스트렙토 coelicolor 배양은 1mm의 노즐을 탑재 COPAS 플러스 프로파일 러를 사용 계측법 큰 입자 흐름을 행 하였다. 일반적인 COPAS 출력은 그림 2A 시각화 등의 산점도이다. x-축은 펠릿 크기 (즉,이 레이저 빔을 통과하는 더 큰 펠릿 오래 걸린다)와 상관되는, 비행 시간 형 (TOF)을 나타낸다. y 축은 객체의 광학 밀도를 나타내는 소멸을 보여준다. 산점도에서 각 점은 레이저 광을 통과 한 펠릿 즉, 개별 이벤트에 대응한다. 샘플이 너무 집중되는 때 (레이저는 100 개 이상의 이벤트 / 초를 감지 할 때 예) 중요한 것은, COPAS 자주 개인 (P)을 감지하는 데 실패ellets. 이것은 너무 높은 거짓 TOF 값에 이르게한다. 샘플을 희석하는 것은 더 희석이 더 이상 영향 TOF하지 않습니다 시점까지의 평균 TOF 값을 줄일 수 있습니다. 약 100 펠릿 / 초 분석 때이 점에 도달한다. 히스토그램에 데이터 포인트를 플롯하면 크기는 일반적으로 (그림 2B)를 배포하지 않는 것을 나타냅니다. 분포는 오른쪽으로 기울어 진 것으로 보인다. 데이터 세트를 변환 로그도 정규 분포 (그림 2C)로 연결되지 않았다. 크기 분포는 데이터가 수학적으로 12,15 모델링, 두 정규 분포의 혼합물을 가정하여 설명 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해. 모델링은 참 크기 분포는 펠릿의 두 개의 별개 집단의 존재를 전제로하여 설명 될 수 있다는 것을 나타냈다. 작은 펠릿의 인구는 248 μm의 평균 크기를 가진 모든 펠릿의 92 %로 구성되어있는 동안 큰 화소의 인구(모든 펠릿의 8 %)가 319 μm의 평균 크기를 가지고 (두 집단이 참가 비율은 2.5-97.5 % 사이에있을 때 존재하는 것으로 간주됩니다 참고) 할 수 있습니다. 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 정렬 크고 작은 펠릿의 인구에서 마이크로 콜로니를 분류했다. 이를 위해, 두 집단의 평균 크기는 펠렛 정렬하는 경계를 정의하는 데 사용 하였다. 319 μm의보다 큰 알갱이가 큰 펠릿 인구 (그림 3)에서 간주 된 반면, 두 가지 크기의 중첩 부분에서 펠릿의 정렬 제한 할 수 있도록 248 μm의보다 작은 펠렛은, 작은 펠릿 모집단으로 간주되었다 분포. 정렬 된 펠릿의 현미경 분석은 별개의 크기 (그림 3)을 보여 주었다. 수집 된 펠릿을 추가 DNA, RNA, 또는 단백질 아이솔레이션을 위해 사용될 수있다. &lt;IMG의 고도 = &quot;그림 1&quot;FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot;/&gt; : 콘텐츠 폭 FO = &quot;5 인치&quot; 그림 1. COPAS를 사용하여 스트렙토 펠릿을 측정하고 분석 할 수있는 실험 장치의 도식 표현. 자세한 내용은 실험 절차를 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> 액체 성장 스트렙토 문화 그림 2. 펠렛의 크기 이질성. 2 일 된 S.의 COPAS 분석 coelicolor의 YEME 문화 (A)는 (비행 값을 시간으로 표시) 펠렛의 크기는 일반적으로 배포되지 않음을 나타냅니다D (B) 및도 지도록 때 로그 변환 (C). 대신, TOF에 차이 (따라서 크기) 펠릿의 두 집단이 검출 된 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 그림 3. (파란색으로 표시) 319 μm의보다 큰 크기의 알갱이가 큰 알약으로 간주 된 반면, 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 분류. 펠렛 크기 (분홍색으로 표시)보다 작은 248 μm의는, 작은 알갱이로 간주되었다. 현미경 분석은 사이즈의 차이를 확인 하였다. 이 크기는 TOF와 D 사이의 관계를 설명하여 로그 변환 된 데이터를 통해 계산 한 참고0.57 × TOF + 159 μm의에 해당 스트렙토 펠릿의 iameter은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

액체 성장 스트렙토 배양 크기 이질적인 균사체 펠렛을 특징으로한다. 우리는 여기에서 분석하는 방법을 서술하고 높은 처리량의 방식으로 정렬 펠릿. 이러한 펠릿을 성장 이질성을 이해하고 제어하는​​ 단서를 제공 할 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다.

