Name: 4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 학습하세요 4D 공 초점 현미경을 이용한 제브라피쉬 두개안면 형태 형성 분석 방법입니다. 실시간 조직 운동 관찰로 야생형과 돌연변이 배아의 차이를 비교하여 발생 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그들의 전문적인 물고기 케어 멜리사 그리핀과 제나 Rozacky 감사합니다. PDM 감사 EGN 지원, 관용과 인내를 작성. 이 작품은 JKE에 NIH / NIDCR R01DE020884에 의해 지원되었다.

1. 축산 및 돌연변이 대립 유전자 <ol><li> (21) 기술로 제브라 피쉬를 올리고 번식. </li><li> 본 연구에서 사용 된 제브라 피쉬의 돌연변이 대립 유전자는 16 b1059 smad5 B1100 (22)와, SMO의 b577 23 PDGFRA했다. 이 zebrafish의 변종에 대한 소스는 ZIRC 있습니다. </li></ol> 2. 솔루션 및 도구의 준비 참고 : 모든 솔루션과 구현이 사전에 향후 사용을 위해 저장 될 수있다. <ol><li> 이전 21 설명한 바와 같이 배아 미디어 (EM)을 확인합니다. </li><li> 4g / L MS-222 (Tricaine)을 확인합니다. 450 ㎖의 멸균 물에 4g의 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 녹입니다. 솔루션에 2g MS-222를 추가합니다. 7.0-7.2 내에서의 pH를 조정합니다. 500 ml의 총 부피에 멸균 물을 추가합니다. </li><li> 선택 사항 : 4g / L 정향 오일을 확인합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 0.2 g의 순수한 정향 오일의 무게를. 50 ㎖의 총 부피에 EM을 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </li><li> 3 % methylcellulo을그 자체. 종기에 EM + 0.1 M HEPES 50 ㎖를 가져옵니다. 열에서 제거. 용액이 균질 할 때까지 1.5 g의 메틸 저어. 4 ℃에서 보관 </li><li> 0.2 % 아가로 오스를 확인합니다. 50 ㎖의 EM 0.1 g 아가로 오스를 추가합니다. 전자 레인지 나 핫 플레이트에 종기에 EM을 가져오고 아가로 오스가 용해되어 있는지 확인합니다. 4 ° C에서의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 500 μL의 볼륨으로 나누어지는 주의 : 필요에 따라 볼륨이 조절 될 수있다. </li><li> 모세관 부지깽이를 확인합니다. 0.9 mm의 ID 모세관 내부의 최고 접착제 한 방울을 넣습니다. 라인 약 3 ~ 4 MM은 튜브의 끝을지나 확장되도록 모세관 내부 6파운드 테스트 모노 필라멘트 낚시 줄의 4-5 cm 길이를 삽입합니다. </li><li> 표본 당 두 개의 다리를 커버 슬립을 확인합니다. 중간 자유를 떠나 24 X 60-1 커버 유리의 각 끝에 슈퍼 접착제 22 X 22-1 커버 유리. 오래된 일 미만의 배아를위한 싱글 (​​끝 당 1 작은 커버 유리를) 확인 1 ~ 4 D는 태아를 위해 (끝마다 서로의 상단에 2 개의 작은 커버 유리) 두 배배아 오일 또는 그 이상 오래 AYS, 또는 트리플 (끝마다 서로의 상단에 3 작은 커버 유리). </li><li> 고진공 그리스와 10 ML의 주사기를 채우십시오. 참고 : 진공 그리스는 오랜 기간 동안 표본의 탈수를 방지하기 위해 밀봉 역할을, 그리고 더 많은 휘발성 실란트에 비해 독성에 대한 낮은 가능성이있다. </li></ol> 3. 공 초점 현미경에 대한 설치 제브라 피쉬 배아 (그림 1 참조) <ol><li> 마취 매체를 준비합니다. 