Name: 형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 학습하세요 MAROI 기술을 이용하여 형광 마커의 최적 각도를 결정하는 방법을 생체 내 이미징에 적용합니다. 이 기술은 뇌 종양과 관절염 마우스 모델에서 정확한 형광 분석을 가능하게 하여 암 및 관절염 연구의 진단과 치료에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH / NCI 부여 번호 1R01CA158372-01 (치에)와 새로운 약 국가 중점 프로젝트 그랜트 번호 009ZX09102-205 (치에)에 의해 부분적으로 지원되었다. 쓰기 지원은 박사 주디 Racadio에 의해 제공되고, 혈액 및 종양학의 신시내​​티 대학의 부에 의해 투자되었다. 신시내티 대학 의과 대학의 Vontz 핵심 이미징 연구소 (VCIL).

동물 사용의 윤리 문. 와 신시내티 아동 병원 연구 재단 (동물 복지 보증 번호 A3108-01) : 모든 동물 실험은 신시내티 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC 11-05-05-02 프로토콜 번호)에 의해 승인되었다. 마우스를 포함한 모든 실험은 신시내티와 신시내티 아동 병원 연구 재단의 대학의 동물 관리 지침을 따랐다. 1. 동물 모델을 준비 참고 : 아래에 설명 된 세 가지 동물 모델은 우리의 이전 연구에 사용되었습니다 : <ol><li> 동소 뇌 종양 마우스 : 인간의 두개골 U87-ΔEGFR 룩 세포를 주입 한 뉴 / 뉴 흉선 암컷 생쥐를 사용합니다. 이 마우스는 인간 아교 모세포종의 전형적인 특징을 보여주는 공격적인 종양을 개발합니다. </li><li> 유전자 조작 뇌 종양 마우스 모델 13 : MUT3 (GFAP-CRE 품종; Nf1lox을P / +; Trp53loxP/loxP와 Trp53 - / +) 수컷 마우스; PtenloxP /에 loxP는 여성 Mut6 마우스 생성 (GFAP-CRE; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP을, PtenloxP / +). 여성 B6CBAF1 / J 마우스로 남성 MUT3 마우스를 사육하여 B6CBAF1 / J 변형에 MUT3 마우스를 유지한다. P9 및 P12의 쥐를 유전자형과 자신의 조직을 수확 후 유전자형을 확인합니다. </li><li> K / BXN 관절염 : 복강 KRN X의 NOD의 F1 마우스에서 150 ㎕의 혈청을 투여 한 사용 C57BL/6J 마우스. 이 마우스는 관절염에게 혈청을 주입 다음 24 ~ 48 시간을 개발할 수 있습니다. 관절염 마우스의 이미지는 마우스가 명백한 거시적 인 관절염을 나타내는 시점되는, 혈청 투여 후 7 일째에 수행됩니다. 마우스는 다음 단계에서 설명 된 기준을 사용하여 평가하여야한다. <ol><li> 0 = 감지 관절염, 1 = 부종 및 / 또는 발의 발적 또는 하나의 숫자, 2 = 참여 개의 관절, 3 = 세 개의 관절 invol 다음과 같이 관절염 인덱스 거시적 채점 시스템을 사용하여 거시적 관절염 마우스의 평가VED, 4 = 전체 발 및 손가락의 심한 관절염. 관절염 채점 시스템은 영향을받는 관절의 수와 마우스 발에 관절염의 중증도를 결정하는 데 사용된다. 가장 높은 관절염 점수도 마우스는 거의 부동의 흔적을 보여주지. 그러나, 관절염 (예 : 음식과 물 소비를 억제 부은 발에서 심한 부동 등) 과도한 고통을 모니터링 3x/week와 마우스입니다 희생된다. </li><li> 참고 : 유체가 마우스의 꼬리 정맥에 IV 주입 불임은 실험을하는 동안 유지하고있다. 청소, 멸균, 일회용 주사기와 작은 유리 병은 학습 솔루션의 준비와 관리에 사용됩니다. </li></ol></li></ol> 찬란 - 라벨 SAPC-DOPS Nanovesicles 2. 준비 <ol><li> SAPC 단백질 생산 정확한 인간 SAPC 순서를 사용하여 재조합 SAPC 단백질은 E. 제작 된 대장균 세포는 앞서 설명한 수정 4.SAPC는 고성능 액체 크로마토 그래피 않는 정화이어서 에탄올 침전시켰다. 