Name: 신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 학습하세요 생쥐 신장에서 더블 네거티브 αβ T 세포를 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 밀도 구배 분리, CD45 양성 선별 및 음성 선별 기법을 통해 순수한 DN T 세포를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신장 손상에서 면역 세포 역할 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH PBS (R21 AI095484)에 의해 지원된다. 우리는 CD1D 량체를위한 NHI의 테트라 핵심 시설을 감사합니다.

1. 악기의 제조, 문화, 미디어 및 시약 <ol><li> 상품 : 무균 조건 하에서 시약을 준비하고 층류 후드를 사용합니다. </li><li> 소 태아 혈청의 5 %, 수소 나트륨 2.1 g, 10 ㎖ 글루타민산 100 배, HEPES 10 ㎎, 1 밀리그램의 나트륨 피루 베이트 10 ㎖를 100 배의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, RPMI 조직 배양 배지 1 L를 준비합니다. 참고 : 권장되는 조직 배양 배지, RPMI는 DMEM에 교환 할 수있다. </li><li> 5 % 콜라게나 &quot;D&quot;솔루션 (조직 문화 매체의 10 ML에 콜라게나 &quot;D&quot;5 ㎖)을 준비합니다. </li><li> 100 %, 80 % 및 40 %의 세 가지 다른 농도에서 퍼콜 솔루션을합니다. 다음의 농도는 1 샘플에 대해 계산됩니다. 실온에서 솔루션을 유지합니다. <ol><li> 퍼콜 용액 (원액부터) 희석 퍼콜 9 ML을 추가합니다; PBS 배 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 퍼콜 솔루션 :; 퍼콜 8 ㎖를 100 % 추가 PBS 1X 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 퍼콜 솔루션 :퍼콜 80 % 4 ㎖를 추가; PBS 1X 4 ㎖를 추가합니다. </li></ol></li><li> (FACS) 버퍼를 정렬 형광 활성화 된 셀의 1 L를 확인; 5 ML 10 % BSA (0.1 % BSA), 1 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨 (0.1 %), 2 ㎖ EDTA 에이전트, 1X PBS 1,000 ml로 구성을 추가합니다. </li></ol> 신장 소화의 2. 준비 <ol><li> , 필요한 기관 승인을 획득 한 표준 방법으로 쥐를 희생에게서 피를 뽑다 현재 규정 및 동물 관리 지침에 따라 한. <ol><li> 펜토 바르 비탈 (0.07 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. </li><li> 일어난 과다 출혈로 넘어갑니다. </li><li> 수술대에 누운 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올과 복부 영역 스프레이. </li></ol></li><li> 페트리 접시에 콜라게나 D 솔루션의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 제거하고 각 마우스 모두에서 신장을 디 캡슐. <ol><li> 에 흉골의 복부 피부와 복막을 통해 중간 선 절개를함으로써 abdomimal 구멍을 엽니 다치골. </li><li> 측으로 측방 부위를 이동하여 좌측 신장을 노출. </li><li> 조심스럽게 집게로 왼쪽 캡슐을 분리합니다. 참고 : 캡슐은 신장을 둘러싸고있는 투명한 층으로 나타납니다 부분적으로 perinephric 지방 조직에 의해 덮여. </li><li> 수술 가위를 사용하여 척추 경 혈관을 절단하여 왼쪽 신장을 제거합니다. </li><li> 오른쪽 신장에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 참고 : 오른쪽 신장은 더 많은 두개골과 중간 선 (작은 꽃자루가 짧다)에 더 가깝다. </li></ol></li><li> 페트리 접시에 신장을 놓습니다. </li><li> 일반 금속 형성 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 신장 조직 (치수 1 ~ 2 mm)를 절단하고 (그림 1) 37 ° C에서 인큐베이터에서 30 ~ 45 분 동안 콜라게나 솔루션으로 조각을 배치합니다. </li></ol> 신장의 소화에서 신장 단핵 세포 (KMNC) 3. 