완전히 액체까지 20 초 간격으로 레인지 작동으로 0.2 % 아가로 오스 나누어지는 용융. 0.2 % 아가로 오스의 195 μL에 0.2 % 아가로 오스, 4 G / L 정향 오일의 5 μL의 192 μL로 MS-222의 8 μl를 섞는다. 42 ° C에서 가열 블록에 유지합니다. 참고 : MS-222에 긴 노출이 배아 제브라 피쉬 (24)에서와 정향의 기름보다 강한 발달 지연의 원인이됩니다. </li><li> 필요한 경우 수동으로 부화 형질 전환 배아 직전에 분석을 분석 할 dechorionate. 집게를 사용하여, 천천히 TE배아가 해제 될 때까지 개방 융모막 아칸소. </li><li> 제브라 피쉬 배아를 마취. MS-222 배아 매체의 ML 24의 4 G / L 주식의 1 ML을 추가합니다. 또한, 물고기, 물 (24) 24 ㎖를 4 G / L 정향 오일의 390 μl를 추가합니다. 참고 : 정향 오일의 역할은 천천히 그렇게 시간 경과 현미경 전에 적어도 15 ~ 20 분을이 단계를 수행합니다. </li><li> 위로 향하는 다리를 커버 슬립의 중심 공간 주위에 진공 그리스의 구슬을 놓습니다. 천천히 및 교량 및 커버 슬립의 가장자리 안쪽에 인접 부드럽고 연속 구슬 만들기, 주사기 밖으로 진공 그리스를 밀어 넣습니다. </li><li> 나무 주걱을 사용하여 다리를 커버 슬립의 중간에 4 % 메틸 셀룰로오스의 원을 확산. </li><li> 이미지에 표시 할 배아를 전송합니다. 배아가 마취되면 유리 피펫에를 그립니다. 배아는 펫에서 액체의 바닥에 가라 앉을 수 있도록 수직으로 펫을 잡고. 아가로 오스 용액에 피펫을 이동하고 배아 드롭 할 수아가로 오스에. 액체를 추방하지 마십시오. </li><li> 표본을 놓습니다. 피펫에 약간의 아가로 오스 솔루션과 배아를 그립니다. 메틸 위에 아가로 오스 솔루션의 드롭에 배아를 추방. 메틸에 아래쪽으로 배아를 밀어 이미징 원하는대로 배아 방향을 모세관 포커를 사용합니다. </li><li> 시료를 밀봉. <ol><li> 아래로 향하도록 장착 된 하나의 상단에 하나의 다리를 커버 슬립을 놓습니다. 다리가 모두 커버 슬립에 직접 연락 아가로 오스 드롭 씰을 만들 때까지 끼워 커버 슬립의 양쪽에 일정한 압력을 적용합니다. 배아가 제대로 지향되어 있는지 확인합니다. </li><li> 진공 그리스 구슬에 균열과 틈새를 부드럽게하는 유리를 따라 나무 주걱을 문질러. 가장자리에서 여분의 기름을 닦아. </li></ol></li></ol> 4. 형질 전환 제브라 피쉬 배아의 시간 경과 공 촛점 이미징 (이 프로토콜은 혈구 LSM 710 공 초점 현미경 우리에게 최적화되어 있습니다ZEN 이미징 소프트웨어를 보내고, 다른 시스템에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다.) <ol><li> 장비를 활성화합니다. 공 초점 현미경을하고 있으며, 외부의 레이저 장치의 전원을 켭니다. 공 초점 현미경에 연결된 컴퓨터의 전원을 켜십시오. 열기 공 촛점 이미징 소프트웨어 및 이미지 수집 컨트롤을 활성화하기 위해 &quot;시작 시스템&quot;을 선택합니다. </li><li> 가열 단계를 준비​​합니다. 공 초점 현미경의 준비 플랫폼을 낮추고 위치 밖으로 대물 렌즈를 이동합니다. 전자 가열 단계로 기본 단계를 교체합니다. 가열 단계에 대한 컨트롤러의 전원을 켜고 29.5 ° C의 온도를 설정 </li><li> 보기의 분야에서 시료를 배치합니다. 무대에 탑재 된 표본을 놓습니다. 위치로 20X 대물 렌즈를 이동하고 준비 플랫폼을 올립니다. 가시 광선 에미 터를 활성화하고 접안 렌즈를 통해보고. 시야에서 태아의 머리를 가운데. </li><li> 실험 설정을 정의합니다. <ol><li> 선택하여 형광 채널을 활성화감지 할 수있는 형광 파장은 각 채널의 색상 룩업 테이블 (LUT)을 선택합니다. 