동결 건조 후, 건조 SAPC 사용하고, 그것의 농도는 그 무게에 의해 결정되었다. </li><li> 이전 7,10,11 설명 된대로 SAPC 단백질을 혼합. 혼합 DOPS (0.18 mg)을 CVM과 유리관 (0.03 mg)의 지질 용매를 증발시켜 질소 가스를 사용한다. </li><li> 이전 7,10,11를 바와 같이 약 15 분 동안 1 PBS 버퍼링 ㎖ 및 목욕 초음파 처리에서 건조 된 혼합물을 일시, 혼합물에 SAPC 단백질 분말 (0.32 ㎎)을 추가한다. 그런 다음 무료 CVM의 염료를 제거하기 위해 세파 덱스 G25 컬럼 (PD-10)를 통해 현탁액을 전달합니다. 여기 및 최종 제품, 즉 SAPC-DOPS-CVM의 nanovesicles의 발광 최대 값은 653 nm 내지 677 nm의 아르였다. </li></ol> 3. 영상 <ol><li> MAROI 시스템을 테스트하기 (1 단계에서 상기 한) 뇌 종양 및 관절염 마우스 모델을 사용합니다. 2 % 이소 플루 란과 효과에 마우스를 마취. 1 ~ 2 %의 이소 플루 란이 터 유지합니다촬상 과정의 지속 시간 동안 조사 하였다. 온난 한 공기가 연속적으로 부드럽게 촬상 기간 동안 이미징 챔버로 전달된다. 눈을 커버하고 윤활하도록 멸균 인공 눈물 연고의 작은 비드는 마우스의 각각의 눈에인가된다. 처음 카메라 (그림 1)으로 감독 자신의 척추와 부정사 위치에 마우스를 위치하여 MARS 시스템에 마우스를 놓습니다. MARS 380 ° 지원 필름을 보정하고, 브루 커 (Bruker) MI 프로토콜 탭에서 회전 소프트웨어를 사용하여 마우스를 놓습니다. 이전에 아래에 설명 된 방식으로 SAPC-DOPS-CVM 관리에 마우스의 기본 이미지를 얻습니다. </li><li> 정맥 주사로 쥐의 꼬리 정맥에 SAPC-DOPS-CVM의 200 μl를 주입한다. 마우스 및 관절염이나 뇌 종양 베어링 마우스를 제어 할 수 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 이미지 마우스 24 시간 후 주입하고 다시 형광 (25 초 노출 시간) 및 X-선 (10 초 노출 시간)을 복용 7-9 일 포스트 주입에 난380 °의 과정을 통해 10 ° 씩의 마법사, 회전 데이터 집합의 틈새가 없는지 확인하기 위해 약간의 중복을 작성. 브루 커 (Bruker) MI 소프트웨어를 사용하여 해부학 적 지역​​화를위한 X-선 영상에 형광을 중첩. </li></ol> 4. 이미지 분석 <ol><li> 질병 사이트 (종양 및 관절염)의 뷰 (FOV)의 필드의 폭을 둘러싸는 직사각형의 투자 수익 (ROI)을 그립니다. ROI는 380 ° 회전의 과정에서 동물 이동함에 FOV 내에 질병 기능을 유지할만큼 충분히 커야한다. 뇌 종양 마우스 (소성을 형질 전환 모델)의 경우, 모든 시점 (기준, 24 시간, 9 일간)에 대해 동일한 직사각형 각각의 종양 모델에 대한 투자 수익 (ROI)와 세 (3) 각각의 제어 마우스를 사용합니다. 각 마우스의 직사각형 ROI의 위치는 각 동물의 해당 X-선 영상에 해부학 적 랜드 마크를 활용하여 모든 시간 지점을 통해 유지됩니다. 종양 모델에서 확인 된 해부학 적 랜드 마크 (들)도 괞 찮아에 사용되어야합니다각 모델의 각각의 컨트롤에 동일한 직사각형의 ROI를 CE. 일관된 투자 수익 (ROI)의 배치를 허용 X-선 이미지를 확인 해부 랜드 마크는 두개골의 기지와 광대뼈 아치의 뒤쪽 측면을 포함한다. 그들은 오른쪽에 시각화 및 후방 - 전방 (PA) 이미지 측면 두개골 남아 있습니다. </li><li> 자동 배경 감산 한 후, 모든 이미지의 평균 형광 강도를 결정합니다. 브루 커 (Bruker) MI 이미징 소프트웨어를 사용하여 광자 / 초 / ㎟에 형광 이미지를 변환합니다. 촬상 각도의 함수로서 형광 값을 플롯과 오차가 엑셀 또는 다른 그래프 소프트웨어를 사용하여 대조군 마우스로부터 얻은 평균 형광 값의 표준 편차를 막대로 적용한다. </li></ol>

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</ol>

공개 아무것도 없다.

