동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화 C. 엘레 배아

다음 실험의 전반적인 목표는 C 엘레강스 배발생 동안 발달 중인 조직 내에서 세포가 분열하는 것을 관찰하는 것입니다. 세포 분열을 조절하는 유전자를 연구하기 위해, 이는 관심 세포를 표지하는 형질전환 마커를 안정적으로 발현하는 C elgan 균주를 생성하거나 획득함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, D-S-R-N-A를 L에게 24-48시간 동안 먹이는 것으로 관심 유전자를 선택적으로 녹다운합니다.

RNAI 배아는 그래픽 자웅동체에서 수집되어 라이브 이미징을 위해 aros pad로 이식됩니다. 다음으로, 광시야 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 세포 분열 표현형을 시각화하기 위해 배아를 이미지화합니다. 결과는 바다 엘진의 배발생 동안 신경아세포가 어떻게 분열하는지, 그리고 그들의 분열에 필요한 유전자의 역할을 보여줄 것입니다.

이 방법은 발달 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 방법은 조직 발달, 세포 세포 통신, 세포 이동 또는 세포 극성 동안 유사분열 조절에 관여하는 유전자와 메커니즘을 밝힐 수 있습니다. 24-48시간 동안 대조군 또는 RNAI 플레이트에 보관된 적절한 마커를 발현하는 형질전환 웜을 사용합니다.

4-6 명의 무덤 성인을 선택하고 함몰 슬라이드에서 20-30 마이크로 리터의 M nine 버퍼로 옮깁니다.배아를 방출하려면 멸균 메스를 사용하여 정자 또는 외음부의 양쪽에있는 벌레를 자릅니다. 다음으로, 피펫 전구에 부착되어 배아를 통과할 수 있을 만큼 충분히 넓은 당긴 모세관을 사용하여 배아를 수집합니다. 이쑤시개에 붙인 속눈썹을 사용하여 배아를 갓 준비한 아로스 패드로 옮깁니다.

5개에서 10개의 배아로 구성된 그룹을 만들어 배아를 나란히 밀어 넣습니다. 커버 슬립으로 슬라이드를 덮고 필요한 경우 M nine 버퍼를 더 추가한 다음 예열된 액체 발라로 커버 슬립을 밀봉합니다. 자동 필터가 포함된 epi 형광 광시야 현미경을 사용합니다.

대물렌즈, 고해상도 CCD 카메라 및 고도로 전동화된 스테이지. 모두 소프트웨어로 제어됩니다. 이 시스템에는 LED와 E-M-C-C-D를 사용하여 가지고 있지 않지만 저배율로 배아에 대한 광독성을 제한합니다.

신경아세포를 이미지화하기 위해 배아에 수동으로 초점을 맞춥니다. 배율을 높이고 등쪽 간 대조를 받는 배아 또는 광시야 현미경에서 배쪽 폐쇄를 조기에 수행하는 배아를 선택합니다. GFP 및 텍사스 레드 필터를 선택하고 광시야 시스템에서 최적의 Z 평면을 결정합니다.

더 적은 수의 Zacks와 더 적은 시점을 사용하면 광독성이 감소하고 조리개도 30%로 닫히며 가능한 경우 광 강도를 줄이면 광독성을 더욱 줄일 수 있습니다. 또는 스캐닝 레이저 대물렌즈, E-M-C-C-D 카메라 및 고도로 자동화된 스테이지를 제어하는 소프트웨어와 함께 라이브 스캔 스윕 필드 또는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다. 이제 획득 설정이 최적화되었으므로 광시야 현미경에서 배아를 이미지화합니다.

RNAI 배아를 촬영하기 전에 먼저 대조 배아를 필름으로 촬영하는 것이 좋습니다. 스윕 필드 시스템으로. 4 88 및 5 61 100 밀리와트 레이저를 50의 슬릿과 300 밀리 초의 노출 시간으로 40% 출력으로 설정합니다.

이러한 설정은 다른 현미경마다 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾습니다. 그런 다음 60 또는 100 x 오일 이멀젼 대물렌즈로 전환합니다.

집중이 완료되면 2분마다 0.2미크론에서 20개의 Z 스택을 총 10분 동안 수집합니다. 노출 시간은 조정이 필요할 수 있습니다. 형광 현미경을 통해 배아를 생중계할 때 조리개를 닫고 더 적은 Zacks 또는 시점을 선택할 때 광독성을 고려해야 합니다.

