형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

우리는 멀티 앵글 회전 광학 영상 사포 신의 C (SAPC) dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles에 의해 전달 형광 마커의 생체 정량 (MAROI) 시스템을 설명합니다. 암 및 관절염 마우스 모델을 이용한 제외한 MAROI 신호 곡선 분석은 정확한 매핑 및 질병 프로세스의 생물학적 특성 규명을 위해 사용될 수 있는지 보여준다.

이 절차의 전반적인 목표는 마우스의 360도 생체 내 이미징을 수행하여 형광 분석을 위한 최적의 각도를 결정하는 것입니다. 이는 먼저 정형소 뇌종양, 공학적 뇌종양 및 관절염 동물 모델을 준비하여 수행됩니다. 다음으로 SAP C 단백질이 생산되고 SAP D-O-P-S-C-V-M 나노 소포가 준비됩니다.

그런 다음 나노 소포를 동물의 꼬리 정맥에 주입합니다. 마지막으로 형광 및 X선 이미지를 촬영하고 분석합니다. 궁극적으로 M-A-R-O-I 방법은 형광 이미징 분석을 위한 최적의 각도를 표시하는 데 사용됩니다.

2D 평면 형광 이미징과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 M-A-O-M-A-R-O-I 방법을 통해 조사자가 형광 이미징 분석을 위한 최적의 각도를 결정할 수 있다는 것입니다. CEP CS Vesical은 종양과 염증 조직을 표적으로 삼을 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 암 및 관절염의 치료와 진단으로 확장됩니다. 모든 동물 연구는 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 신시내티 아동 병원 연구 재단의 승인을 받아 이러한 연구와 정형소 뇌종양 쥐를 수행하도록 승인되었습니다.

유전자 조작 뇌종양 마우스와 A-K-B-X-N 관절염 마우스 모델이 사용됩니다.텍스트 프로토콜에 따라 관절염 지수 거시적 채점 시스템을 사용하여 다음과 같이 관절염에 대한 마우스를 평가하고, 0은 감지할 수 있는 관절염이 없음, 1은 발의 부기 및/또는 발적과 같고, 1자리 2는 관련된 두 관절과 같습니다. 3은 3 개의 관절이 관련되어 있고 4 개는 전체 발과 손가락의 심각한 관절염과 같으며 에탄올 및 고성능 액체 크로마토 그래피로 침전되기 전에 E 대장균 세포에서 재조합 인간 SAP C 단백질을 생산하고 동결 건조 후 정제 후 건조 SAP C의 농도를 중량으로 결정합니다. SAP C 단백질을 혼합하려면 유리관에 0.18mg의 DOPS와 0.03mg의 CVM을 결합하고 질소 가스를 사용하여 지질 용매를 증발시킵니다.

그런 다음 혼합물에 0.32mg의 SAP 바다 단백질 분말을 추가합니다. 건조 혼합물을 PBS 완충액 1ml에 현탁시키고 15분 동안 초음파 처리합니다. 현탁액을 Cidex G 25 컬럼에 통과시켜 유리 CVM 염료를 제거합니다.

SAP C-D-O-P-S-C-V-M 나노 입자는 각각 653 나노 미터와 677 나노 미터의 여기 및 방출 최대 값을 갖습니다. 화성 시스템을 사용하여 다각도 회전 광학 이미징 또는 M-A-R-O-I 방법을 테스트하기 위해, 설명된 마우스 모델 중 하나에서 2% ISO 불소로 마우스를 마취한 후 브루커 MI 로테이터 탭의 미리보기 화면에서 척추가 카메라를 향하도록 하여 화성 시스템의 앙와위 위치에 마우스를 위치시키고, 화성 380도 지지 필름을 보정합니다. SAP C-D-O-P-S-C-V-M을 마우스 꼬리에 투여하도록 마우스를 배치하고, 24시간 후에 200마이크로리터를 정맥 주사한 다음, 주입 후 7-9일 후에 다시 주입하고, 380도 과정에 걸쳐 10도 단위로 형광 및 X선 이미지를 촬영하여 회전 데이터 세트에 공백이 없는지 확인하기 위해 약간의 겹침을 만듭니다.