필요한 경우, 필요한 레이저 (RFP에 대한 예를 들어, 561 nm의)에 설정하는 소프트웨어에서 수동 제어를 사용합니다. 각각의 형광 채널에 대해, 10.0 레이저 강도와 600 ~ 700 사이의 광전자 증 배관 전압 (HV 또는 이득)을 설정합니다. 4 평균 비트와 16 비트의 비트 심도를 설정합니다. </li><li> Z-스택과 시간 시리즈 모듈을 활성화합니다. 5 ㎛ 이하 Z-해상도 핀홀을 설정하고 제안 된 최적의 거리 Z-간격을 설정합니다. 주 : 일반적으로 5 μm의 Z-Z 해상도는 각 스택에 대한 이미지가 충분히 빠르게 수집 할 수 있도록하는 개별 세포를 확인하는 동안 특정 시점에서 배아의 &quot;스냅 샷&quot;. 평균화를 낮추면 이미지 당 시간의 양을 감소시킨다. </li><li> 이미지 사이의 원하는 시간 간격 (일반적으로 10 ~ 20 분) 및 실험의 전체 길이를 정의. </li></ol></li><li> 위치 설정정보. <ol><li> 라이브 모드로 카메라의 전원을 켜십시오. 초점을 조정하고 필요한 경우 형광을 볼 레이저 강도를 증가시킨다. 원하는 경우, 넓은보기에 대해 0.6 디지털 줌을 설정합니다. </li><li> 관심의 모든 구조를 볼 수 있습니다 있도록 무대를 배치하고 전방 가지 등쪽과에 대한 시야의 여지가있다. 형광의 상한과 하한을 통해 배아 초점. 첫 번째와 마지막 Z-스택 슬라이스 위치 이러한 제한을 넘어 적어도 100 μm의 이상을 설정합니다. </li></ol></li><li> 형광 강도를 최적화합니다. <ol><li> 표시를 범위로 표시 LUT를 설정합니다. 형광 구조는 이제 흰색 표시해야하고, 시야의 나머지 (무 검출) 파란색 또는 검정색이어야한다. </li><li> 단지 포화 곳 아래 수준으로 HV / 이득을 증가 (빨강) 픽셀이 나타납니다. 필요한 경우, 그래서 배경의 대부분이 (파란색) 검출되지 오프셋 조정합니다. 참고 : 작은 구멍 직경 증가 레이저 강도를 이미지 데프 모두 개선inition 있지만, 레이저의 강도는 조직 생활을 유지하기 위해 낮게 유지해야합니다. 증가 HV / 이득과 작은 구멍 직경 (&lt;5 μm의)는 일반적으로 증가 레이저 강도에 바람직하다. </li><li> 충분히 넓은 4 세트의 평균을, 적시에 이미지를 수집하기 위해 작은 구멍 직경을 유지합니다. Z-간격은 항상 핀홀 직경 제시된 최적의 거리로 설정되어야한다. 다른 설정으로 짧은 검사 (평균 = 1)을 수행하고, 원하는 해상도를 달성 최소 레이저 강도를 사용합니다. </li></ol></li><li> 원하는 시간에 대한 실험을 실행합니다. 그 후, 가열 단계에서 배아를 제거하고 천천히 커버 슬립을 분리합니다. 30mm 페트리 접시에 EM의 커버 슬립과 배아 잠수함. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 커버 슬립 떨어져 배아를 씻어 페트리 접시에서 coverslip을 제거합니다. 지속적으로 개발하는 28.5 ° C의 배양기에 배아를 놓습니다. </li><li> 성장을 비교. 실험의 끝에, 개별 ZS 걸릴유사 실험의 시작 부분에 시편에 개최하지만, 한 아가로 오스 장착 형제 배아의 압정 이미지는 28.5 ° C 배양기에서 EM에 제기되었다. </li><li> 필요에 따라 인두 아치를 측정한다. 측정은 일부 촛점 스위트 소프트웨어에서 수행 될 수있다. 여기에서 찾을 측정은 각각의 프레임. LSM 파일을 가져 오기 및 Z-투영하여 Fiji25를 사용하여 수행 하였다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