준비 <ol><li> 신장의 세포 현탁액을 얻을기계적 조직 배양 배지 25 ㎖에 스트레이너 (70 μm의)와에 resuspend를 사용하여 혼합 조직을 방해하여 소화. </li><li> 세포 현탁액을 펠렛 4 ° C에서 10 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 아주 천천히, 조심스럽게 40 % 퍼콜 용액 4 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중단하고 부드럽게 전달 플라스틱 피펫으로 80 % 퍼콜 용액 4 ㎖에 오버레이. 이것은 분명히 반투명 층에 의해 분리 된 두 개의 단계가 발생합니다. 상단에있는 지질에 해당하는 노란색 층이 될 것입니다. </li><li> 브레이크 오프 모드에서 원심 분리하여 실온에서 30 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리기. </li><li> 흡인에 의해 노란색 두꺼운 꼭대기 층 (약 1 ~ 2 ㎖) 제거합니다. </li><li> 전송 피펫을 가진 두 단계의 인터페이스 만 약간의 흰 반투명 레이어를 수집합니다. 아주 조심스럽게 조직 배양액 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 원뿔형 튜브에이 현탁액을 전송하고 총 부피를 만들기 위해 배지 13 mL를 넣고15 ML. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기 </li><li> 배지 1 ㎖에 샘플에 resuspend. </li><li> 혈구에 트리 판 블루 배제를 사용 KMNC의 수를 계산 및 신장 당 ML 당 KMNC의 숫자로 결과를 표현한다. </li><li> 한 번 상기와 같이 씻는다. </li></ol> KMNC에서 4. 조혈의 분리 (CD45의 +) 세포 (단계 I) <ol><li> 버퍼를 실행의 90 μL에 10 7 세포를 재현 탁. </li><li> CD45 마이크로 비즈의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 15 분 동안 품어 </li><li> 반응을 정지 실행 버퍼 1 ML을 추가합니다. 버퍼를 실행 500 μL에서 4 ° C와에 resuspend에서 10 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 자석에 배치하여 자기 열을 준비하고 버퍼를 실행의 3 ㎖로 씻어. </li><li> 자기 칼럼을 통해 세포 현탁액을 통과하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. </li><li> runn 3 ㎖의 세포를 세 번 씻으십시오버퍼를 보내고. 그런 다음 유출 물을 수집합니다. </li><li> 분리 및 피펫 열에 버퍼를 실행 5 ㎖에서 열을 제거하고 즉시 표시된 부분을 세척하십시오. 이 부분은 CD45 + 세포가 포함되어 있습니다. 세포를 계산합니다. </li><li> 신장에 다른 T 세포 아형의 절대 수를 계산하는 것은 유동 세포 계측법에 의해 결정 양성 세포의 비율 (도 2)에 의해 KMNC의 총 수를 곱한다. </li></ol> 음의 선택에 의해 CD45 + 준비에서 DN T 세포 5. 절연 (단계 II) <ol><li> 다음 비오틴 항체의 각 2.5 μL (0.5 ㎎ / ㎖, 1.25 μg) 추가 : 안티 - CD4, 항 CD8, 안티-FC 수용체 (CD16/32을), 안티 MHC 클래스 II (IA의 B), 안티 - 매 10 7 조혈 세포에 대한 CD1D PBS-57 량체. </li><li> 차가운 방에서 30 분 동안 세포를 품어. </li><li> 1 ㎖ 안티 - 비오틴 마이크로 비드를 추가합니다. </li><li> 추운 방에서 30 분 동안 품어. </li><li> t에 튜브를 놓고그는 자석과 고갈로 진행합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 음의 분획 DN T 세포의 총 수를 결정하는 생세포 횟수. </li><li> 제 1 게이트 CD45의 +, 제 2 게이트 TCRαβ +이 게이팅 전략에 따라 유동 세포 계측법과 DN T 세포의 순도를 확인합니다. CD1D + 세포를 제외합니다. CD8 + 대 플롯 CD4 +는 DN T 세포 (그림 3)를 식별합니다. </li><li> 순도 결정된 비율로 총 수를 곱한다. 참고 : 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에이 프로토콜의 결과를 사용하여. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
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<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
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<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