류마티스 조건의 위치와 고형 종양 및 염증성 병소의 크기의 정확한 결정은 적절한 치료를 구현하고 질병의 진행 또는 면제를 수행하는 것이 중요합니다. 가치, 현재 영상 전략 (X-레이, MRI, 초음파, X-선 컴퓨터 단층 촬영)는 동안 질병 상태의 불완전한 평가를 제공합니다. 예를 들어, 관절염 관절 손상은 일반적으로 뼈 구조에 있지만 연부 조직의 염증과 파괴, 질병의 초기 단계의 특성에 대한 정보를 제공하는 X-선에 의해 평가된다. 여기에 제시된 MAROI 방법도 병에 걸린 조직이나 기관의 전체 3D 매핑 및 재건 수있는, 통합 된 비 침습적이고 간단 플랫폼에서 X-레이와 정교한 연부 조직 영상 기법 (예 : MRI 또는 초음파) 모두의 장점을 결합 이러한 쥐와 같은 작은 동물. 이 방법은 O를 선택적 친 화성을 활용F SAPC-DOPS는 암과 염증 세포의 세포막에 풍부한 노출 된 세린 잔기에 nanovesicles. 이 바인딩의 결정은 SAPC, 이러한 포스파티딜 세린 7,10,11 등의 음이온 인지질에 대한 강한 친화력 fusogenic 리소좀 단백질이다. 형광 프로브 (CVM)에 접합 할 때, 체​​계적으로 주입 SAPC-DOPS는 형광 이미징에 의해 종양 및 관절염 사이트를 추적 할 수 있습니다. 우리의 방법의 한계는 현재 쥐 같은 작은 동물 이미징의 사용을 제한 감도, 관련이 있습니다. 다른 촬상 방법과 마찬가지로, 잡음비 최적 형광 신호는 종양의 크기 또는 관절염의 정도에 의해 제한되고, 이러한 귀 (뇌 영상), 창자와 같은 하이 백 (자기 형광)과 조직 또는 기관을 묘화 할 때 손상 될 수있다 / 대변 (복부 영상)과 발 (뒷다리 영상). 이러한 관점에서, 우리는 발견 등 CVM 프로로 원적외선 염료Vides의 가시 범위의 다른 형광 프로브보다 생체 내 환경에서 더 나은 스펙트럼 분리 및 해상도. 다른 함정, 이미징 동안 모두 마취와 사후 (사후 경직 경직) 동안 동물의 잠재적 인 운동이 (가) 있습니다. 뒷다리의 위치는, 특히, 회전시 움직임을 방지하기 위해 안정화하는 것이 어렵습니다. 현재의 상태에서 기술은 시간이 한 60 분 전체 회전을 완료하고 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 필요에 따라 스캔 타임이 소요됩니다. MAROI 방법은 다른 영상 기법을 통해 다수의 장점을 제공한다. 38 (또는 그 이상)의 서로 다른 각도에서 이미지 병에 걸린 조직 할 수있는 능력은 하나의면에서 평가할 때 방해 할 수있다 형광의 시각화를 허용한다; 것은 부적절 각도에서 영상의 결과가 음성 (false negative)의 수를 최소화하는 데 도움이 될 수 있기 때문에이 동물 연구에서 가치가있다. overl으로잉 X-선 형광 이미지, 환부의 정확한 해부학 적 지역​​화를 결정할 수있다. 종 방향의 연구가 수행 될 수 있도록 최종적으로, 실시간 (생체) 이미징의 가능성이 있습니다.

