Name: 조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 배우세요 조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용하여 쥐 Peyer 패치에서 plasmacytoid 수지상 세포를 생성하고 평가하는 방법을. Flt3L 처리 시 약 70%의 세포가 기증자 유래임을 확인할 수 있습니다.

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우리는 Drs에 감사드립니다. 유체 유전자 전달의 조언 알렉스 Gelbard와 빌렘 Overwijk. 이 작품은 NIH (AI098099, SSW), 암 후성 유전학의 MD 앤더슨 센터, 염증 및 암의 MD 앤더슨 센터 (SSW) 및 RE 바브 스미스 교육 기금 (HSL)에서 교부금에 의해 지원되었다.

기관 승인 마우스를 포함 여기에 설명 된 모든 실험 조작에 대해 사전에 취득해야합니다. 이들은 골수 전구 세포의 분리를위한 C57BL6 마우스의 사용을 포함, IFNAR - / - 입양 조혈 전구 세포의 이동 및 생체 내 사이토 카인의 과다 발현을위한 HGT의 사용에 대한받는 사람으로 마우스. 적절한 주거 및 동물 관리는 연구자 또는 기관에 의해 제공되어야한다. 또한, 기관 승인 유체 유전자 전달 (즉, 재조합 DNA 승인)에 사용 된 플라스미드를 위해 요구 될 수있다. 여기에 설명 된 연구는 UT MD 앤더슨 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 유체 역학 유전자 이동 (HGT) 이 단계는 생체 내 5 DC 확장을 위해 Flt3L 순환 유도하기 위해 CDP가의 입양 전송에 2 일이 전에 수행되어야한다. 홍보epare 적어도 5받는 사람 마우스 / 그룹. <ol><li> 효율적인 HGT을 달성하기 위해, 수신자 IFNAR의 혈관 - / - 마우스 (CD45.2의 +)은 5-10 분 동안 가열 램프에 마우스를 노출시킴으로써 넓혀진한다. </li><li> 제한 기 장치에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 꼬리를 소독. </li><li> 27 G 바늘을 사용하여 정맥 꼬리으로 멸균 PBS의 2 ㎖에 플라스미드 부호화 Flt3L 5 μg을 주입. 표시된 바와 같이 제어 코호트, 꼬리 정맥을 통해 빈 벡터 (pORF) 5 μg을 주입. </li><li> 꼬리 정맥 주입의 해로운 효과가 없는지 확인하기 위해 15 ~ 30 분 동안 쥐를 모니터링합니다. 2 일 동안 주거 시설에 마우스를 반환합니다. </li></ol> 2. 마우스 골수에서 조혈 전구 세포의 분리 이 단계 2 일간 HGT 후에 수행해야합니다. 받는 사람 IFNAR에 입양 전송을 위해 골수 전구 세포의 소스로 congenic CD45.1 + 마우스를 사용합니다 - /- 동물 (CD45.2 +). 이 프로토콜에서 congenic 균주는 기증자와받는 사람 유래 수지상을 구별 할뿐만 아니라 인해 MHC 불일치로 면역 매개 고갈을 방지하기 위해 필요합니다. 대략 10-20 생쥐 전송 실험을 위해 조혈 전구 세포의 충분한 수 (10 105 세포 / 수신자 마우스)를 제공하기 위해 요구 될 것이다. <ol><li> CO 2 질식 자궁 전위에 의해 10 congenic의 CD45.1 + 쥐를 안락사. </li><li> 절개 트레이에 각각의 도체를 삽입하고 70 % 에탄올로 복부와 다리를 소독. </li><li> 중반 복부에 절개를하고, 다리의 길이 아래로 피부를 절단, 각 다리에 복부의 피부를 통해 잘라. </li><li> 부드럽게 각 다리에서 피부를 제거하고, 절단 및 날카로운 가위를 사용 고관절에 시체에서 다리를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 날카로운 칼날을 사용하여 각 다리의 대퇴골과 경골에서 근육을 제거합니다. </li><li> 제거모두 날카로운 메스 대퇴골 및 경골의 말단 및 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 mM 나트륨 피루 베이트 및 50 μM의 β-메르 캅토 에탄올로 RMPI) 완전한 RPMI를 함유하는 배양 접시에서 뼈를 배치 . </li><li> 27 G 바늘 연결된 완전한 RPMI 1 ㎖를 함유하는 주사기를 준비한다. </li><li> 대퇴골 또는 경골의 한쪽 끝으로 27 G 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 뼈에 완전한 RPMI를 주입하여 대퇴골 또는 경골에서 골수를 세척합니다. 