4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라 피쉬 머리에서 인두궁 움직임을 관찰하고 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 형질전환 제브라 물고기 배아를 마취제 아크로스트 젤에 삽입함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 현미경 슬라이드의 메틸셀룰로오스 한 방울에 아가로스 내장 배아를 장착하는 것입니다.

다음으로, 배아는 진공 그리스로 두 개의 현미경 슬라이드 사이에 밀봉됩니다. 궁극적으로 타임 랩스 컨포칼 현미경은 야생형 제브라피시와 돌연변이 제브라피시 간의 차이점과 인두궁의 형태발생학적 움직임을 보여주는 데 사용됩니다. 정적 이미징 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 인두궁 발달을 실시간으로 캡처하여 조사자가 형태 형성에 중요한 조직 움직임을 직접 관찰할 수 있다는 것입니다.

브리지 커버 슬립을 만들려면 24 x 60 커버 유리의 양쪽 끝에 22 x 22 커버 유리를 슈퍼 글루로 붙입니다. 중간을 비워 둡니다. 태어난 지 하루가 채 안 된 배아를 위해 싱글을 만드십시오.

생후 1일에서 4일 된 배아의 경우 두 배, 5일 이상 된 배아의 경우 세 배입니다. 그리고 각 표본에 대해 두 개의 브리지 커버 슬립을 사용하십시오. 이제 10ml 주사기에 고진공 그리스를 채웁니다.

0.2% 액체 aros에 신선한 마취제를 준비하고 섭씨 42도의 가열 블록에서 유지하십시오. 부화하지 않은 형질전환 배아를 수동으로 탈피하려면 배아가 분리될 때까지 코리안을 천천히 찢습니다. 이제 코팅된 배아를 MS 2, 22 및 심미성을 포함하는 깨끗한 배지로 옮깁니다.

브리지 커버 슬립을 준비하려면 주사기에서 진공 그리스를 천천히 밀어 브리지와 커버 슬립의 가장자리에 인접하고 내부에 매끄럽고 연속적인 비드를 만듭니다. 미끄러짐을 덮기 위해 다리 중앙에 4% 메틸셀룰로오스 원을 펴십시오. 배아가 마취되면 유리 피펫에 넣습니다.

배아가 피펫의 액체 바닥으로 가라앉을 수 있도록 피펫을 수직으로 잡습니다. 그런 다음 피펫을 농업 용액으로 옮기고 배아가 액체를 배출하지 않고 aros로 떨어지도록합니다. 약간의 농업 용액과 배아를 피펫에 끌어들입니다.

그런 다음 아로 용액 한 방울로 배아를 배출합니다. 메틸셀룰로오스 위에. 배아를 메틸셀룰로오스 위로 아래쪽으로 밀고 이미징을 위해 표본을 밀봉하기 위해 원하는 대로 배아의 방향을 지정합니다.

아래를 향하도록 장착된 커버 위에 브리지가 있는 커버 슬립 하나를 놓습니다. 브리지가 직접 접촉하고 아그로스가 양쪽 커버 슬립에 씰을 떨어뜨릴 때까지 샌드위치된 커버 슬립의 양쪽에 균일한 압력을 가합니다. 배아의 방향이 올바른지 확인합니다.

유리를 따라 나무 애플리케이터를 문질러 진공 그리스 속도의 균열과 틈을 매끄럽게 합니다. 가장자리에서 과도한 기름기를 닦아내십시오. 컨포칼 현미경 및 외부 레이저 장치를 활성화합니다.

또한 컨포칼 현미경에 연결된 컴퓨터를 켜고 시작 시스템과 컨포칼 이미징 소프트웨어를 선택합니다. 다음으로, 컨포칼 현미경의 병기 결정 플랫폼을 내리고 대물 렌즈를 제자리에서 밀어냅니다. 기본 스테이지를 전자 가열식 스테이지로 교체합니다.

가열된 s를 위해 컨트롤러를 켭니다.tage 온도를 섭씨 29.5도로 설정합니다. 장착된 표본을 가열된 스테이지에 놓습니다. 20 x 대물 렌즈를 제 위치로 이동하고 스테이징 플랫폼을 올립니다.

그런 다음 가시광선 방출기를 활성화하고 배아의 머리를 시야의 중앙에 놓습니다. 형광 채널을 활성화하려면 검출할 형광 파장을 선택하고 각 채널에 대한 색상 조회 테이블을 선택합니다. 각 형광 채널에 대해 레이저 강도를 10.0으로 설정하고 광 승수 전압을 600에서 700 사이로 설정합니다.