그들은 같은자가 면역 질환, 암, 이식 허용, 급성 신장 손상 (AKI)을 포함하여 신장의 주요 질환과 같은 다른 병리학 적 조건에 연루되고 있기 때문에 DN T 세포에 대한 관심이 증가가, 8, 13 사구체 신염. 따라서, 더 나은 DN T 세포의 병태 생리 학적 기능을 이해 및 특성화가 필요하다. 그러나, 현재 CD4와 CD8 T 세포에 비해 이러한 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 가장 큰 이유는 차 림프 기관의 DN T 세포의 소수 따라서 체외 분석 및 입양 전송 실험을위한 충분한 세포를 얻기에 어려움이 있습니다. DN T 세포는 주로 신장 (8)과 같은 비 림프 조직에 있습니다 만, 고체 기관에서 자신의 격리를위한 신뢰할 수있는 방법의 부족은 그 기능을 조사하는 노력을 방해한다. 따라서, DN T 세포의 분리를위한 우리의 새로운 프로토콜신장에서의 DN은 T 세포의 기능에 대한 연구를 촉진 할 것으로 예상된다. DN T 세포와 Fas 결핍 ​​(LPR) 또는 ...

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Samatha Bandapelle
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Samantha Bandapelle

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Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

주변 αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - 이중 부정은 (DN) T 세포는 별개의 표현형과 기능 1-4을 가지고 다양한 하위 집합으로 분할된다. DN T 세포는 제대로 이해하고 있지만 점점 다른 질병 모델 4-6의 병태 생리 학적 면역 반응에 연루된다. DN T 세포는 점점 더 다양한 면역 및자가 면역 반응의 조절과 이식 실험 관용의 변조에 연루되는 고유 한 면역 세포의 유형입니다. 4-6, 9 그들은 비장과 림프절 (말초 혈액 및 이차 림프 기관에 드문 ). 그러나, 그들은 정상 신장 및 소화관 상피 10-12의 주요 거주자. 약간은 정상 상태에서의 신장에서의 기능 7에 대해 이러한 신장 transpl과 관련된 급성 신장 손상 (AKI)과 같은 병적 인 조건에서 알려져있다개미. 이 때문에, 각 플레이어의 역할을 정의 alloresponses 포함한 면역 반응을 조절하는 다른 면역 세포의 복잡한 역할은 alloresponses 승낙 새로운 치료제를 설계하는데 중요하다. 생리적 및 다양한 질병 상태에서 신장에 존재 DN T 세포의 상당수 감안 DN T 세포는 이식 수혜자에서 중요한 마우스 및 인간 면역 및자가 면역 반응을 조절하는데 역할 및 alloresponses 재생할 가능성이있다. 아직도 흩어져있는 증거 불구하고 축적하는 것은 모두 병원성 및 면역 기능에 DN T 세포를 연루하지만, 왜, 어떻게 그들이 특정 유해하거나 억제 기능을 발휘하고 환경 영향을 그들이 어떻게 그것을 제대로 이해된다. 때문에 신장에서의 낮은 풍요, 분리의 개선 된 방법이 필요합니다. t에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 없습니다그는 비 림프 조직. 우리 프로토콜은 신장에서 DN T 세포의 분리를위한 신규 한 방법을 설명한다; 그러나, 상기 방법은 또한 다양한 비 - 림프 조직을 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>층류 후드&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>또는 이에 상응하는 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>또는 동급의 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>대기 제어 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 &도; 5% CO2)가 함유된 C</td></tr> <tr><td>분석 플로우 사이토미터</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐아제 D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 아지드나트륨 (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 인산 완충 식염수 (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 버퍼&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ 마이크로비즈</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 마이크로비즈&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (클론: 30-F11)&nbsp; 퍼CP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (클론: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>안티 TCR 퍼시픽 블루&nbsp; (앱체인, 클론: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>항-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>항-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>항-CD4 비오틴화된 (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>항-CD8 비오틴화&nbsp; (클론 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC class II (I-A b) biotinylated</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - MACS 분리 버퍼&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>신장 - 림프절</td></tr><tr><td>페트리 접시&nbsp;</td><td>BD 생명과학</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; M 필터&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>플런저&nbsp;</td><td></td><td></td><td>또는 이에 상응하는 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate 튜브 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate 튜브 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>또는 동등한 장비&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer 사량체</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