즉 골수 세포가 뼈에서 분리되고 확인, 이것은 시각적으로 흐린 나타나는 추방 미디어를 검출함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 완전히 골수 세포를 제거하기 위해 각각의 대퇴골과 경골 3 배를 세척 반복합니다. </li><li> 부드럽게 배양 접시에서 아래로 3 배를 세포를 피펫 팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 새의 cultur으로 스며 세포를 배치, 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 골수 세포를 전달하여 이물질을 제거전자 접시. 멸균 주사기 플런저의 끝이 부드러운 압력에 의해 여과기에 나타나는 세포 덩어리를 방해. </li><li> 를 Lyse 제조사의 지침에 따라 상용 RBC 용해 완충액으로 전체 골수 세포 현탁액에 존재 적혈구 (RBC). 2 ㎖ RBC 용해 buffer/4-6 X 10 7 세포 (하나의 마우스에서 일반적 세포) 및 RT에서 5 분의 배양 시간을 사용합니다. </li><li> (1X PBS + 2 mM의 EDTA는 + 1 % FBS), 펠렛 세포를 원심 분리하여 부드럽게 세척 흡입 10 ㎖ FACS 버퍼에 재현 탁 부드럽게 배지를 흡입, 500 XG에 4 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛으로 골수 세포를 씻으십시오 버퍼. </li><li> 단계 2.13에서 설명한대로 2 회 세척 총 들어, 세척을 반복한다. </li></ol> 3. 형광 활성화 된 셀 CDP가를 분리 (FACS)를 정렬 이 단계는, 초기 네거티브 선택 절차를위한 MidiMACS 세포 분리기와 MACS LD 컬럼에 액세스해야찬란 복합 항체로 염색 한 후 여러 가지 빛깔의 전구 집합을 정화하는 적어도 3 개의 레이저와뿐만 아니라 FACS 기계. <ol><li> 단계 2.14 초 세척 후에, 골수 세포를 센다. 단계 2.13에서 설명한대로 원심 분리하여 세포를 펠릿 FACS 완충액 30 μL 당 4 × 10 7 세포의 최종 농도를 달성하기 위해 FACS 완충액를 resuspend. </li><li> FACS를위한 세포를 제조 계보-음성 세포는 제 1 자기 비드 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 골수 혼합물로부터 혈통 양성 세포를 제거 네거티브 선택 기술에 의해 농축된다. CD3, CD19,의 CD11c, CD11b를, 그리고 테르-119 ABS : 음의 선택 절차, 조혈 계통의 마커를 인식하고 다음과 같은 상용 쥐 항 - 마우스 항체 (ABS)의 각 1 μg을 추가합니다. 애비는 FACS 버퍼에 30 ㎕의 세포 현탁액에 2 μL / AB의 볼륨에 추가해야합니다. </li><li> 30 4 ° C에서 세포 현탁액을 품어분. 단계 2.13의 설명대로 배양에 이어, FACS 완충액 10 ㎖로 두 번 세포를 씻어. </li><li> FACS 완충액으로 4 × 10 7 cells/40 μl의 최종 농도를 달성하기 위해 세포를 재현 탁. 세포 현탁액을 각각 40 μL 당 염소 항 - 쥐 IgG의 자기 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 단계 2.13에 설명 된대로 FACS 버퍼 10 ㎖로 세포를 씻으십시오. </li><li> FACS 버퍼 500 μL에 10 8 골수 세포까지를 Resuspend. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 MidiMACS 전지 세퍼레이터에 MACS의 LD 열을로드하고 2 ㎖의 FACS 버퍼를 사용하여 열을 사전 헹굼. </li><li> FACS 버퍼의 2.5 ㎖에 5 × 10 8 셀을로드, 열 골수 세포 현탁액을 적용합니다. 포집 관 (15 ML 원뿔 관을) 확인은 열 아래에 배치됩니다. 열 FACS 버퍼 / 워시 2 ㎖로 3 회 씻어에 충실 할 컬럼을 통과 세포를 수집혈통 음성 세포. 컬럼에서 용출 물질의 세포를 (씻어 통해) 계산합니다. </li><li> FACS에 의해 조혈 전구 부분 집합의 긍정적 인 선택을 수행하려면, 다음과 같은 형광 복합 애비와 얼룩 세포 : IL-7R (퍼시픽 블루), FLT3 (PE), 무서-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), C-KIT (APC.Cy7) 절대 플러스, CD3, CD19,의 CD11c, CD11b를, F4/80 및 Ter119 (모든 PerCP Cy5.5으로 표시)에 대한 감독 혈통 마커 애비의 혼합물. 100 μL의 총 부피의 각 AB의 0.5 μl를 사용합니다. 20 ~ 30 분 동안 4 ° C에서 세포 현탁액을 품어. </li><li> FACS 완충액에서 재현 탁하고 2.13 단계에서 나타낸 바와 같이 X 10 7 세포 / ml 2-3의 농도로 세포를 씻어. 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포를 필터링합니다. 