종합 달팽이 프로테옴을 확인하는 상향식 (bottom-up)과 샷건 단백질 체학 (Proteomics)

다음 실험의 전반적인 목표는 다양한 단백질체학 기술을 사용하여 달팽이관 감각 상피에서 최대한 많은 단백질을 식별하는 것입니다. 이는 성체 마우스에서 달팽이관, 감각 상피를 분리하고 용해 완충액에서 초음파 처리하여 두 번째 단계로 단백질을 얻음으로써 달성됩니다. 펩타이드 및 단백질 염기서열 적용 범위를 향상시키기 위해 전체 용해물 또는 분획된 단백질 용해물에 다양한 분해 전략이 적용됩니다.

다음으로, 질량 분석기 분석 전에 시료의 복잡성을 줄이기 위해 강력한 양이온 교환 및 역상 크로마토그래피를 포함한 다양한 분리 기술이 사용됩니다. 그 결과, 여러 단백질체학 접근법과 고분해능 질량 분석기를 사용하여 마우스 달팽이관 감각 상피에 대한 많은 수의 막 및 용해성 단백질을 식별할 수 있음을 보여줍니다. 항체 마이크로어레이 및 2차원 겔 전기영동과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 용해성 및 멤브레인 단백질이 확인되어 달팽이관 단백질체 데이터가 증가한다는 것입니다.

이 방법은 청력 및 파열 장애와 관련된 바이오마커에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 연령 및 유방암 또는 폐암과 관련된 바이오마커 식별과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 혈액과 같은 다른 생물학적 샘플을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 우리는 포유류의 내이에서 사용할 수 있는 제한된 단백질체학 데이터 세트, 특히 이 절차를 시작하기 전에 확인된 제한된 수의 막 단백질을 관찰했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다.

출생 후 30일 생쥐에서 달팽이관 감각 상피를 분리합니다. 하나의 x 인산염 완충액으로 조직을 세척한 후 조직에 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 음파 절단을 사용하여 얼음에서 30초 동안 혼합물을 초음파 처리합니다. 각 초음파 처리 사이에 1 분 동안 얼음에서 용해물을 식힌 다음 샘플을 총 3 번 초음파 처리합니다.

Centra는 5 분 동안 4 섭씨 온도에서 16, 000 번 G로 서스펜션을 융합했습니다. 완료되면 소화를 위해 상등액을 보관하십시오. 그런 다음 30μl의 달팽이관 단백질 추출물 분취액을 30K 스핀 필터에 직접 추가하고 Riss HCL 원심분리기에서 200μl의 8몰 요소와 혼합합니다.

14, 000 시간 G에서 15 분 동안 혼합물. 완료되면 농축액을 200마이크로리터의 8몰 요소 용액으로 희석하고 이전과 동일한 조건으로 원심분리를 반복합니다. 다음으로, 10 XI oto 아세트아미드 10 마이크로 리터와 8 몰 요소 용액 90 마이크로 리터를 필터와 와류의 농축액에 1 분 동안 첨가합니다.

스핀 필터를 마이크로 원심분리기 랙에 놓은 후, 14, 000배 G에서 14, 000배 G로 원심분리 후 암흑 속에서 실온에서 20분 동안 배양하고, 엔도 프로테아제 ly C 1:50 효소 대 단백질 비율로 0.1 마이크로그램으로 10분 동안 배양하고, 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양합니다. 완성되면, 여과기 단위에 100 millimolar 염화 중탄산염 해결책의 40 microliters를 추가하고 14, 이전 단계를 반복한 후에 10 분 동안 G 000 시간 혼합물을 세척하십시오, 8개의 molar 우레아의 40 microliters를 가진 여과기 단위를 세척하십시오. 그런 다음 40마이크로리터의 milli Q 물로 필터 장치를 두 번 세척합니다.

필터 장치를 100마이크로리터의 50밀리몰 중탄산암모늄 용액으로 3회 세척한 후 1:100 효소 대 단백질 비율로 마이크로리터당 0.4마이크로그램의 트립신을 첨가하고 혼합물을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 배양 후 필터 장치에 40마이크로리터의 50밀리몰라 중탄산암모늄 용액을 첨가하여 트립틱 펩타이드를 용리하고 혼합물을 14, 000회 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 이 단계를 한 번 더 반복합니다.

이 시점에서 50-100마이크로그램의 소화된 단백질 샘플을 200 x 2.1mm 5마이크로미터 두께의 양이온 교환 컬럼에 주입합니다.펩타이드를 분리하려면 280나노미터에서 펩타이드 분획을 모니터링하고 2분 간격으로 분획을 수집합니다. 분획 분취기를 사용하여 진공 농축기에서 분획을 건조시킵니다. 완료되면 액체 크로마토그래피에 사용할 준비가 될 때까지 건조된 분획을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

탠덤 질량 분석 분석. 또 다른 접근법에서는 단백질 혼합물을 분리하기 위해 겔 프리 분획법(gel free fractionation)을 사용했습니다. 달팽이관 단백질 상등액이 아세톤 침전에 의해 탈염되면 112마이크로리터의 Milli Q 물에 이전에 현탁된 탈염된 단백질에 30마이크로리터의 5배 샘플 완충액을 추가합니다.

다음으로, 8 마이크로 리터의 1 몰 DTT를 추가하고 혼합물을 섭씨 95도에서 5 분 동안 가열하여 단백질 이황화 결합을 줄입니다. 가열 후 혼합물을 식히십시오. 8ml의 러닝 버퍼를 양극 저장소에, 150마이크로리터의 러닝 버퍼를 샘플 수집 챔버에, 6ml의 러닝 버퍼를 음극 저장소에 추가합니다.