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

이 절차의 전반적인 목표는 대입자 COPA 유세포 분석기를 사용하여 사상균 스트렙토미세스(streptomyces)에 의해 형성된 균사체 펠렛을 크기별로 분류하는 것입니다. 이는 먼저 원하는 박테리아 균주를 배양하고 후속 샘플링을 수행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 COPA를 통해 샘플 균주를 측정합니다.그 다음 데이터는 인실리코(in silico)로 분석되며, 균사 펠렛은 사용자가 정의한 매개변수에 따라 분류됩니다. 궁극적으로 이러한 분석은 펠렛 크기의 불균일성을 추가로 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 스트렙토미세스(streptomyces)에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 사상균과 같은 다른 생물체에도 적용 가능하며, 본 실험실의 박사 과정 학생인 MaRous Petrus가 이 절차를 시연하겠습니다.먼저, 각 세균 시료를 위해 금속 코일 스프링이 장착된 멸균 250 milliliter 삼각 플라스크에 100 milliliters의 효모 추출물 말트 추출물 배지와 0.2 milliliters의 2.5 molar 염화마그네슘을 넣어 배양합니다. 그 다음, 각 플라스크에 1 × 10⁸ 개의 streptomyces 포자를 접종하여 1 × 10⁶ spores/milliliter의 포자 농도를 맞추고, 30 °C에서 180 RPM으로 진탕 배양합니다. 2일 후, 플라스크를 가볍게 흔들어 세포를 균일하게 분산시킨 상태에서 멸균 5 milliliter 피펫을 사용하여 각 배양액에서 5 milliliter의 시료를 채취합니다.그 다음 각 시료를 개별 15 milliliter 원추형 튜브에 분배합니다. copus 분석으로 시료를 평가하려면, copus plus 펌프 컴퓨터와 488 nanometer 아르곤 레이저가 켜져 있는지 확인한 후 bio source 소프트웨어를 엽니다. 시스액 병이 가득 차 있고 폐액 병이 비어 있는지 확인한 다음, start and run을 클릭합니다.약 60초 후에 488 nanometer argon 레이저를 대기 상태에서 켜짐 상태로 전환하면 레이저가 준비됩니다. '완료'를 클릭한 다음 압력계를 확인하십시오. '압력' 옆의 체크박스를 클릭하십시오.시스템이 플로우 셀을 프라이밍한 후, 지연 설정값이 11인지, 너비 설정값이 7인지 확인하십시오. 임계값은 신호의 경우 50으로, 최소 비행 시간의 경우 40으로 설정하십시오. 그런 다음 샘플 컵에서 남은 물을 제거하십시오.PBS 약 50 milliliters를 넣은 다음, strep demy 샘플 중 하나 0.1 milliliter를 컵에 넣습니다. 컵이 제대로 닫혔는지 확인하고 acquire를 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 최소 2,500 events가 수집되었을 때 초당 30에서 50 events 사이가 되도록 유속을 조절합니다.클릭하고 정지시킨 다음, 저장하여 이후의 통계 분석을 위해 각 샘플의 박테리아 펠릿을 분류할 데이터를 저장합니다. 먼저 분류 한계를 설정하고 최소 및 최대 비행 시간(time of flight) 값에 대한 세부 정보를 입력합니다. 또는 영역을 선택한 다음 게이트 영역을 정의하여 원하는 크기와 특성을 가진 펠릿을 선택할 영역을 생성합니다.분리 파라미터에 부합하는 펠릿을 수집하기 위해 50 milliliter 튜브를 배치합니다. 그다음 분리할 펠릿의 수를 설정하고, 선택한 파라미터에 따라 분리하도록 수동 분리를 클릭합니다. 분리가 완료되면 남은 샘플을 제거하고 샘플 컵을 물로 두 번 헹굽니다.코퍼스를 종료하기 전에 샘플 컵을 70% ethanol로 세척하십시오. 이제 시스템을 두 번 가동합니다. 한 번은 염소화된 물로, 다른 한 번은 일반 물로 가동한 후 오버플로우 컨테이너를 비우십시오. 세척 후, 정지 버튼을 클릭하여 시스템의 압력을 해제하십시오.모터가 정지하면 프로그램을 종료하고 퍼징(purging) 없이 셧다운(shut down)을 클릭하십시오. 그런 다음 컴퓨터, copa, 레이저 및 펌프를 끄십시오. streptomyces 형태의 균사체 펠릿과 액체 배양물은 크기가 매우 다양합니다.펠렛 크기 분포를 분석하기 위해, 액체 배지에서 2일 동안 배양한 streptomyces cila color 배양액을 1mm 노즐이 장착된 copus plus profiler를 사용하여 대형 입자 유세포 분석법으로 분석하였습니다. 여기 전형적인 copus 출력 산점도가 제시되어 있습니다. x축은 비행 시간을 나타냅니다.입자의 크기가 클수록 레이저 빔을 통과하는 시간이 더 오래 걸립니다. Y축은 소광도를 나타내며 이는 대상의 광학 밀도를 의미하고, 각 점은 레이저 빔을 통과하는 개별 펠릿 하나에 대응합니다. 데이터 지점들을 히스토그램으로 도식화한 결과, 이 대표 샘플의 크기는 정규 분포를 따르지 않는 것으로 나타났습니다.분포는 로그 값 기준 오른쪽으로 치우친 것으로 나타났습니다. 데이터셋을 변환한 후에도 정규 분포로 이어지지 않았기에, 크기 분포가 두 개의 정규 분포 혼합으로 설명될 수 있는지 평가하기 위해 데이터를 수학적으로 모델링하였습니다. 모델링 결과, 전체 펠릿의 92%를 차지하는 평균 크기 248 micrometers의 작은 펠릿 집단과 전체 펠릿의 8%를 차지하는 평균 크기 319 micrometers의 큰 펠릿 집단이 있음이 실제로 확인되었습니다.여기 대형 및 소형 펠릿 집단에서 분류된 마이크로 콜로니의 대표적인 분석 결과가 제시되어 있습니다. 두 집단의 평균 펠릿 크기를 사용하여 분류 경계를 정의함으로써, 두 크기 분포의 중첩 부분에서 펠릿이 분류되는 것을 제한하였습니다. 248 µm보다 작은 펠릿은 소형 펠릿 집단으로 간주하였고, 319 µm보다 큰 펠릿은 대형 펠릿 집단으로 간주하였습니다. 분류된 펠릿의 현미경 분석을 통해 이 절차 이후 이들의 크기가 뚜렷하게 구분됨을 확인하였습니다.이러한 이질성의 근본적인 메커니즘을 밝히기 위해 차세대 염기서열 분석이나 단백질 체학(proteomics)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱 (BEST)를 분리 방해 및 tetrads 간격의 수동 프로세스를 대체합니다. BEST는 한천 플레이트에 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 tetrads를 격리 유리 구슬로 교반하여 포자를 분리하고, 무작위로 배열 된 식민지는 분자 바코드를 사용하여 동일한 원본 테트라에서 파생 된 결정합니다.