이 마지막 단계는 FACS 기계를 막힘 방지하기 위해 매우 중요합니다. </li><li> FACS의 무대에서 FACS 튜브에 세포 현탁액을 놓고 CDP가 (린 - C-키트 싸다 CD115 + FLT3 +)를 정렬에표시된 마커 프로파일의 기초. 완전한 RPMI 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브의 정제 된 세포를 수집합니다. </li><li> FACS 실행의 끝 부분에 분류 세포의 절대 수를 기록한다. 입양 전송 실험을 위해 멸균 PBS의 단계 2.13에 resuspend에 표시된대로 원심 분리하여 펠렛은 세포. </li></ol> 4. CDP가의 입양 전송 이 단계는 일반적으로받는 쥐가 보관되어 동물 시설에서 수행됩니다. FACS 기계의 위치에 따라서는, 종래 양자 양도 동물 시설로 정제 된 선조 세포 집단의 전송을 포함 할 수있다. 전구 세포 현탁액은 멸균 보관하고 얼음에 전송해야합니다. <ol><li> 100 ㎕의 멸균 PBS의 총 부피의 10 5 정제 CDP가 희석하여 주입 세포 현탁액을 준비합니다. 27 G 바늘에 부착 된 주사기에 세포 현탁액을 놓습니다. </li><li> 받는 사람 노출 IFNAR - / - </suP&gt; 꼬리 정맥을 통해 주입 효율을 달성하기 위해 5 ~ 10 분 동안 가열 램프에 마우스 (CD45.2 +). </li><li> 제한 기 장치에 마우스를 놓고 70 % 에탄올로 꼬리를 소독. </li><li> 27 G 바늘을 사용하여 정맥 꼬리에 100 ㎕의 PBS에서 10 5 FACS 정제 된 CDP가 주입한다. </li><li> 꼬리 정맥 주입의 해로운 효과가 없는지 확인하기 위해 15 ~ 30 분 동안 쥐를 모니터링합니다. 주거 시설에 마우스를 반환합니다. </li></ol> 5. PDC의 PP 및 측정의 분리 배합량 <ol><li> 입양 전송 다음 7-10일에서받는 사람의 쥐를 안락사. 조심스럽게 절개하여 마우스를 열고 장 노출. </li><li> 전체 창자를 제거하고, PBS에 적신 종이 타월 위에 놓습니다. 미세 집게와 가위를 사용하여 작은 창자의 벽을 따라 표시되는 모든 프로파일을 수집합니다. C57BL6 및 IFNAR - / - 마우스는 일반적으로 발견 고립 림프 여포는 다른 5-10 PP / 마우스를 가지고소장 (18)을 따라. 보호 프로파일은 너무 신중하게 모든 보호 프로파일을 식별하고 해부 보장, 단 한 번의 마우스에서 종종 구조적으로 별개합니다. </li><li> PBS가 들어있는 페트리 접시에 프로파일을 배치하고 대변을 제거하는 집게를 사용합니다. 보호 프로파일을 청소 두 번이 절차를 반복합니다. </li><li> 50 ㎖에서 10 ㎖ 1X 행크 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 다이제스트 보호 프로파일은 37 ℃에서 1 시간 동안 격렬하게 교반 플라스크 </li><li> 멸균 주사기 플런저와 스트레이너를 통해 40 μm의 셀 스트레이너와 힘 세포의 상단 구획 정리 된 PP를 놓습니다. 15 ML 원뿔 관에있는 PP의 세포 현탁액을 수집합니다. </li><li> 37 % 퍼콜 용액 (RPMI 배지에서 37 % 퍼콜) 6 ㎖에 5 분,에 resuspend 500 XG에서 원심 분리하여 변형 된 PP 세포 펠렛. 부드럽게 퍼콜 단계 구배를 형성하기 위해, 세포 현탁액 아래 (RPMI 배지에 70 % 퍼콜) 70 % 퍼콜 용액 6 ㎖를 배치. </li><li> 20 분 원심 분리기 세포원심 분리기가 해소 800 XG를 톤. 단핵 세포는 70분의 37 % 년 인터페이스로 마이그레이션합니다. 원심 분리 후, 단핵 세포군은 계면 영역에서 조심 피펫에 의해 수집한다. 펠렛 원심 분리하여 세포를 수집하고 완전한 RPMI / 워시 50 ㎖에 두 번 씻는다. 큰 부피 퍼콜 완전한 제거를 보장하기 위해 사용된다. </li><li> CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE : 적응 적 전송 조상 (CD45.1 +) 또는받는 마우스 (CD45.2 +)에서 파생 된 쥐 올라가고을 감지하기 위해 다음 항체와 수집 된 PP 세포를 얼룩 . Cy7)의 CD11c (퍼시픽 블루), CD11b를 (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) 및 PDCA-1 (FITC) 절대. 단계 3.9 및 3.10에 표시된 PP 세포의 유동 세포 계측법 분석을 수행합니다. 자신의 CD11c + CD11b를하여 올라가고을 확인 - B220 + Siglec-H + PDCA-1 + 표현형. PDCS % 내지 x : 절대 PDC 번호는 다음 식에 의해 결정될 수있다탈 PP의 휴대폰 번호 = PP 올라가고. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