시간 경과 공 초점 현미경 개발의 분석을위한 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 신경 능선 세포 레이블 유전자 변형을 사용하여 중요한 신호 전달 경로에 대한 돌연변이 있습니다 제브라 피쉬에서 인두 아치 형태 형성을 연구하는 방법의 유용성을 보여줍니다. 조직 수준뿐만 아니라 시간 경과 분석도 휴대 규모 28에서 분석에 적용, 분석한다. 대부분의 널리 사용되는 제브라 피쉬의 방법은 morpholinos와의 미세 주입, mRNA를, 또는 유전자 변형 구조뿐만 아니라 태아 사이의 이식 등의 시간 경과 현미경 실험에 통합 할 수 있습니다. 체류 현상 조직의 분석은 형광 라벨 조직에 능력에 의해 크로스 토크없이 다른 형광체의 원하는 수를 검출하는 공 초점 현미경의 능력에 의해 제한된다. 제브라 피쉬 배아의 클러치에서 영상화 할 수있는 사람의 수는 심각하게 제한되어 있지만 고급 기술동일한 시간주기에서 여러 배아의 자동 촬상을 허용한다. 쉽게 이른 시점에서 식별되는 돌연변이의 저속 분석을 수행하고자 할 때 특히 유용하다. ...

두개 안면 형태 형성은 여러 세포 유형 간의 상호 협조를 필요로 복잡한 다단계 과정이다. 두개 안면 골격의 대부분은 신경 능선 세포에서 파생되는 많은 인두 아치 1이라는 일시적인 구조로 지느러미 신경 튜브에서 마이그레이션해야합니다. 많은 조직과 같이, 두개 안면 골격 형태 형성의 발달은 특정 시점에서 배아의 정적 이미지에 의해 이해 될 수있는 것보다 더 복잡하다. 그것은 시간이 많이 걸리는 수행 할 수 있지만, 생체 시간 경과 현미경은 배아의 세포와 조직에서 연속보기를 제공합니다. 시간 경과 시리즈의 각 이미지는 다른 사람에게 컨텍스트를 준다, 그리고 현상이 발생하는 이유를 추론보다는 그 시간에 발생하는 것을 추론을 향한 구도자 이동하는 데 도움이됩니다. 생체 내 이미징에 따라서에 실험적인 접근을위한 강력한 설명 도구입니다형태 형성을 안내 경로를 해체. 제브라 다니오의 rerio는 척추 동물의 배아 발달의 인기 유전 모델이며, 특히 형태 형성의 생체 내 이미징에 적합합니다. 현대, 형질 전환 게놈 수정을위한 편리한 방법은 빠르게 제브라 피쉬 연구원에 사용할 수있는 도구의 수를 진행하고 있습니다. 이 도구는 유전자 조작과 현미경 이미 강력한 방법을 향상시킬 수 있습니다. 거의 모든 원하는 유전 적 맥락에서 거의 모든 조직의 생체 내 이미징은 환상보다 현실에 더 가깝다. 인두 아치의 형태 형성 운동은 신경 능선과 인접한 상피, 외배엽 모두 내배엽 사이의 상호 작용을 신호에 의해 유도된다. 두개 안면 골격 요소의 형태 형성을 구동하는 데 필요한 상피 세포에 의해 표현 된 다양한 신호 분자가있다. 이러한 신호 분자 중, 소닉 더 헤지 호그 (쉬) 매우 중요 F입니다또는 두개 안면 개발 2-8. 쉿은 구강 외배엽 및 인두 내배엽 2,6,9,10 모두에 의해 표현된다. 내배엽에서 쉬의 표정은 아치 (10), 아치 (10) 내의 신경 문장의 패턴, 그리고 두개 안면 골격 (11)의 성장의 형태 형성의 움직임을 조절한다. BMP 신호는 두개 안면 개발 (12)에 대한 매우 중요합니다 및 인두 아치의 형태 형성을 변경할 수 있습니다. BMP 신호는 인두 아치 13, 14 내 문장의 지느러미 / 복부 패턴을 조절한다. 제브라 피쉬의 smad5의 중단은 심각한 구개 결함과 중간 선 (15)에 적절하게 융합하는 메켈의 연골의 오류가 발생합니다. 또한 돌연변이는 또한 2 차, 3 차 및 중앙선에 15 융합 때때로 제 4 인두 아치 요소 복측 연골 성분의 감소 및 융합을 표시. 이러한 융합은 강력하게 된 BMP 신호 전달이 인두 요소의 형태 형성을 지시하는 것이 좋습니다. PDGF 신호는 두개 안면 발전을 위해 필요하지만, 인두 아치 형태 형성에 알 수없는 역할을 가지고 있습니다. 마우스와 제브라 피쉬 PDGFRA 돌연변이는 모두 깊은 midfacial clefting 16-18있다. 