이 로딩 후, 150마이크로리터의 달팽이관 단백질 혼합물을 3.5-150킬로달톤의 질량 범위를 가진 8% 트리스 아세테이트 카트리지를 사용하여 샘플 로딩 챔버에 넣습니다. 실행을 시작한 후 피펫을 사용하여 기기에서 일시 중지된 각 간격으로 샘플 수집 챔버에서 샘플을 수집하고 새로 라벨링된 마이크로 튜브에 추가합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 러닝 버퍼로 수집 챔버를 두 번 세척하고 폐기합니다.

젤 자유로운 분획의 1D 젤 전기 이동법 따르기. 각 개별 분획을 30K 필터 장치에 직접 추가합니다. 그런 다음 14, 000 시간 G에서 원심 분리 후 트리스 HCL에 8 몰 우레아의 200 마이크로 리터와 각 분획을 혼합하고 25 분 동안 G를 혼합하고 각 필터 장치 및 와류의 농축물에 우레아 용액의 10 XI oto 아세트 아미드 10 마이크로 리터를 첨가하십시오.

스핀 필터를 마이크로 원심분리기 랙에 넣은 후 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 섭씨 30도에서 하룻밤 배양 후 필터 장치에 1 대 50 효소 대 단백질 비율에 대해 LY C의 마이크로 리터 당 0.1 마이크로 그램을 추가하고, 스핀 필터에 100 밀리 몰라 중탄산 암모늄 용액 40 마이크로 리터를 추가하고 이전 단계를 한 번 반복 한 후 10 분 동안 14, 000 회 G에서 샘플을 원심 분리하고, 스핀 필터를 100마이크로리터의 50밀리몰 중탄산암모늄 용액으로 세 번 세척하고 최종 세척 후 1:100 효소 대 단백질 비율로 마이크로리터당 0.4마이크로그램의 트립신을 추가합니다. 샘플이 섭씨 37도에서 밤새 배양되면 40 마이크로 리터의 50 밀리 몰라 중탄산 암모늄 용액을 첨가하여 각 필터 장치에서 삼부작 펩타이드를 용리하고 14, 000 회 G에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리하십시오.

이를 반복한 후 한 번 단계를 수행하여 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법으로 샘플을 분석합니다. 두 가지 이중 소화 절차가 사용되었습니다. 첫 번째는 삼부작 분해였고, 두 번째는 트립신을 사용한 두 번째 분해였으며, 이는 강력한 양이온 교환 컬럼에서 18개의 분획으로 분획된 풀링되고 나노 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법으로 분석되었습니다.

총 1,485개의 단백질이 단일 실행 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 수행할 때 1% FDR로 확인되었습니다. 이 실험적 접근 방식을 사용합니다. 확인된 단백질 중 324개 및 258개의 단백질은 각각 미토콘드리아와 원형질막으로 분류되었습니다.

두 번째 이중 분해 절차는 lys C 분해와 트립신 분해로 구성되었습니다. 각 분해물을 개별적으로 로드하여 강한 양이온 교환 컬럼에서 18개의 분획으로 분리하고 나노 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법으로 분석했습니다. LY C와 트립신 소화의 결과는 1% FDR을 가진 3, 503의 단백질의 합계를 생성했다.

또한 605 및 617 단백질은 각각 미토콘드리아와 원형질막으로 분류되었습니다. 이 접근법은 가장 많은 수의 막 관련 단백질 ID를 제공했습니다. LY C 및 트립신의 중복 분석.

분획은 확인된 단백질 중 65개 이상이 실험 간에 공유되었음을 보여주었습니다. 그러나 복제 분석에서 새로 확인된 단백질도 있었습니다. 추가 펩타이드와 단백질은 크로마토그래피의 작은 변화로 인해 확인되었으며, 따라서 단편화를 위한 다른 펩타이드로 이어졌습니다.

그림과 같이 겔이 없는 분별의 결과를 시각화하기 위해 은 염색 겔을 준비했습니다. 여기서, 겔은 연속적인 각 분획에 대해 분자량을 증가시켜 단백질 분리를 보여주었습니다. 따라서 12개의 겔이 없는 액체 분획을 두 가지 다른 다면 분해 방법을 사용하여 분해하고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법으로 분석했습니다.

첫 번째 분해 접근법은 이중 트립신 분해를 사용하여 수행되었으며, 이를 통해 단일 실행 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법을 수행할 때 1% FDR을 가진 2, 165개의 단백질을 식별할 수 있었습니다. 이 실험에서 516 및 399 단백질은 각각 미토콘드리아와 원형질막으로 분류되었습니다. 두 번째 분해 접근법은 엔도 단백질 분해 효소 ly C를 사용한 후 트립신 분해, 단일 실행 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행되었습니다.

탠덤 질량 분석 분석은 1% FDR을 가진 2, 211개의 단백질을 식별했습니다. 이 접근법은 트립신 트립신 접근법을 사용할 때와 유사한 수의 막 관련 단백질을 보여주었으며, 질량 분석 단백질체학 데이터는 데이터 세트 식별자 PXD 0 0 0 2 3 1로 Proteome Exchange Consortium에 기탁되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단백질 분해를 방지하기 위해 단백질 추출을 수행할 때 모든 단계에서 오염을 피하고 조직을 얼음 위에 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.