Bruker 회전 소프트웨어를 사용하여 해부학적 위치 파악을 위해 X-ray 이미지 위에 형광 이미지를 중첩했습니다. 이미지를 분석하려면 관심 영역 또는 시야의 너비 또는 뇌종양 마우스의 질병 부위의 FOV를 포함하는 ROI를 그립니다. 모든 시점에 대해 각 종양 모델과 각 대조군 마우스에서 동일한 ROI를 사용하여 해부학적 랜드마크를 사용하여 자동 배경 빼기 후 ROI의 위치를 표시합니다.

Brucker MI 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 밀리미터 제곱당 초당 광자로 변환하고, 이미징 각도의 함수로 형광 값을 플롯하고, 오차 막대로 적용하여 모든 이미지의 평균 형광 강도를 결정합니다. 대조군 마우스에서 얻은 평균 형광 값의 표준 편차. 대표적인 orthotopic tumor bearing mouse의 형광 이미지가 이 그림에 나와 있습니다.

우리는 여기에서 원적색 염료로 표지된 DOPS 나노 소포인 SAP 종자가 KBXN 마우스의 관절염 관절뿐만 아니라 정소성 및 자발적 마우스 뇌 종양에 특이적으로 축적됨을 보여줍니다. 화성 시스템의 주요 목적은 여기에서 볼 수 있듯이 가장 정확한 측정을 수행할 수 있도록 최적의 형광 각도를 결정하는 것입니다. 이 동물에 대한 최적의 이미지 각도는 10도입니다.

형광 광자 강도가 가장 큰 기준선 측정은 SAP C-D-O-P-S-C-V-M 주입 전에 수행되었으며 주입 후 24시간 후에 종양이 없는 대조군 마우스가 유사한 치료를 받았습니다. 이 수치는 유전자 조작 뇌종양 마우스 모델의 비교 가능한 데이터를 보여줍니다. 형광 이미지와 광자 측정은 SAP C-D-O-P-S-C-V-M 주입 후 24시간 및 9일 후에 기준선에서 수행되었습니다.

그래프는 종양이 있는 동물 종양 음소거 49의 최적 이미징 각도가 주입 후 24시간 후에 20도이지만 주입 후 9일 후에 10도로 변경됨을 보여줍니다. 이는 형광 신호 변화가 종양 성장을 반영하는 형태학적 변화와 상관관계가 있음을 시사합니다. 이 표에서 볼 수 있듯이 M-A-R-O-I 방법은 최적의 이미징 각도에서 회전이 증가할 때 프로젝션에 대한 형광 신호가 감소한다는 것을 명확하게 보여줍니다.

뇌종양에서는 형광 신호가 평균 7% 감소했습니다. 동물의 신체적 방향이 최적 이미징 각도에서 10도 오프셋을 초과하거나 빼는 경우. 형광 신호의 평균 21% 감소는 플러스 또는 마이너스 20도에서 측정되었습니다.

따라서 최적 각도에서 상대적으로 작은 오프셋은 상당한 퍼센트 신호 감소를 초래할 수 있습니다. 이미지 포지셔닝을 위해 M-A-R-O-I 기술을 활용하면 조사자가 보다 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성할 수 있습니다. M-A-R-O-I 방법은 주사 후 24시간 후에 SAP C-D-O-P-S-C-V-M에 의한 관절염 관절의 표적을 평가하기 위해 최종적으로 사용되었습니다.

이 동물은 3 개의 관절염 관절로 3 점을 받았습니다. 관절염이 있는 마우스의 발가락과 발목의 형광 이미지는 해당 광자 측정 그래프를 기반으로 여기에 나와 있습니다.10도 회전에서 발가락과 발목에 대해 발견되는 최적의 이미징 각도는 각각 140도와 120도입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 조사자가 형광 이미징 분석을 위한 최적의 각도를 결정할 수 있도록 M-A-R-O-I 데이터를 준비하고 획득하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.