전체 동물 이미징은 동물 physiopathology의 연구에 강력한 도구가되고있다. 현재 이미징 시스템 사이에서, MS FX PRO는 연구원이 정확하게 시각화 형광 (또는 발광) 마우스를 살고있는 화합물 및 / 또는 조직, 동시에 X-선 이미지를 얻을 표시 할 수 있습니다. 최근에 도입 된 멀티 모달 동물 회전 시스템 (MARS)와 마우스의 완전 자동화 된 회전 특정 각도 1에 형광 / 발광 및 X-선 이미지를 모두 포착하기 위해 달성된다. 이미지 수집이 순차적 이미지 시리즈가 1 °로 작은 별, 증분 각도에서 포착 할 수 있도록 프로그래밍 할 수 있습니다. 이는 동물의 최적 방향, 즉 식별을 허용한다. 있는 내부적으로 생성 된 형광 / 발광 신호 및 시스템의 검출 장치 사이의 거리가 최단된다. 이것은, 차례로, 후속 이미징을위한 동물의 정확한 위치 조정을 용이 SE종의 연구 중 ssions. 이 보고서에서, 우리는 형광 마커 강도의 생체 정량을위한 멀티 앵글 회전 광학 영상 (MAROI) 시스템의 구현을 설명합니다. MAROI 신호 곡선 분석 정확하게 환부 또는 그 생물학적 과정을 매핑하는 형광 신호 분배의 직접 상관에 대한 종 방향의 연구에 사용될 수있다. 이 시스템은 동 소성 및 자발적 종양에 의한 형광 표지 SAPC-DOPS의 nanovesicles의 흡수를 모니터링 할뿐만 아니라, 관절염 병소에 의해, 마우스를 리빙 데 사용되었다; 그것은 동물의 완전한 회전에 따르면 유래 멀티 스펙트럼 및 복합 데이터 세트를 제공했다. 생체 내 이미징을위한 현재 사용할 수있는 다수의 형광 프로브 사이에서, 적외선 근처와 원적외선 스펙트럼 영역에서 발광하는 피부와 조직과 가장 낮은 간섭을 부여, 가장 높은 보급률 및 이미지 고해상도를 제공olution. 우리는 SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12 레이블, CellVue 적갈색 (CVM) 2,3, 원적외선 형광 세포 링커 (예 647/Em 667)를 사용했다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 미디엄</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco (그랜드 아일랜드, 뉴욕)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>하이클론 (유타주 로건)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylserine</td><td>Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc.(펜실베이니아주 엑스턴)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sephadex G25 열 PD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>쥐와 생쥐를 위한 새로운 표준 입체택시</td><td>하버드 기구(매사추세츠주 홀리스턴)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bransonic 초음파 세척기 모델 1510</td><td>Branson 초음파 (Danbury, CT)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>멀티 스펙트럼 FX 시스템</td><td>Bruker Corporation(매사추세츠주 빌레리카)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>다각도 회전 광학 이미징 장치</td><td>Bruker Corporation(매사추세츠주 빌레리카)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

형광 sapc-dops nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

우리는 멀티 앵글 회전 광학 이미징 형광 마커로 표시 physiopathological 프로세스의 생체 모니터링 (MAROI) 시스템을 설명합니다. 마우스 모델 (뇌종양 및 관절염)은이 방법의 유용성을 평가하기 위해 사용되었다. CellVue 적갈색 (CVM) 형광 태그 사포 신 C (SAPC) dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles 정맥 투여 하였다. 다음, 동물의 생체 내 이미징 시스템의 회전 홀더 (MARS)에 넣었다. 이미지는 380 ° 이상 10 ° 단계에 인수되었다. 관심 (ROI)의 사각형 영역은 모델 질병 사이트에서 이미지의 폭을 가로 질러 배치했다. 투자 수익 (ROI) 내에서, 모든 이미지, 평균 형광 강도 배경 공제 한 후 계산 하였다. 공부 마우스 모델에서, 레이블 nanovesicles은 모두 동 소성 및 형질 전환 뇌 종양에서 촬영 하였다 관절염 사이트 (발가락과 발목)에서. 멀티 앵글 IMA의 곡선 분석GE의 ROI가 높은 신호와 각도를 결정. 따라서, 각각의 질병 사이트를 이미징을위한 최적의 각도가 특징이었다. 형광 화합물의 촬상에 적용 MAROI 방법 기재된 마우스 모델에서 질병 상태의 생체 정량 분석을위한 비 침습적 경제적이고 정밀한 도구이다.