노출 시간을 줄이면 가능한 경우 광독성을 제한할 수 있습니다. SW 필드 또는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하면 이 문제를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수집 소프트웨어를 사용하여 시간, 점 및 관심 있는 Z 평면을 결정합니다.

원하는 이미지를 여러 tiff로 내보냅니다. Image J와 같은 프로세싱 소프트웨어에서 관심 있는 각 시점과 채널에 대해 원하는 Z 평면을 열고 종종 몇 개의 평면에만 걸쳐 있는 스택 신경아세포를 만듭니다. 각 시점에 대해 Z 평면을 쌓고 Z 스택 투영을 만듭니다.

추가 채널에 대해 이 작업을 반복합니다. 원하는 시점에 대한 모든 Zack 투영이 완료되면 투영을 열어 시간 순서를 만듭니다. 각 채널에 대해 개별적으로 이 작업을 수행합니다.

각 채널에 대해 필요에 따라 밝기와 대비를 조정합니다. 필요한 경우 이미지를 회전합니다. 그런 다음 관심 영역을 선택하고 이미지를 자릅니다.

이제 병합된 채널 함수를 사용하여 병합된 이미지를 만듭니다. 각 채널에 대해 다른 색상을 선택합니다. 병합된 이미지를 RGB 파일로 저장하면 이미지를 보다 명확하게 시각화할 수 있습니다.

16비트 TIFF 이미지를 사용하고 편집에서 반전 기능을 선택하여 각 채널에 대한 그레이 스케일 이미지를 생성합니다. 미크론에 대한 관심 물체의 크기를 결정하려면 선을 그리고 그 길이에 이미징 매개변수에 의해 결정되는 픽셀의 크기를 곱합니다. 이제 계산된 길이의 비율을 미크론 단위로 나타내는 축척 막대를 만듭니다.

궁극적으로 최종 이미지를 8비트 tiff로 저장합니다. 원하는 경우 이미지 J 표피를 사용하여 tiff를 동영상으로 변환합니다. C 우아함의 형태 형성은 표피 세포 모양 변화, 이동 및 부착과 기저 증식 신경 아세포의 도움으로 인해 발생합니다.

표피 세포는 복부 정중선으로 이동하여 신경아세포 분열 배아를 연구하기 위해 단일 세포층을 형성하고, 안정적으로 coex 발현 및 GFP로 태그된 신경아세포 특이적 마커와 m cherry로 태그된 모계 주도 막 마커를 배쪽 인클로저 동안 증가된 배율로 이미지화했습니다. 신경아세포는 분열을 겪는 것을 시각화하였고, 신경아세포핵은 녹색으로, 주변 막은 빨간색으로 표시하였으며, 대조 배아에서 mCherry 막 프로브로 윤곽을 그리는 분열 신경아세포의 타임랩스 이미지를 대조 배아에서 분열하는 신경아세포를 더 잘 시각화하기 위해 광시야 현미경을 사용하여 캡처하였습니다. 각 채널은 그레이 스케일로 유지되었으며 이미지는 스윕 필드 컨포칼 현미경 대조군 배아를 사용하여 반전되었습니다.

햄 1 GFP와 M 체리 pH를 발현하는 Coex는 신경아세포가 분열하는 영역에서 이미지화되었습니다. ill 발현을 없애기 위해 RNAI로 처리된 동일한 배아를 광시야 현미경을 사용하여 시각화했습니다. 대조 배아와 달리, 많은 신경아세포는 분열 중에 멈추거나 퇴행했으며 스윕 필드 현미경을 사용하여 다핵이 되었습니다.

또한 많은 신경아세포가 분열 중에 멈추거나 퇴행하여 다핵화(multinucleate)가 되었다는 것도 분명했습니다. 이 기술은 조직 형성 중 이동하는 세포를 이미지화하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한 Zacks를 사용하여 더 빠른 이미징을 허용하는 경우 세포 내 역학에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.

또한 적절한 장비를 사용하면 이 기술을 사용하여 광유전학을 수행하기 위해 광 조정 가능한 프로브를 활성화할 수 있습니다. 또한 프렛 또는 프렛과 같은 현미경 기술을 적용하여 단백질, 단백질 상호 작용 또는 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.