신장에서 더블 네거티브 (double negative) αβ의 t 세포의 분리

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

비 림프 조직에서 DN T 세포의 분리를위한 표준 프로토콜은 다양한 면역 반응에서의 점점보고 참여에도 불구하고 현재 없습니다. DN T 세포는 allotransplants 1-6로 면역 및자가 면역 반응과 내성을 조절에 연루되어 고유 한 면역 세포의 유형입니다. DN T 세포는 말초 혈액 및 이차 림프​​ 기관 (비장과 림프절)에서 드문,하지만,하지만, 정상적인 신장의 주요 거주자입니다. 아주 작은 인해 주변에서의 소수 자신의 병태 생리 학적 기능 7에 대한 알려져있다. 우리는 최근에 정상 상태 및 허혈 재관류 손상시 신장 8이 인구의 포괄적 인 표현형 및 기능 분석을 설명했다. DN T 세포 기능 분석을 크게 신장에서의 그들의 분리를위한 프로토콜을 개발함으로써 강화 될 것이다. 여기, 우리는 isolatio 수있는 새로운 프로토콜을 설명뮤린 신장으로부터 고순도 AB CD4 + CD8 + T 세포 및 DN T 세포의 N. 간단히 말해서, 우리는 콜라게나 제를 사용하여 신장 조직을 소화하고 밀도 구배에 의해 신장 단핵 세포 (KMNC)를 분리. 이것은 KMNC에서 70 %로 3 %에서 조혈 T 세포를 풍부하게하기 위해 두 단계로 이어진다. 첫 번째 단계는 CD45 + 분리 키트를 사용하여 조혈 세포의 포지티브 선택으로 구성된다. 두 번째 단계에서는, DN T 세포는 부정적인 CD4, CD8, 및 MHC 클래스 II 단일 클론 항체 및 CD1D α-galcer 량체를 사용하여 원하지 않는 세포의 제거에 의해 격리됩니다. 이 전략은 90 % 이상 순수 DN T 세포의 인구에 이르게한다. FACS 분석이어서 상기 항체 표면 염색은 순도를 확인하기 위하여 사용된다.

야생형 C57BL / 6 (B6) 신장 신장 당 약 1.5-2.1 × 10 6 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 약 10 % 미만은 조혈 CD45 + 세포 수 있습니다. 5 % 콜라게나 제를 사용하여 분해 한 다음도 1에 나타낸 바와 같이 신장 단핵 세포 (KMNC)의 제조에 대하여, 신장이 작은 조각으로 절단된다. 이것은 KMNC 층 (도 2, 왼쪽 패널) 수집하는 밀도 구배 원심 분리를 수행하여 이어진다. KMNC은 다음 섹션 4 (단계 I)의 설명에 따라 CD45 + 자기 마이크로 비드를 사용하여 긍정적 인 선택을 하였다. 컬럼 바인딩 균체 후 FACS로 용출하고 CD45 +에 대해 분석 하였다. 이 유동 세포 계측법 (그림 2, 가운데 패널)에 의해 분석으로 약 80~95%에 CD45 + 세포의 농축에서...

DNabT 세포가 말초 T 세포 사이 드물다; 그러나, 그들은 특정 비 림프 조직에 풍부합니다. 비 림프 조직에서 DN T 세포를 분리의 어려움은 병태 생리 학적 중요성을 인식 증가에도 불구하고 자신의 기능 분석을 방해한다. 우리는 쥐의 신장에서 고순도 DN T 세포의 분리를 위해 새로운 프로토콜을 설명합니다.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