우리는 원적외선 염료 (CVM)으로 표시 SAPC-DOPS의 nanovesicles 특히 소성을하고 자발적인 마우스 뇌 종양에 축적뿐만 아니라 K / BXN 마우스의 관절염 관절 것을 여기에서 보여줍니다. 생쥐의 완전한 회전 동안 각 질환 사이트 위에 위치 ROI로부터 취득한 형광 직렬 / X-선 영상은 높은 형광 강도를 가진 최적의 촬상 각도를 밝혀 MAROI 곡선 분석을 실시 하였다. MARS 시스템을 사용하는 주요 목적은 가장 정확한 측정을 수행 할 수 있도록 형광의 최적의 각도를 결정하는 것이다. 뇌종양 관절염 마우스를 사용하여 세 가지 실험에서 대표적인 결과가 표시됩니다. SAPC-DOPS-CVM 및 MARS 시스템 (그림 1)으로 인해 관절염에 종양이나 염증을 관찰하는 최상의 이미지 각도를 사용하여 측정 하였다. X-선 인수 다음에 형광 이미지는, 매 10 °를 취득한마우스의 380 ° 회전하는 동안. 형광 이미지는 이미지 디스플레이 및 회전 동영상 생성 대응 X-선 영상에 오버레이 하였다. 동소 뇌종양 모델의 결과는 그림 2에 설명되어있다. 대표 소성을 담암 마우스 (Ortho1)의 형광 이미지가 그림 2A에 표시됩니다. 이 동물에 대한 최적의 화각은 10 °이며, 광자 형광 강도 (도 2B) 최대되는 위치. 측정은 SAPC-DOPS-CVM (베이스 라인)에 주입하기 전에 찍은 24 시간 주입 후했다. 제어 생쥐 (종양 무료) 유사한 치료를 받았다. 그림 3은 유전자 조작 뇌 종양 마우스 모델에서 비교 데이터를 보여줍니다. 형광 이미지와 광자 측정 SAPC-DOPS-CVM (기준)를 주입하기 전에 찍은 24 시간 (도 3a 및도했다 &lt;주사 후 강한&gt; (b)), 9 일 (그림 3C). 이 그래프는 종양 베어링 동물 (종양 Mut49)에서 최적의 영상 각도가 20 ° 24 시간 후 주입하지만, 10 ° 구일 포스트 분사에 대한 변경 사항입니다 것을 보여줍니다. 이것은 종양의 성장 가능성을 반영하는 형태 학적 변화와 상관이 형광 신호의 변경을 제안한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, MAROI 방법 깨끗이 형광 신호가 얻어 최적의 촬상 각도에서 회전을 증가 돌기에 대해 감소한다는 것을 보여준다. 동물의 물리적 방향이 최적의 촬상 각도 오프셋 ± 10 ° 인 경우 뇌종양에서 형광 신호에서 7 %의 평균 감소가 얻어졌다. 형광 신호의 평균 21 % 감소가 ± 20 °에서 측정 하였다. 따라서 최적의 각도에서 상대적으로 작은 오프셋 (offset)는 중요한 신호 감쇠가 발생할 수 있습니다. 이미지 위치에 대한 MAROI 기술을 활용하여 INVE에게 수보다 일관되고 신뢰할 수있는 데이터를 생성하는 stigators. MAROI 방법은 마지막으로 SAPC-DOPS-CVM 주입 후 SAPC-DOPS-CVM 24 시간으로 관절염 관절의 타겟팅을 평가하는 데 사용되었다. 이 동물은 세 관절염 관절로 3 득점. 투와 관절염 마우스의 발목의 형광 이미지는도 4a 및도 4b에 나타낸다. 10 ° 회전 간격으로 대응 광자 측정도 4C와 4D에 그래프로. 발가락과 발목을 찾을 최적의 영상 각도는 각각 140 ° 및 120 °이다. 요약하면, 형광 SAPC-DOPS의 nanovesicles와 MAROI 시스템의 조합은 작은 동물에서 종양 및 관절염의 진행 양적 연구를 허용 라이브 영상을위한 비 침습적 정확하고 매우 민감한 전략을 나타냅니다. 