적어도 제브라 피쉬이 midfacial clefting 적절한 신경 능선 세포의 이동 (16)의 실패에 기인한다. 신경 능선 세포들은 인두 아치를 입력 한 후 PDGFRA을 표현하기 위해 계속합니다. 또한, PDGF 리간드는 얼굴 상피 세포에 의해 표현되고, 인두 아치 16,19,20에서, 따라서 PDGF 신호는 마이그레이션 다음 인두 아치의 형태 형성에 중요한 역할을 할 수있다. 그러나, PDGFRA 돌연변이의 인두 아치 수행되지 않은의 형태 형성의 분석. 여기, 우리는 pharyngul의 생체 공 초점 현미경에 보여단 형질 전환 제브라 피쉬와이 기간 내에 인두 아치의 형태 형성을 설명합니다. 우리는 더 BMP, PDGF, 그리고 쉬의 신호 전달 경로를 방해 돌연변이에 의해 영향을받는 조직의 행동을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>6lb 테스트 모노필라멘트 라인</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>아르곤 레이저</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜빙, 100mm, 0.9mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>정향 오일</td><td>Hilltech 캐나다, Inc.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>다우 코닝</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 건식조 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리, 24 x 60-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기</td>성 <td>시그마-알드리치</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리카인-S</td><td>웨스턴 케미컬, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

4d 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

시간 경과 영상은 형태 형성의 과정을 직접 관찰 할 수있는 기술, 또는 모양의 세대입니다. 때문에 광학적 선명도와 유전자 조작에 복종 할 의무에, 제브라 피쉬 배아는 살아있는 배아에서 형태 형성의 시간 경과 분석을 수행 할 수있는 인기 모델 생물이되고있다. 라이브 제브라 피쉬 배아의 공 촛점 이미징은 그 조직이 지속적으로 같은 유전자 또는 주입 염료로, 형광 마커로 표시되어 있어야합니다. 프로세스는 배아 마취 건강한 발달이 정상적으로 진행되는 방식으로 제 위치에 유지되는 것을 요구한다. 이미징을위한 매개 변수에는 다음과 같은 세 가지 차원의 성장을 고려하여 개발의 빠른 스냅 샷을 가져 오는 동안 개별 셀 해결의 요구에 균형을 설정해야합니다. 우리의 결과는 형광 표지 된 제브라 피쉬 배아의 생체 촬상있는 장기를 수행하고있는 다양한 조직 행동을 검출하는 능력을 입증두개 안면 기형을 일으키는 원인이되는 뇌 신경 능선. 마취 및 장착으로 인한 개발 지연을 최소화하고, 배아는 프로세스에 의해 무사히입니다. 시간 경과 이미징 배아는 개발 이후 지점에서 액체 배지로 돌아 왔고, 이후 몇 군데 또는 고정 할 수 있습니다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 잘 특성화 운명 매핑 및 이식 기술, 영상의 증가 풍부한 원하는 조직이 가능합니다. 따라서, 생체 내 이미징의 시간 경과가 돌연변이 및 미세 주입 배아의 분석을 포함하여 제브라 피쉬의 유전 적 방법으로 강력하게 결합한다.