(- / - 마우스 예 IFNAR) 설명 입양 전송 기술은 여기에 PP 올라가고있는 불충분받는 생쥐의 PP PDC 인구에 CDP가의 기여를 평가했다. 미래의 실험에서는, PP의 PDCS는 FLT3 + CLP를 파생 여부 특히, PP의 PDCS 생성에 다른 전구 서브 세트들의 전위를 평가하는 것이 중요 할 것이다. 이 질문은 PP의 올라가고는 PP 적립 5를위한 IFNAR-STAT1 신호에 고유 민감한 이유는 불분명하게 남아 있기 때문에 중요하다, 그리고 PP의 PDC의 다른 장기에 올라가고와 유사한 발달 단서를 수행합니다. 이론적으로,이 방법은 모든 기관에서 PDC 인구 부족 생쥐에서 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 전사 인자 E2-2, PDC &quot;마스터 조절기&quot;의 결핍 마우스 (즉, TCF4 - / - 마우스), 쇼 눈에 띄는 P...

여기서 우리는 일반적인 돌기 세포 전구 세포 (CDP가이) Peyer의 패치 (PP)의 plasmacytoid 돌기 세포 (PDC) 인구에 상승을 줄 수 있는지 여부를 평가하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 전반적인 목표는 Peyer의 패치 (PP의 PDC)에 올라가고의 개발 규제를 평가하는 것이었다. 이 중요한 이유는 PP의 PDC의 골수, 혈액, 비장 등 다른 조직에서 발견 올라가고 다른, 따라서 그것이 PP의 올라가고 및 다른 PDC의 인구가 발달 및 / 또는 기능적으로 관련 있는지 불분명하다는 것이다. 구체적으로 올라가고 널리 I는 수신자 같은 수용체 7 빠른 IFN 분비 1-3 9 (TLR7 / 9) 자극에 반응, 조혈 시스템 내에서 (IFN) 생산 인터페론의 주요 유형으로 알려져있다. 그러나, PP의 올라가고 내가 TLR 길항제 자극 4,5에 대한 응답으로 IFN 유형을 생산 부족합니다. 또한, PP 올라가고는 골수와 비장에서 발견 PDC의 다른입력 신호를 필요로하는 난 (IFN) 수용체 (IFNAR1를) 인터페론 또는 IFN은 개발 및 / 또는 축적 5에 대한 분자 STAT1 신호. 이러한 데이터는 별개의 규제 메커니즘은 다른 장기에 올라가고 대 PP의 PDC는 (예를 들어, 골수, 비장) 5를 제어 가능성을 제안했습니다. 이 방법의 개발을 주도 이론적 근거는 수지상 세포 (DC) 생물학을 이해하는 최근의 진보에 근거했다. 대부분의 경우, 전부는 아니더라도, DC 부분 집합은 FMS 같은 티로신 키나제 수용체 3 (FLT3) 6-10 표현 조혈 전구 세포에서 파생되지만, DC 개발은 고전 골수성과 림프 경로에 제한되지 않습니다. 예를 들어, FLT3은 + 일반적인 골수 전구 세포 (CMP한다, 린 - IL-7R - 무서 1 - C-키트 + CD34 + FcγR LO / -) CDP가 (린 - C-키트 싸다 CD115 + FLT3 +) 일으키다, whic시간이 더 올라가고 기존의 DC (CDCS) 9,10로 분화. 대조적으로, FLT3 + 일반 림프 전구 세포 (CLP를, 린 - IL-7R + 무서-1 LO 형 c-Kit LO)은 올라가고 (11)에 주로 개발한다. 따라서, 종래의 연구는 일반적인 분석 골수, 비장 및 / 또는 혈액 PDC 서브 세트로 제한되어 있지만, PDCS는, Flt3L의 규제 하에서 적어도 두 별개의 조혈 전구 개체군에서 발생 나타낸다. 따라서, PP 올라가고을 생성하는 전구 인구 (들) 조사를 요구했다. PP 올라가고의 기원을 이해하는 것은 그들이 다른 PDC 집단과 일반적인 발달 경로를 공유하는지 여부에 있나, 또는 PP에서의 생성 중에 서로 다른 메커니즘을 활용합니다. 본원에 기재된 방법의 고유 한 이점은 조혈 전구 세포의 대체 입금받는 등 PP PDCS의 심한 결핍을 보여 생쥐의 사용이다. 유전자를 가진 쥐유전자 인코딩 TIC 삭제 IFNAR1 (IFNAR - / - 마우스) 또는 STAT1 (STAT1는 - / -) PP 올라가고 5 눈에 띄는 고갈을 공개했다. 따라서, 이들 균주를 대체 전송의 연구는 치명적인 조사 유력한 세포 절제 체제의 부재하에 수행 될 수 있도록, PP의 PDCS이 감소 된 환경을 제공한다. 여기에 제시된 방법의 추가 강도 Flt3L의 높은 순환 양을 자극하는 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)의 사용이다. 이 재조합 단백질의 주입 대, 생체 내에서 Flt3L을 유도 할 수있는 비용 효과적인 방법을 제공합니다. 우리의 실험실을 포함하여 많은 연구, 실험 조건 5,12,13의 다양한 사이토 카인의 양을 유도 HGT를 사용했다. DC의 노동 정확한 면역 기능의 분할은 면역학의 주요 관심입니다. 특히, PDC의 경구 관용과 조직의 항 바이러스의 중요한 매개체입니다반응은, 그러나 그들은 또한자가 면역과 암 14 ~ 17의 개발과 보존에 기여할 것으로 보인다. 여기에 설명 된 프로토콜은 PP 올라가고 조절 발달 메커니즘을 더욱 완벽하게 탐험 할 수 있습니다. 