배경을 줄이고 수집된 형광 정보를 늘리려면 평균을 2 또는 4로 설정하고 비트 깊이를 16비트로 설정합니다. ZS 스택 및 시계열 모듈을 활성화합니다. 필요한 경우 핀홀을 조정합니다.

실험의 시간 간격과 길이를 설정합니다. 카메라를 라이브 모드로 전환합니다. 초점을 조정하고 필요한 경우 레이저 강도를 높입니다.

형광을 보기 위해. 더 넓게 보려면 디지털 줌을 0.6으로 설정합니다. 원하는 경우.

관심 있는 모든 구조가 표시되고 시야에 성장을 위한 공간이 있도록 스테이지를 배치합니다. 등쪽 및 앞쪽은 배아를 통해 형광의 상한선과 하한선에 초점을 맞춥니다. 첫 번째 및 마지막 Zack 슬라이스 위치를 이 제한보다 최소 100마이크로미터 이상 높게 설정합니다.

다음으로, 디스플레이 조회 테이블을 범위 표시기로 설정하여 형광 구조가 회색 음영으로 나타나고 필드의 나머지 부분은 파란색 또는 검은색이 되도록 합니다. 필요한 경우 사진 승수 전압을 포화된 빨간색 픽셀이 나타나는 바로 아래 수준으로 높입니다. 형광 구조가 빨간색으로 나타나면 회색 음영이 될 때까지 레이저 강도 및/또는 게인을 줄이십시오.

필요한 경우 오프셋을 조정합니다. 따라서 표본 밖의 영역은 파란색입니다. 이미지를 적시에 수집할 수 있는 가장 작은 지름을 설정합니다.

Z 간격은 항상 핀홀 직경에 대해 제안된 최적 거리로 설정해야 하며, 항상 가능한 가장 낮은 레이저 강도를 사용하여 설정을 테스트하기 위해 짧은 스캔을 수행해야 합니다. 이제 원하는 시간 동안 실험을 실행합니다. 그 후, 가열 된 무대에서 배아를 제거하고 천천히 커버 슬립을 분리하고 커버를 담그고 30mm 페트리 접시에 배아를 밀어 넣습니다.

유리 피펫을 사용하여 커버 슬립에서 배아를 부드럽게 씻어내고 페트리 접시에서 커버 슬립을 제거합니다. 배아를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 넣어 계속 발달시킵니다. 실험이 끝날 때쯤, 실험 시작 시 표본과 유사하게 단계화되었지만 EM과 섭씨 28.5도의 인큐베이터에서 자란 아그로스에 장착된 형제 배아의 개별 Zack 이미지를 촬영합니다.

야생형 배아에서 컨포칼 소프트웨어 또는 기타 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 필요에 따라 인두궁을 측정합니다. 신경능선 개체군에 따라 인두궁은 전방 후방 및 배측 복부 AE를 따라 연장하면서 상부 방향으로 이동합니다. 앞쪽 끝에서 첫 번째 인두궁은 구강 외배엽에 의해 분리된 상악 및 하악 도메인을 형성하며, 주요 형태 유전학적 움직임은 평활화된 돌연변이에서 크게 방해를 받습니다.

여기서 일곱 번째 인두궁은 수정 후 48시간이 지날 때까지 더 많은 전방궁과 겹치기 위해 roly로 이동하지 못합니다. 제브라피시 SM 5 돌연변이는 수많은 두개골 안면 결함을 가지고 있습니다. 이러한 정적 컨포칼 이미지에서.

두 번째와 세 번째 아치의 복부 영역에서의 융합은 수정 후 32 시간까지 분명합니다. 타임 랩스 컨포칼 현미경을 사용하여 인두궁의 형태 형성을 분석합니다. Smad에서는 두 번째와 세 번째 아치 사이의 5 개의 돌연변이 융합이 수정 후 32 시간에 처음으로 나타납니다.

정적 분석과 일치합니다. PDGF 가족 구성원의 발현은 인두궁 형태형성에 광범위하게 관여할 수 있음을 시사하지만, 후궁의 움직임은 정상으로 보입니다. P-D-G-F-R-A 돌연변이에서 특이적으로 파괴된 것처럼 보이는 것은 첫 번째 인두궁의 형태형성입니다.

이 절차는 모르포 주입 또는 유전자 모자이크 생성과 같이 일반적으로 사용되는 다른 제브라피시 기술에 적용할 수 있습니다. 타임 랩스 분석을 통해 이러한 조작의 결과를 직접 분석할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형질전환 제브라피시 배아의 생체 내 이미징을 적절하게 마취 및 장착하고 컨포칼 현미경 검사를 위한 이상적인 매개변수를 설정하여 타임 랩스 in vivo 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.