본 절차의 전반적인 목적은 마우스 신장에서 순수한 double negative T 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 콜라게나제 용액으로 신장을 소화시켜 수행합니다. 다음으로, 밀도 구배법을 통해 단핵 세포를 분리하고, 양성 선택법으로 조혈 세포인 CD 45 양성 세포를 수집합니다.결국, 음성 선택을 통해 이중 음성 T 세포를 분리할 수 있습니다. 1998년에 저희 연구팀은 기존의 통설과는 달리 면역 세포, 특히 T 세포가 급성 신손상을 매개한다는 사실을 발견했습니다. 신장과 심장에는 연구할 만한 이러한 세포의 수가 매우 적었기 때문에, 저희는 이를 더 효과적으로 연구하기 위한 기술을 개발했습니다.우리는 정상 신장과 손상 시 모두에서 CD4 또는 CD8이 없는 이중 음성 T세포(double negative T-cell) 집단이 높은 비율로 존재한다는 사실을 발견하고 놀랐습니다. 이러한 세포들을 더 잘 연구하고 그 메커니즘을 조사하기 위한 상세하고 개선된 기술이 곧 공개될 다음 비디오에서 설명될 예정입니다. 우리는 2001년부터 이중 음성 T세포를 연구해 왔으며, 최근에는 다양한 생물학적 면역 반응에 사용할 수 있는 순수한 세포 집단을 얻기 위해 Dr. Rob 연구실과 협력하여 이 세포들의 분리를 위한 지역적 방법을 수정하였습니다.이 방법은 신장의 면역 세포에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 수술을 시작하기 전 비림프 조직과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 먼저, 조직 수집을 위해 페트리 접시에 collagenase D 10 milliliters를 넣습니다. 그런 다음 안락사시킨 마우스의 복부 부위에 70% ethanol을 분무합니다.다음으로, 흉골부터 치골까지 복부 피부와 복막을 따라 정중선 절개를 실시한 후, 장을 옆으로 밀어 왼쪽 신장을 노출시킵니다. 신장을 둘러싸고 있는 투명한 층으로 나타나며 신장 주변 지방 조직에 일부 덮여 있는 왼쪽 피막을 확인하고, 핀셋을 사용하여 신장으로부터 조심스럽게 분리합니다. 그 다음, 수술용 가위로 신경혈관다발을 절단하여 조직을 제거하고, 신장을 페트리 접시에 옮깁니다.그 다음 오른쪽 신장을 제거한 후, 일반 금속 쉐이핑 블레이드를 사용하여 신장 조직을 1~2 mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 이 조각들을 콜라게나제 용액에 넣고 37 °C에서 30~45분 동안 소화시킵니다. 그 후 신장 단핵구를 분리하기 위해 70 µm 스트레이너를 통해 신장 슬러리를 기계적으로 파쇄합니다. 세포 현탁액을 25 mL의 조직 배양 배지에 다시 현탁합니다.그 후 부드럽게 교반한 다음, 세포를 원심 분리하여 침전시키고 40% Percoll 용액 4 mL에 펠렛을 재부유시킵니다. 다음으로, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 80% Percoll 용액 4 mL 위에 Percoll 세포 용액을 조심스럽게 층분리하여, 반투명한 층에 의해 명확하게 구분되는 두 개의 층을 형성합니다. 브레이크를 끈 상태에서 상온, 1500 ×g로 30분 동안 원심 분리하여 세포를 분리한 후, 지질을 함유한 두꺼운 노란색 상층액을 약 1~2 mL 흡입하여 제거합니다.새 전이 피펫을 사용하여 두 상의 계면에 형성된 약간 흰색을 띠는 반투명 층을 수집하여 2 mL의 조직 배양 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 배지 13 mL를 추가하여 총 부피를 15 mL로 맞춥니다. 세척 및 계수 후, 세포를 90 µL의 running buffer에 1 × 10⁷ 개 농도로 희석합니다.그 다음 4 °C에서 10 µL의 CD 45 마이크로비즈와 함께 세포를 배양합니다. 15분 후, 반응을 중단시키기 위해 1 mL의 러닝 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하여 회수합니다.펠렛을 500 µL의 신선한 러닝 버퍼에 현탁합니다. 다음으로, 컬럼을 비드 분리 자석에 넣고 3 mL의 러닝 버퍼로 컬럼을 헹굽니다. 그런 다음 세포 현탁액을 자성 컬럼에 통과시켜, 컬럼을 통과해 나오는 라벨링되지 않은 세포를 수집합니다.세포가 들어 있는 튜브를 3 mL의 러닝 버퍼(running buffer)로 3회 세척하며 매회 유출액을 수집한 후, 자석에서 컬럼을 제거합니다. 5 mL의 러닝 버퍼를 컬럼에 피펫팅하고, CD 45 양성 세포가 포함된 표시된 분획을 즉시 세척하여 회수합니다. 그다음 세포 수를 측정하고, 조혈 세포 1 × 10⁷개당 각각 2.5 µL의 비오틴화 항체(biotinylated antibodies)를 넣고 4 °C에서 배양합니다.30분 후, 1 mL의 anti-biotin microbeads가 들어있는 4 °C 환경에서 세포를 30분 더 배양합니다. 자석에 새 컬럼을 장착한 다음, 앞서 시연한 것과 동일하게 세포를 컬럼에 로드하되 이번에는 음성 분획(negative fraction)을 수집합니다. 마지막으로, 생존 세포 수를 측정하여 음성 분획 내의 전체 이중 음성 T 세포 수를 결정하고, 이 수치에 유세포 분석으로 측정된 순도 백분율을 곱합니다.C57BL/6 마우스의 신장 하나에는 약 1.5~2.1 × 10⁶개의 단핵구가 포함되어 있으나, 조혈모세포인 CD45 양성 세포는 10% 미만입니다. 밀도 구배 원심분리를 통해 신장 단핵구 층을 수집한 후, CD45 양성 자성 비드 분리를 통해 CD45 양성 세포를 약 80~95%까지 추가로 정제할 수 있습니다. 이렇게 농축된 조혈모세포 CD45 양성 세포 중 약 30~60%가 double negative T 세포입니다.CD 45 양성 세포에서 CD 4 양성, CD 8 양성, MHC class two 양성 및 테트라머 양성 세포를 제거하는 음성 선택을 통해 90~95% 순도의 고순도 이중 음성 T 세포를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 마우스당 최대 0.5 × 10⁶개의 조혈 CD 45 양성 자기 표지 세포를 확보할 수 있습니다. 이 절차는 다양한 조직 내 이중 음성 T 세포의 생물학적 기능과 작용 기전에 대한 더 깊은 이해를 제공할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