360 ° 복합 영상 데이터 세트를 획득 가능성은 상당히 즉석ES 데이터 분석 및 해석 달성 번의 앵글 영상 기법을 사용하는 것과 비교하여. <img alt="표 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> 표 1. 각 마우스 모델에 대한 최적의 촬상 각도. 최대 광자 형광 (FLR 최적 각도)의 각도와 표준 해부 각도 (X-선) 사이의 차이를 알 수있다. 이 두 개의 각도가 점점 다른 될 때, 측정 된 신호는 크게 변경됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; 그림 1. 다 각 회전 광학 영상 (MAROI) 장치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> 동소 뇌 종양 마우스 모델에서 그림 2. 형광 신호 대 이미지 각도. 10 ℃의 최적의 화상 각도 피크 형광 신호의 (A). 이미지. 파란색 상자가 방출되는 광자를 정량화하는 데 사용되는 투자 수익 (ROI)을 보여줍니다. (B) 광자 방출 대 이미지 각도. 그래프. 대표 소성을 담암 마우스 (Ortho1는) 세 nontumor 마우스에 동일한의 ROI에서 평균 형광 값에 대한 그래프됩니다. 측정은 (주입하기 전에) 기준에서 찍은 24 시간 포스트 사출 성형 및 직접 성형했다N. 오차 막대는 표준 편차를 나타내는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> 유전자 조작 마우스 모델의 자발적인 뇌종양의 이미지 각도 대 그림 3. 형광 신호. 로부터 ROI 한 20 °의 최적의 화상 각도 (베스트 블루 박스). (B)와 (C)의 최대 형광 신호 (A). 이미지. ROI 1 개의 광자 대 화각의 그래프. 밸류 대표 자발적 뇌 종양 베어링 마우스, 종양 무트 (49)는 세 개의 비 종양 마우스에서의 평균 값과 그래프됩니다. 측정은 (주입하기 전에) 기준에서 찍은 24 시간 (B), 9 일 (C) 포스트 분사했다. 오류 B<html> ARS는 표준 편차를 나타내는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> 발가락 및 발목 관절의 관절염을 가진 마우스에있는 그림 4. 형광 신호 대 이미지 각도. (A) 및 (B). 피크 형광 발가락 (A) 및 발목 관절 (B)에 대한 신호, 빨간색 상자에 표시되는 ROI를 내. (C) 각의. 그래프를 보여주는 이미지는 대 TOE에 대한 광자 방출을 의미한다. .. 피크 광자 방출 각도의 (D) 그래프 140 °의 각도에서 볼 대 발목에 대한 광자 방출을 의미 할 수있다; 최대 강도는 120 °의 각도로 발생합니다.대상 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 멀티 앵글 회전 광학 영상 사포 신의 C (SAPC) dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles에 의해 전달 형광 마커의 생체 정량 (MAROI) 시스템을 설명합니다. 암 및 관절염 마우스 모델을 이용한 제외한 MAROI 신호 곡선 분석은 정확한 매핑 및 질병 프로세스의 생물학적 특성 규명을 위해 사용될 수 있는지 보여준다.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

