조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

다음 절차의 전반적인 목표는 정제된 조혈 전구세포가 입양 이식 시 장 파이레 패치에서 플라스마세포이드(plasmacytoid dendritic cell)를 생성하는 능력을 조사하는 것입니다. 이는 먼저 플라스미드의 유체역학적 유전자 전달을 수행하여 수지상 세포 성장 인자를 암호화함으로써 달성됩니다. PI의 패치 plasmacytoid 수지상 세포 손상 마우스에 3 개의 리간드를 FLIT.

두 번째 단계에서는 일반적인 수지상 전구 세포를 자성 비드 분리 및 유동 분류를 통해 야생형 골수에서 분리합니다. 마지막 단계에서, 전구 세포는 유체역학적 유전자 전달로 처리된 장작암 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포 손상 마우스에 정맥 주사를 통해 채택 이식됩니다. 궁극적으로, donor hematopoietic progenitor cell derived PI's patch plasmacytoid dendritic cell population은 유세포 분석으로 평가할 수 있습니다.

이 방법은 해적 패치 내에서 국소화되는 플라즈마 Cy Dendri 세포의 발달 기원이 무엇인지와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 장작더미 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포의 기원에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 plasmacytoid dendritic cell이 이러한 조직 내의 림프구 집단에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 적용할 수 있습니다.

입양 이식 이틀 전, 5 개의 CD 45 2 양성 인터페론 알파 수용체 녹아웃 수혜자 마우스의 혈관을 열 램프 아래에서 5-10 분 동안 확장하십시오. 그런 다음 각 마우스에 대해 동물을 구속기에 넣고 꼬리를 70% 에탄올로 소독합니다. 다음으로, 27 게이지 바늘을 사용하여 5 마이크로 그램의 혈장을 주입하고 3 개의 리간드와 2 밀리리터의 멸균 PBS를 각 동물의 꼬리 정맥에 코팅합니다.

대조군 코호트의 경우 5마이크로그램의 빈 벡터를 주입합니다. 15분에서 30분 동안 생쥐를 모니터링한 후 사육 시설로 되돌려 보냅니다. 실험 당일, 10 개의 선천성 CD 45 1 양성 C 57 검은 6 마리의 마우스에서 절개 된 대퇴골과 경골을 완전한 배지가 들어있는 배양 접시에 놓습니다.

그런 다음 각 뼈의 한쪽 끝에 27게이지 바늘을 삽입하고 완전한 매체를 사용하여 뼈당 3회 골수를 접시에 씻어냅니다. 배출된 매체가 흐려진 것처럼 보이는지 확인하여 골수 세포가 제거되고 있는지 확인합니다. 배양 접시에서 배지를 3-5회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

그런 다음 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 골수 세포를 통과시켜 파편을 제거하고 멸균 주사기 플런저의 끝을 부드럽게 적용하여 세포 덩어리를 제거합니다. 여과기에서 세포를 회전시키고 상층액을 제거한 다음 적혈구를 실온에서 5분 동안 7번째 세포까지 4-6배 10배당 2밀리리터의 용해 완충액으로 적혈구를 이가 만듭니다. 그런 다음 골수 세포에 10ml의 팩스 버퍼를 추가하고 실온에서 500배 G에서 4분 동안 스핀다운합니다.

sup natin을 부드럽게 흡입한 후 펠릿을 10ml의 팩스 버퍼로 세척합니다. 다음으로, 항체 염색 및 세척 후 항체를 인식하는 조혈 계통 마커로 세포를 염색합니다. 염소 항 쥐 자성 마이크로비즈로 세포를 배양합니다.

마이크로비드 배양 중에 최대 LD 컬럼을 MIDI max cell separator에 로드하고 2ml의 팩스 버퍼로 컬럼을 미리 헹굽니다. 그런 다음 컬럼 아래에 15ml 원추형 튜브를 놓고 2.5ml의 팩스 버퍼에 있는 8번째 셀에 10의 5배를 컬럼에 로드합니다. 세척당 2ml의 팩스 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하여 컬럼을 통과하는 계통 음성 세포를 15ml 튜브로 수집합니다.

빠진 세포를 세십시오. 그런 다음 적절한 형광 접합 항체로 세포를 염색한 후 원하는 마커 프로파일을 기반으로 일반적인 수지상 전구 세포를 분류하기 위해 샘플을 팩스 튜브로 옮깁니다. 5밀리리터의 완전한 매체가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 팩스 정제된 세포를 수집한 다음 팩스 실행이 끝날 때 정렬된 세포의 절대 수를 기록합니다.

스핀 다운 후, 세포는 마우스 당 100 마이크로 리터 당 정제 된 공통 수지상 전구 세포의 10 배에서 5 배로 1 배 희석하고 세포 현탁액을 27 게이지 바늘이 장착 된 하나의 주사기로 흡인합니다. 그런 다음 CD 45 1 양성 전구 세포를 각 수용자 CD 45 2 양성 인터페론 알파 수용체 녹아웃 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다. 일반적인 수지상 세포 전구 세포에서 장을 제거하고 주입 된 쥐를 PBS에 적신 종이 타월에 조직을 놓습니다.