BEST : Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

여기서는 메가카요세포 분화의 특성화를 위한 면역페노티핑 전략을 제시하고, 이 전략이 형광 활성화 세포 선별기로 다른 단계에서 메가카요사이클을 분류하는 방법을 보여준다. 방법론은 인체 에 있는 문화에서 생성된 거대 karyocytes뿐만 아니라 인간 1차 조직에적용될 수 있다.

인간 1차 출처에서 인간 MK의 면역페노티핑 및 세포 분류 또는 헤마토포이틱 전조자로부터 시험관내 분화

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

이 프로토콜은 중간엽 기질 세포에서 방출되는 세포외 소포체(EV)를 분류하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 특히 기기 설정 및 분류 조건의 최적화에 중점을 둡니다. 목표는 세포외 소포체의 특성을 보존하면서 분류하는 것입니다.

세포외 소포 격리를 위한 성공적인 분류 설정

여기서는 동위원소 2-플렉스 표지 전략과 ArgC 소화를 사용하여 단일 세포 히스톤 번역 후 변형 후 분석을 자동화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우는 단일 세포 해상도에서 염색질 이질성과 후생유전학적 반응을 정량적이고 재현 가능하며 고민도로 프로파일링할 수 있게 합니다.

단일 세포 히스톤 번역 변형(sc-hPTM2)의 다중화 분석을 위한 자동 샘플 준비

배우세요 Streptomyces 균사 펠렛을 COPA 대형 입자 유세포 분석기로 크기별 정렬하는 방법을. 이 고처리량 기술은 생장 이질성을 연구하고 다른 실사균에도 적용할 수 있습니다.

의 정렬

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