또,이 방법은 연구 PP PDC 함수를 평가할 수 있고, 프로파일 내의 다른 면역 인구의 규제와 기능을 이해하기 위해 확장 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>잭스</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL</td><td>JAX</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술용 핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 소형 쌍 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 대형 쌍 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &뮤; m 세포 여과기</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m 세포 여과기 캡 튜브</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>FACS 완충액</td><td></td><td></td><td>PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, 필터 멸균</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089102</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 쥐 IgG 마이크로 비즈</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-048-501</td><td></td></tr><tr><td>LD 컬럼</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 D3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553783</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553799</tr><tr><td>Rat anti-Ter119</td><td>BD Biosciences</td><td>553671</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 ( PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-4801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-5921</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCA-1 (PE. Cy7)</td><td>eBiosciences</td><td>25-5981</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>17-1152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-kit (APC. 싸이7)&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>47-1171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-1271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flt3 (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-1351</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.1 (APC. Cy7)</td><td>BD Biosciences</td><td>560579</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 (PE. Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-B220 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>25-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-0333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDCA-1 (FITC)</td><td>eBiosciences</td><td>Nov-72</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>e.g. BD Fortessa</td></tr><tr><td>열 램프</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 억제</td><td></td><td></td><td></td></tr>기 <tr><td>1 ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; G 바늘 (멸균)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 peyer의 패치에 쥐과 plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