이 비디오는 면역자기 표적화 및 말초 혈액 단핵 세포 현탁액에서 분리하여 B 세포를 정제하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 특정 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 특정 항체 또는 리간드(자성 입자에 연결됨)로 원치 않는 세포 유형을 라벨링하여 자기 분리에 의해 이종 세포 현탁액에서 고갈시키는 것을 포함합니다.

음성 면역자기 선택: 말초 혈액 단핵 세포에서 B 세포를 정제하는 방법

이 비디오는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+Vδ1+γδ T 세포의 저농도 집단을 자기 라벨링 기반으로 분리하는 프로토콜을 보여줍니다. FITC-conjugated anti-Vδ1 antibodys, magnetic anti-FITC microbeads 및 anti-CD4 antibody-coated superparamagnetic beads의 조합을 사용하여 CD4+Vδ1+ T cell은 PBMC 집단에서 성공적으로 정제될 수 있습니다.

인간 말초 혈액 단핵 세포에서 CD4+ Vδ1+ γδ T 세포의 선택적 분리

여기에서는 말초 Vδ1+CD4+ T 세포의 희소한 T 세포 개체, 즉 최근에 보여준 바와 같이 흉선 외 αβ T 세포 전구 세포의 분리 및 복제를 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 체외 배양에서 이러한 세포를 정량적으로 분리, 복제 및 효율적으로 확장할 수 있습니다.

분리 및<em&gt; 전의 VIVO</emVδ1의&gt; 문화<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조

신장 면역 세포를 분리하기 위해 신뢰할 수 있고 효율적인 기술이 다운스트림 응용 프로그램에 필요합니다. 이를 위해서는 소수의 신장 면역 세포에 대한 표면 항체 라벨링이 필요합니다. 여기에서는 이 목표를 달성하는 것처럼 보이는 신장 면역 세포를 분리하는 간결한 방법을 설명합니다.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

여기, 선물이 프로토콜을 이식, 허용 오차를 유발 하 고 생체 외에서 그리고 vivo에서 평가 받는에서 고유한 셀 하위 집합의 진압 용량 및 기증자 또는 외 인 항 원 받는 사람의 면역 상태.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 T, B 및 골수성 세포 진압 활동 및 이식 받는 체액 응답의 평가

여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

우리는 세자리 증후군으로 진단 된 환자로부터 얻은 전혈에서 말초 혈액 단핵 세포를 분리하기위한 간단한 프로토콜을 제시하고, CD4 + T 세포의 선택, phorbol12-myristate13-acetate 및 A23187 ionophore로 자극, 전사 프로파일 링을위한 RNA 준비.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

바이러스 감염에 이어 신장은 비교적 많은 수의 CD8+ T 세포를 수용하고 비 점막 TRM 세포를 연구할 기회를 제공합니다. 여기서는 유동 세포측정 분석을 위해 마우스 신장 림프구를 분리하는 프로토콜을 설명합니다.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

여기에서 우리는 수질 신장 세포 유형의 표현을 개선하고 효소 조직 해리로 인한 유전자 발현 아티팩트를 방지하는 냉동 마우스 신장에서 고품질 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

이 프로토콜은 안전하고 잘 내약되는 쥐 양측 신림프절반 절제술의 생존 절차를 설명합니다.

마우스 양측 신림프절출술

학습하세요 생쥐 신장에서 더블 네거티브 αβ T 세포를 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 밀도 구배 분리, CD45 양성 선별 및 음성 선별 기법을 통해 순수한 DN T 세포를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신장 손상에서 면역 세포 역할 연구에 활용됩니다.

신장에서 더블 네거티브 (Double Negative) αβ의 T 세포의 분리

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