주동이의 방향 (동영상 1)에서 이동하는 동안 야생 형 배아에서 신경 능선 인구 다음, 인두 아치 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 축을 따라 연장. 30시간 포스트 수정 (HPF)에서, 제 인두 아치의 전방 / 후방의 길이는 1.8-1.9 배 지느러미 / 복부 높이 사이입니다. 지느러미 / 복부 신장 빠른 36.5 HPF까지 전방 / 후방 연장보다 꾸준히 진행된다. 여기에서, 지느러미 / 복부 높이의 고원 약 104 μm의 48 HPF를 통​​해. 전방 / 후방의 확장은 전체의 전방 / 후방의 길이가 48 HPF에서 1.95 배 지느러미 / 복부 높이 HPF 36.5에서 1.5 배 지느러미 / 복부 높이 아래에서 증가, 48 HPF를 통​​해 계속됩니다. 그 앞쪽 끝에서 첫 번째 인두 아치 상악 (등쪽)과 하악 구강 외배엽으로 구분 (복부) 도메인을 형성한다. 첫 번째 인두 아치의 상악 도메인은 F를 측정한다구강 외배엽의 후방 정점에의 말단 ...

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

본 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 머리에서 인두궁(pharyngeal arch)의 움직임을 관찰하고 특성화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형질전환 제브라피시 배아를 마취 성분이 포함된 아크로스트 겔(acrost gel)에 임베딩합니다. 두 번째 단계는 아가로스로 임베딩된 배아를 현미경 슬라이드 위의 메틸셀룰로오스(Methylcellulose) 한 방울에 고정하는 것입니다.다음으로, 진공 그리스를 사용하여 배아를 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 밀봉합니다. 최종적으로 타임랩스 공초점 현미경을 사용하여 야생형과 돌연변이 제브라피쉬의 차이 및 인두궁의 형태 형성 운동을 관찰합니다. 정지 영상법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 인두궁의 발달 과정을 실시간으로 포착하여, 연구자가 형태 형성에 결정적인 조직의 움직임을 직접 관찰할 수 있다는 점입니다.브릿지 커버 슬립을 만들려면, 24 by 60 커버 글라스의 양 끝에 22 by 22 커버 글라스를 순간접착제로 부착합니다. 이때 중앙 부분은 비워 둡니다. 배아의 연령이 하루 미만인 경우 단일 슬립을 제작합니다.1~4일 된 배아의 경우 2중으로, 5일 이상 된 배아의 경우 3중으로 준비합니다. 그리고 각 시료당 2개의 브릿지 커버슬립을 사용하십시오. 이제 10 mL 주사기에 고진공 그리스를 채웁니다.0.2% liquid aros로 신선한 마취제를 준비하고 42 °C 가열 블록에서 유지합니다. 부화하지 않은 형질전환 배아의 난막을 수동으로 제거하려면, 배아가 자유로워질 때까지 코리온(chorion)을 천천히 찢어 엽니다. 이제 난막이 제거된 배아를 MS 222와 마취제가 포함된 깨끗한 배지로 옮깁니다.브릿지 커버슬립을 준비하려면, 시린지에서 진공 그리스를 천천히 밀어내어 브릿지와 커버슬립 가장자리의 안쪽 및 인접한 부위에 매끄럽고 연속적인 비드 형태가 되도록 도포합니다. 브릿지와 커버슬립 사이의 중앙에 4% Methylcellulose를 원형으로 펴 바릅니다. 배아가 마취되면, 이를 유리 피펫으로 흡입합니다.피펫을 수직으로 세워 배아가 피펫 내 액체 바닥으로 가라앉게 합니다. 그런 다음 피펫을 agro 용액 속으로 이동시키고, 액체를 배출하지 않은 상태에서 배아가 agro 용액으로 떨어지게 합니다. agro 용액과 배아를 함께 피펫으로 흡입합니다.