그런 다음 한 쌍의 가느다란 집게와 가위를 사용하여 소장 벽을 따라 보이는 모든 장작더미 패치를 수집합니다. 장작더미 패치는 단일 마우스 내에서도 구조적으로 구별되는 경우가 많으므로 모든 P'S 패치가 식별되고 해부되었는지 확인하십시오. PBS가 들어있는 페트리 접시에서 분리된 P'S 패치를 집게를 사용하여 대변을 제거하기 위해 세 번 씻습니다.

그런 다음 50 밀리리터 플라스크에 10 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 4 밀리리터 당 1 밀리그램으로 P'S 패치를 37 °C에서 격렬하게 저어 소화합니다. 한 시간 후, 소화된 PI 패치를 40마이크로미터 세포 여과기에 붓고 멸균 주사기 플런저를 사용하여 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 밀어 넣습니다. 여과된 세포 현탁액을 회전시킨 후 펠릿을 6ml의 37%per call 용액으로 재현탁하고 15ml 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 6ml의 70%당 통화 용액을 아래에 부드럽게 배치하여 통화당 단계 그라디언트를 형성합니다. 이제 분리와 함께 실온에서 800 배 G로 20 분 동안 세포를 분리합니다. 그런 다음 계면에서 단핵 세포 집단을 수집합니다.

수집된 세포를 펠릿화한 후 50ml의 완전한 배지로 두 번 세척합니다. 그런 다음 CD 45 1 양성 PYS 패치를 검출하기 위해 적절한 항체로 염색합니다. 양적으로 전달된 CD 41 양성 전구세포에서 유래한 Plasmacytoid 수지상 세포.

유세포 분석으로 세포를 분석합니다. 형질세포(plasmacytoid dendritic cell)는 CD 11 C 양성 clec H 양성 PDCA 1 양성 B 20 양성 CD 11 B 음성 표현형으로 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방정식을 사용하여 plasmacytoid dendritic cells의 절대 수를 결정합니다.

이 점도표는 일반적인 수지상 전구 세포의 분리를 위한 게이팅 전략을 나타냅니다. 쥐의 골수 세포의 경우, 방금 시연된 바와 같이 일반적인 수지상 전구 세포는 전체 골수 세포의 약 0.1%를 차지하며, 10에서 4분의 1까지 대략 4-6배를 차지합니다. 이 중 한 마리의 마우스에서 세포를 분리하여 유세포 분석으로 PI의 패치 plasmacytoid 수지상 세포를 식별할 수 있습니다.

초기 전방 및 측면 산란 게이팅 전략이 사용된 후 CD 11 C 양성 clec H 양성 세포에 대한 게이팅이 사용됩니다. 인터페론 알파 수용체 녹아웃 마우스는 야생형 마우스에 비해 pys 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포가 크게 감소했습니다. 일반적인 수지상 전구 세포(dendritic progenitor cell)는 또한 기존의 수지상 세포(dendritic cell)로 분화합니다.

플라스마세포(plasmacytoid dendritic cells)와 대조적으로, CD 11 C positive clec H negative, conventional dendritic cell은 야생형 마우스와 녹아웃 마우스 모두에서 비슷한 양으로 관찰됩니다. 따라서 인터페론 알파 수용체 녹아웃 마우스는 치사량 방사선 조사의 영향 없이 PS 패치 플라스마세포이드 수지상 세포 재구성을 검사할 수 있는 기회를 제공합니다. 방금 시연된 바와 같이 야생형 일반 수지상 전구 세포를 인터페론 알파 수용체 녹아웃 마우스로 이식하는 것은 PI 패치 플라스마세포이드 수지상 세포의 증가를 자극합니다.

또한, FL 3 리간드 유체역학 유전자 전달을 사용한 전처리는 PI 패치에서 플라스마사이토이드 수지상 세포 확장을 더욱 향상시키는데, 이는 전달된 공통 수지상 전구 세포와 내인성 FL 3 양성 전구 세포가 파이러스 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포를 유도하여 FL 3 리간드에 반응한다는 것을 의미합니다. 두 조건 모두 또한 CD 11 C positive clec H negative conventional dendritic cell production을 자극하며, 이는 conventional dendritic cell의 발달 기원과 일치합니다. PYS 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포는 clec H, PDCA 1 및 B two 20 및 LAC CD 11 B.In 추가를 포함한 전통적인 플라스마사이토이드 수지상 세포 마커를 발현했으며, FL 3 리간드 유체역학적 유전자 전달과 전달된 공통 수지상 전구세포를 모두 수용하는 인터페론 알파 수용체 녹아웃 마우스의 PYS 패치를 분석한 결과, 플라스마사이토이드 수지상 세포의 약 70%가 공여자 CD 45 1 양성 일반 수지상 전구세포에서 유래한 것으로 나타났습니다.

종합적으로, 이러한 데이터는 일반적인 수지상 전구 세포의 채택 전달이 생체 내에서 FL 3 리간드 매개 신호에 반응하여 PI 패치 플라스마사이토이드 수지상 세포 집단을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 pars 패치 plasmacytoid D cell을 분리하고 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.