이 프로토콜은 장 Peyer의 패치 (PP)에 plasmacytoid 수지상 세포 (PDC)를 생성하는 정제 조혈 전구 세포의 기능을 분석하는 방법을 자세히 설명합니다. 공통 수상 세포 전구 세포 (CDP가 린 - C-KIT LO CD115 + FLT3 +)을 FACS로 C57BL6 마우스의 골수로부터 정제 및 PP에서 상당한 PDC 인구 부족받는 마우스에 옮겼다,이 경우 IFNAR - / - 마우스는 전송받는로서 사용 하였다. 일부 마우스에서, 수상 세포 성장 인자 FLT3 리간드 (Flt3L)의 과발현 Flt3L-인코딩 플라스미드의 유체 역학적 유전자 전달 (HGT)를 사용하여, CDP가 전송 입양 이전에 시행되었다. Flt3L 과발현이 전송 (또는 내인성) 조혈 전구 세포에서 발생하는 DC의 인구를 확장합니다. 전구 전송 후 7-10일에서, 적응 적 전송 조상에서 발생 올라가고은에받는 사람의 세포를 구별했다전송 CDP가가 + CD45.1되는 사람과받는 사람이 CD45.2의 + 인에서 올라가고있는 CD45 마커 표현의 기초. PP의 PDC 인구에 기여하고 Flt3L에 대응하는 전송 CDP가의 능력을받는 마우스의 PP 단일 세포 현탁액의 유동 세포 계측법에 의해 평가 하였다. 이 방법은 다른 전구 인구 PDCS PP를 생성 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 사용될 수있다. 또한,이 접근법은 HGT 통해 순환 사이토킨을 조작하여 추정 발달 요인 및 / 또는 적절한 넉다운 녹아웃 또는 과발현으로 원종 서브 세트를 전송함으로써, PP에서 PDC 발달에 영향을 미칠 것으로 예측되는 인자의 역할을 조사하기 위하여 사용될 수있다 . 이 방법은 PP의 PDC는이 보호 프로파일의 다른 면역 하위 집합의 주파수 또는 기능에 미치는 영향을 분석 할 수있다. / - - 마우스, 심각하게 고갈 PP 올라가고 야생 형 동물에 대해, 따라서 allowi을 보여이 방법의 독특한 기능은 IFNAR의 사용이다치명적인 조사에서 교란 효과의 부재에있는 PP 올라가고의 NG의 재구성.