그 다음 배아를 aro 용액 한 방울 속에 배출하십시오. 메틸셀룰로오스 위에 놓습니다. 배아를 메틸셀룰로오스 쪽으로 밀어 내리고, 시료를 밀봉하기 위해 이미징에 원하는 방향으로 배아를 정렬하십시오.장착된 커버 슬립 위에 브릿지가 있는 커버 슬립 하나를 아래 방향으로 놓습니다. 브릿지가 직접 접촉하고 아가로스 방울이 두 커버 슬립 모두에 밀봉될 때까지 샌드위치처럼 겹쳐진 커버 슬립의 양쪽에 균일한 압력을 가합니다. 배아가 올바른 방향으로 위치해 있는지 확인합니다.나무 어플리케이터를 유리 표면을 따라 문질러 진공 그리스 층의 균열과 틈새를 매끄럽게 만듭니다. 가장자리에 묻은 과잉 그리스를 닦아냅니다. 공초점 현미경과 외부 레이저 장치를 활성화합니다.또한 공초점 현미경에 연결된 컴퓨터의 전원을 켜고 시스템 시작과 공초점 이미징 소프트웨어를 선택하십시오. 다음으로, 공초점 현미경의 스테이지 플랫폼을 낮추고 대물렌즈를 위치에서 벗어나게 이동시킵니다. 기본 스테이지를 전자 가열 스테이지로 교체하십시오.가열 스테이지의 컨트롤러를 켜고 온도를 29.5 °C로 설정하십시오. 마운팅된 시료를 가열 스테이지 위에 놓으십시오. 20 x 대물렌즈를 제 위치로 이동시키고 스테이지 플랫폼을 올리십시오.그 다음 가시광선 방출기를 활성화하고 배아의 머리가 시야 중심에 오도록 맞춥니다. 형광 채널을 활성화하려면 검출할 형광 파장을 선택하고 각 채널에 맞는 컬러 룩업 테이블을 선택하십시오. 각 형광 채널의 레이저 강도는 10.0으로 설정하고, 광증배관 전압은 600에서 700 사이로 설정합니다.배경 잡음을 줄이고 수집되는 형광 정보를 늘리려면, 평균화(averaging)를 2 또는 4로 설정하고 비트 심도를 16비트로 설정하십시오. ZS 스택 및 타임 시리즈 모듈을 활성화하십시오. 필요한 경우 핀홀을 조정하십시오.시간 간격과 실험 길이를 설정합니다. 카메라를 라이브 모드로 전환합니다. 초점을 조절하고, 필요한 경우 레이저 강도를 높입니다.형광을 관찰하려면, 필요한 경우 더 넓은 시야 확보를 위해 디지털 줌을 0.6으로 설정하십시오.관심 있는 모든 구조가 보이고 성장할 수 있는 충분한 시야가 확보되도록 스테이지를 배치합니다. 배아를 통해 등쪽과 앞쪽으로 초점을 맞추어 형광의 상한 및 하한 범위를 확인합니다. 첫 번째와 마지막 Zack 슬라이스 위치를 이 범위로부터 최소 100 micrometers 이상 벗어난 지점으로 설정합니다.다음으로, 디스플레이 룩업 테이블(lookup table)을 범위 표시기로 설정하여 형광 구조물은 회색 음영으로 나타나게 하고, 나머지 영역은 파란색 또는 검은색으로 보이게 합니다. 필요한 경우, 포화된 적색 픽셀이 나타나기 직전 단계까지 광전자 증배관(photo multiplier) 전압을 높입니다. 형광 구조물이 적색으로 나타나면, 회색 음영으로 보일 때까지 레이저 강도 또는 게인(gain)을 낮춥니다.필요한 경우 오프셋을 조정하여 샘플 외곽 영역이 파란색으로 표시되게 하십시오. 이미지를 적시에 수집할 수 있는 가장 작은 직경으로 설정하십시오.Z 간격은 항상 핀홀 직경에 권장되는 최적 거리로 설정해야 하며, 가능한 가장 낮은 레이저 강도를 사용하여 짧은 스캔을 수행함으로써 설정을 테스트하십시오. 이제 원하는 시간 동안 실험을 진행합니다. 그 후, 가열 스테이지에서 배아를 제거하고 커버슬립을 천천히 분리한 다음, 커버슬립과 배아를 30 millimeter 페트리 접시에 담그십시오.유리 피펫을 사용하여 커버 슬립 위에 있는 배아를 조심스럽게 씻어내고, 페트리 접시에서 커버 슬립을 제거합니다. 배아를 28.5 °C 인큐베이터에 넣어 계속 발달하도록 합니다. 