본 절차의 전반적인 목표는 마우스의 360도 생체 내(in vivo) 이미징을 수행하여 형광 분석을 위한 최적의 각도를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 정위성 뇌종양, 엔지니어링된 뇌종양 및 관절염 동물 모델을 준비합니다. 그다음 SAPs C 단백질을 생산하고 SAP D-O-P-S-C-V-M 나노 소포를 준비합니다.그 후 나노 소포를 동물의 꼬리 정맥에 주입합니다. 마지막으로, 형광 및 X-선 영상을 촬영하고 분석합니다. 최종적으로 M-A-R-O-I 방법을 사용하여 형광 영상 분석을 위한 최적의 각도를 제시합니다.2D 평면 형광 이미지법과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은, M-A-O-M-A-R-O-I 방법이 연구자로 하여금 형광 이미지 분석을 위한 최적의 각도를 결정할 수 있게 한다는 점입니다. CEP CS Vesical이 종양 및 염증 조직을 표적할 수 있기 때문에, 이러한 기술적 함의는 암과 관절염의 치료 및 진단으로 확장될 수 있습니다. 모든 동물 실험은 신시내티 대학교 및 신시내티 어린이 병원 연구 재단의 기관동물관리위원회(IACUC)로부터 승인을 받아 수행되었으며, 여기에는 정위성 뇌종양 마우스 모델 연구가 포함됩니다.유전자 조작 뇌종양 마우스 모델과 A-K-B-X-N 관절염 마우스 모델이 사용되었습니다. 텍스트 프로토콜에 따라, 다음과 같은 거시적 점수 체계인 관절염 지수를 사용하여 마우스의 관절염 상태를 평가합니다. 0점은 감지 가능한 관절염이 없는 상태, 1점은 발의 부종 및/또는 발적 또는 발가락 하나에 증상이 있는 상태, 2점은 두 개의 관절이 침범된 상태, 3점은 세 개의 관절이 침범된 상태, 4점은 발과 발가락 전체에 심각한 관절염이 있는 상태를 의미합니다. E coli 세포에서 재조합 인간 SAPs C 단백질을 생성한 후, 에탄올 침전과 고성능 액체 크로마토그래피 정제를 거쳐 동결 건조한 뒤, 무게를 측정하여 건조된 SAP C의 농도를 결정합니다. SAP C 단백질을 혼합하려면, 유리 튜브에 0.18 mg의 DOPS와 0.03 mg의 CVM을 혼합하고 질소 가스를 사용하여 지질 용매를 증발시킵니다.그런 다음 혼합물에 0.32 milligrams의 SAPs 해양 단백질 분말을 추가합니다. 건조 혼합물을 1 milliliter의 PBS 버퍼에 현탁시키고 15분 동안 초음파 세척기(bath sonicator)로 처리합니다. 현탁액을 Cidex G 25 컬럼에 통과시켜 유리 CVM 염료를 제거합니다.SAP C-D-O-P-S-C-V-M 나노입자의 최대 흡수 및 방출 파장은 각각 653 nanometers와 677 nanometers입니다. Mars 시스템을 사용하여 다각도 회전 광학 영상법(M-A-R-O-I method)을 테스트하려면, 설명된 마우스 모델 중 하나를 2% ISO 플루오린으로 마취시킨 후, Bruker MI rotator 탭의 미리보기 화면을 참조하여 척추가 카메라를 향하도록 마우스를 Mars 시스템 내에 앙와위로 배치하고 Mars 380도 지지 필름을 보정하십시오. SAP C-D-O-P-S-C-V-M을 마우스 꼬리에 투여하기 위해 마우스를 배치한 후, 200 microliters를 정맥 내로 주입하십시오. 24시간 후, 그리고 주입 후 7~9일 뒤에 다시 투여하십시오. 380도에 걸쳐 10도 간격으로 형광 및 X선 영상을 촬영하며, 회전 데이터 세트에 공백이 생기지 않도록 약간의 중첩을 두어 촬영하십시오.Bruker 회전 소프트웨어를 사용하여 해부학적 위치를 파악하기 위해 x-ray 이미지 위에 형광 이미지를 중첩시켰습니다. 