우리의 결과는 프로토콜 2와 3에 설명 된대로, 마우스 골수 세포에서 CDP가의 분리 (그림 1)에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. CDP가이 전체 골수 세포의 약 0.1 %를 포함하고, 약 4-6 × 104 CDP가 한 마우스로부터 단리 할 수있다. 입양 전송되면, CDP가이 올라가고 및 CDCS (10)로 분화. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51189/51189fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51189/51189fig1.jpg" /> CDP가의 FACS 정화 그림 1. 게이팅 전략. 골수 세포 C57BL6 마우스에서 수집되었다. 리니지 양성 세포는 계보 마커 (CD3, CD...

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

다음 절차의 전반적인 목표는 정제된 조혈 전구세포를 입양 전이시켰을 때, 장내 파이어 패치(Peyer patches)에서 형질세포양 수지상세포로 분화하는 능력을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 수지상세포 성장 인자인 FLT3 리간드를 인코딩하는 플라스미드를 형질세포양 수지상세포 결핍 마우스의 파이어 패치에 하이드로다이내믹 유전자 전이 방식으로 도입함으로써 수행됩니다.두 번째 단계에서는 자기 비드 분리법과 유세포 분석 분리법을 통해 야생형 골수에서 일반 수지상세포 전구세포를 분리합니다. 마지막 단계에서는 전구세포를 하이드로다이내믹 유전자 전달법으로 처리한 pyres patch plasmacytoid dendritic cell 결핍 마우스에 정맥 주사로 입양 이식합니다. 최종적으로, 공여체 조혈 전구세포 유래 PI's patch plasmacytoid dendritic cell 집단을 유세포 분석법으로 평가할 수 있습니다.이 방법은 pirate patch 내에 국소화되는 plasmacytoid dendritic cell의 발달 기원은 무엇인가와 같이 면역학 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법은 pyres patch plasmacytoid dendritic cell의 기원에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, plasmacytoid dendritic cell이 이러한 조직 내의 림프구 집단에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데에도 적용될 수 있습니다.입양 이식 2일 전, CD 45 2 양성 인터페론 알파 수용체 녹아웃 수용 마우스 5마리를 가열 램프 아래에서 5~10분 동안 두어 혈관을 확장시킵니다. 그 다음, 각 마우스를 보정기에 넣고 꼬리를 70% ethanol로 소독합니다. 이어서 27 gauge 바늘을 사용하여 각 동물의 꼬리 정맥에 5 µg의 플라스마와 코팅 flit three 리간드 및 2 mL의 멸균 PBS를 주입합니다.대조군 코호트의 경우, 5 µg의 empty vector를 주입합니다. 15분에서 30분 동안 마우스를 모니터링한 후, 사육 시설로 돌려보냅니다. 실험 당일, 10마리의 congenic CD 45 1 positive C 57 black six 마우스에서 적출한 대퇴골과 경골을 완전 배지가 담긴 배양 접시에 넣습니다.그 다음, 각 뼈의 한쪽 끝에 27 gauge 바늘을 삽입하고 complete media를 사용하여 뼈당 3회씩 골수를 배양 접시로 씻어냅니다. 배

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 마우스 골수에서 골수양 돌기 세포를 차별에 대한 절차를 설명합니다. 마우스 경골과 대퇴골, 그리고 골수 처리의 분리가 증명하고 있습니다. 세포 표현형 및 CPG를 사용하여 IL - 12 생산 다음과 성숙을 묘사한 분화 전후의 세포 형태를 보여주는 사진, 그림이 표시됩니다.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

돌기 세포에 의해 이차 림프​​ 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.

골수의 생성은 2 광자 영상에서 사용하기 위해 Murine 돌기 세포를 유래

이 동영상은 일반적인 림프구 전구 세포(CLP)에서 형질세포(plasmacytoid dendritic cell, pDC)를 생성하는 체외 분석을 보여줍니다. Fms-like tyrosine kinase-3 ligand(FL)가 있는 상태에서 γ조사된 공급 세포와 함께 정제된 CLP를 공동 배양하면 CLP는 비부착성 pDC로 분화되며, 유세포 분석을 사용하여 그 존재를 확인합니다.

In vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors(일반 림프구 전구 세포에서 Plasmacytoid 수지상 세포의 체외 생성)

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining

이 연구에서는 Flt3 리간드가 있는 상태에서 AC-6 공급세포와 공통 림프구 전구세포를 공동 배양하여 pDC를 효율적으로 생성할 수 있는 체외 배양 시스템을 제시합니다.

AC-6 공급 시스템을 사용하여 일반 림프 전구 세포에서 쥐 형질 수지상 세포의 체외 세대

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

여기, 선물이 개발 및 특성 tolerogenic 수지상 세포 (TolDCs) 하 고 그들의 immunotherapeutic 유틸리티를 평가 하는 프로토콜.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

배우세요 조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용하여 쥐 Peyer 패치에서 plasmacytoid 수지상 세포를 생성하고 평가하는 방법을. Flt3L 처리 시 약 70%의 세포가 기증자 유래임을 확인할 수 있습니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

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