실험이 끝나면, 실험 시작 시점의 표본과 발달 단계가 비슷하지만 EM 및 28.5 °C 인큐베이터에서 배양된, agarose에 마운팅된 형제 배아들의 개별 Zack 이미지를 촬영합니다.공초점 소프트웨어 또는 기타 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 야생형 배아의 인두궁을 필요에 따라 측정하십시오. 신경능 세포군이 형성된 후, 인두궁은 두측 방향으로 이동하면서 전후 및 배복축 AEs를 따라 신장됩니다. 그 전단에서 제1인두궁은 구강 외배엽에 의해 분리된 상악 및 하악 영역을 형성하며, 이러한 핵심 형태 형성 운동은 smoothened 돌연변이체에서 크게 저해됩니다.여기서는 수정 후 48시간까지 일곱 번째 인두궁이 앞쪽 인두궁들과 겹치도록 적절히 이동하지 못합니다. 제브라피쉬 SM five 변이체는 다수의 두안면 결함을 보입니다. 다음은 정적인 공초점 이미지들입니다.제2 및 제3 인두궁 복측 영역의 융합은 수정 후 32시간경에 뚜렷하게 나타납니다. 타임랩스 공초점 현미경을 사용하여 인두궁의 형태 발생을 분석합니다. Smad five 돌연변이체에서는 제2 인두궁과 제3 인두궁 사이의 융합이 수정 후 32시간에 가장 먼저 나타납니다.정적 분석 결과와 일치합니다. PDGF 가족 구성원의 발현으로 보아 PDGF가 인두궁 형태 형성 전반에 관여할 가능성이 시사되지만, 후방 인두궁의 이동은 정상적으로 보입니다. PDGFR$\alpha$ 돌연변이체의 경우, 특히 제1 인두궁의 형태 형성이 특이적으로 저해된 것으로 보입니다.이 절차는 모포(morpho) 주입이나 유전자 모자이크 생성과 같이 흔히 사용되는 다른 제브라피시 기술에도 적용 가능합니다. 타임랩스 분석을 통해 이러한 조작의 결과를 직접적으로 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 시료를 적절히 마취 및 마운팅하고 공초점 현미경의 최적 파라미터를 설정함으로써, 형질전환 제브라피시 배아의 생체 내(in vivo) 타임랩스 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

실험 데이터의 시각화는 과학계에 결과를 제시하는 핵심 요소가되고있다. 성장하는 배아의 살아있는 시간 경과 기록의 생성은 복잡한 발달 과정의 더 나은 표현과 이해에 기여한다. 이 프로토콜은 제브라 피쉬의 단풍 나무 단백질의 광 변환을 통해 셀 라벨에 대한 단계별 가이드입니다.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서   영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기에 설명된 프로토콜은 생후 5일 된 제브라피쉬 유충의 두개안면 연골을 염색하고 해부하기 위한 간단하고 따라하기 쉬운 절차를 제시합니다. 다양한 발달 조건에서 이러한 구조의 해부학, 모양 및 크기를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

이 연구는 무료 소프트웨어(tpsDigs2, MorphoJ, PAST)를 사용하여 제브라피시 유생의 얼굴 구조 변화를 측정하기 위한 두개안면 연골 형태를 정량화하는 프로토콜을 설명합니다.

형태 측정 분석: 제브라피시에서 두개안면 형태 정량화를 위한 분석 소프트웨어 툴박스

학습하세요 4D 공 초점 현미경을 이용한 제브라피쉬 두개안면 형태 형성 분석 방법입니다. 실시간 조직 운동 관찰로 야생형과 돌연변이 배아의 차이를 비교하여 발생 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

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