이미지를 분석하려면 뇌종양 마우스 질환 부위의 시야(FOV) 너비를 포함하는 직사각형 관심 영역(ROI)을 설정하십시오. 자동 배경 제거 후, 해부학적 표지를 사용하여 ROI의 위치를 표시함으로써 모든 시점에서 각 종양 모델 및 해당 대조군 마우스에 대해 동일한 ROI를 사용하십시오.Brucker MI 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 mm²당 초당 광자 수로 변환함으로써 모든 이미지의 평균 형광 강도를 결정하십시오. 형광 값을 촬영 각도의 함수로 도식화하고, 대조군 마우스에서 얻은 평균 형광 값의 표준 편차를 오차 막대로 적용하십시오. 이 그림에는 대표적인 정위성 종양 유발 마우스의 형광 이미지가 나타나 있습니다.본 연구에서는 원적외선 염료로 표지된 DOPS 나노 소포를 포함하는 SAPs가 마우스의 정위성 및 자연발생성 뇌종양뿐만 아니라 KBXN 마우스의 관절염 관절에 특이적으로 축적됨을 입증합니다. Mars 시스템의 주요 목적은 여기에서 보는 바와 같이 가장 정확한 측정이 가능하도록 형광의 최적 각도를 결정하는 것입니다. 이 동물의 최적 이미지 각도는 10도입니다.형광 광자 강도가 가장 높은 위치에서 SAP C-D-O-P-S-C-V-M 주입 전의 기선 측정을 수행하였으며, 주입 24시간 후 종양이 없는 대조군 마우스에도 유사한 처리를 실시하였습니다. 이 수치들은 유전 공학적으로 제작된 뇌종양 마우스 모델에서 얻은 유사한 데이터를 보여줍니다. 형광 이미지 및 광자 측정은 SAP C-D-O-P-S-C-V-M 주입 전 기선 상태, 주입 24시간 후, 그리고 9일 후에 각각 수행되었습니다.그래프를 통해 종양 모델 동물 tumor mute 49의 최적 영상 각도는 주사 후 24시간에는 20도이지만, 주사 후 9일에는 10도로 변화함을 알 수 있습니다. 이는 형광 신호의 변화가 종양 성장을 반영하는 형태학적 변화와 상관관계가 있음을 시사합니다. 이 표에 나타난 바와 같이, M-A-R-O-I 방법은 최적 영상 각도에서 회전 각도가 증가할수록 투영된 형광 신호가 감소함을 명확하게 보여줍니다.뇌종양의 경우, 형광 신호가 평균 7% 감소하였습니다. 동물의 신체 방향이 최적의 영상 촬영 각도에서 ±10도 이상 벗어났을 때 이러한 결과가 나타났습니다. ±20도에서는 형광 신호가 평균 21% 감소한 것으로 측정되었습니다.따라서 최적 각도에서 비교적 적은 편차만 발생해도 신호 강도가 상당한 비율로 감소할 수 있습니다. 이미지 포지셔닝에 M-A-R-O-I 기법을 활용하면 연구자는 더욱 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터를 생성할 수 있습니다. 최종적으로 M-A-R-O-I 방법을 사용하여 주사 24시간 후 SAPs C-D-O-P-S-C-V-M의 관절염 관절 표적화 능력을 평가하였습니다.이 동물은 관절염이 발생한 관절이 3개로, 점수 3점을 기록했습니다. 해당 광자 측정 그래프를 기반으로 한 관절염 쥐의 발가락과 발목 형광 이미지가 여기에 표시되어 있습니다. 10도 회전 시, 발가락과 발목에서 발견된 최적의 촬영 각도는 각각 140도와 120도입니다. 이 영상을 시청한 후, 연구자가 형광 이미지 분석을 위한 최적의 각도를 결정할 수 있게 하는 M-A-R-O-I 데이터를 준비하고 획득하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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