January 22nd, 2014
이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.
이 절차의 전반적인 목표는 폴리 디메틸 수복산 또는 PDMS의 탄성 막에서 패턴 세포를 늘리는 것입니다. 이는 A-P-D-M-S 시트의 처리를 통해 달성된 다음 PDMS에 마이크로 패턴을 적용함으로써 이루어집니다. 그런 다음 마이크로 패턴의 PDMS 시트를 스트레칭 장치에 장착하고 그 위에 매체 리테이닝 풀을 놓습니다.
다음으로, 세포를 마이크로 패터닝된 PDMS 시트의 표면에 도금하고 플러싱하기 전에 패턴에 부착하여 부착되지 않은 셀을 제거하도록 합니다. 마지막 단계는 PDMS가 포함된 셀에 연신율을 적용하여 셀을 늘리는 것입니다. 궁극적으로, 비디오 현미경은 세포 스트레칭에서 유사 분열 포유류 세포의 수축 섬유에 힘이 가해지면 세포의 변형을 초래한다는 것을 보여주는 데 사용됩니다.
이 방법은 생체 역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 미리 만들어진 시트에서 약 35 x 20mm 크기의 PDMS 조각을 자르기 시작하기 위해 분할 셀에 힘을 가하고 싶었을 때 처음 떠올랐습니다. 여기서, 시중에서 판매되는 얇은 PDMS 시트는 맞춤형에 비해 재현성이 뛰어나고 파손 가능성이 적기 때문에 사용됩니다. PDMS입니다.
플라스틱의 상단 및 하단 보호층을 제거하고 핀셋을 사용하여 PDMS를 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 70% 에탄올이 함유된 PDMS를 분당 30회 진동으로 회전기에서 5분 동안 세척합니다. 세척 후 표면을 위로 공기를 흐르게 하여 표면을 건조시킵니다.
다음으로 약 5cm의 자외선 전구에서 떨어진 곳에서 5분 동안 깊은 자외선으로 PDMS를 비춥니다. 한편, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E-D-C-N-H-S 솔루션을 준비합니다. 용액의 반응성은 몇 시간 만에 감소하기 때문에 용액은 사용 직전에 준비해야 합니다.
페트리 접시의 PDMS 시트를 조명이 켜지지 않은 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 이렇게 하면 PDMS 주변 환경이 매우 소수성이고 용이합니다. 다음 단계.
PDMS에 E-D-C-N-H-S 용액을 피펫팅하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후. 여분의 E-D-C-N-H-S를 물로 헹굽니다.
다음으로, PLL 이식 PEG 용액을 추가하고 배양 후 실온에서 3시간에서 하룻밤 동안 배양하고 PDMS에서 여분의 PLL 이식 PEG를 물로 헹굽니다. PDMS는 이제 PLL 접목된 PEG로 부동태화되거나 기능화되었으며 섭씨 4도에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. PDMS 장소를 패터닝하기 위해 패터닝을 위한 마이크로 피쳐를 지닌 합성 석영 포토 마스크에 A-P-D-M-S 시트를 사용합니다.
PLL 접목 PEG가 있는 PDMS 쪽을 포토 마스크의 크롬 쪽을 향하도록 놓습니다. 그런 다음 약 5cm의 자외선 전구에서 떨어진 곳에서 포토 마스크를 통해 7 분 동안 조명을 비춥니다. 조명 다음.
마스크와 PDMS에 물을 추가한 다음 PDMS를 마스크에서 천천히 떼어내고 이전에 부동태화된 PDMS를 스트레칭 장치에 장착합니다. PDMS의 한쪽 면을 들것의 고정 부분에 부착합니다. PDMS 시트를 너무 많이 클램핑하지 않고 다른 쪽을 들것의 모바일 부분에 고정합니다.
PDMS가 너무 많이 클램핑되면 더 짧아지고 동일한 스트레치 거리에서 장력이 더 커지기 때문에 제동으로 이어질 수 있습니다. 나사가 잘 조여졌는지 확인하거나, 스트레칭이 시작되자마자 또는 나중에 실험 중에 PDMS 시트가 미끄러질 것입니다. 다음으로, PDMS를 피브로넥틴 용액으로 1시간 동안 배양합니다.
실온에서는 다른 세포외 기질 단백질을 사용할 수 있지만 이 프로토콜로 테스트되지 않았습니다. 마지막 단계로, 인산염 완충 식염수로 PDMS를 헹굽니다. 다음으로, 두꺼운 PDMS 슬래브에서 PDMS의 직사각형을 자릅니다.
그런 다음 내부에서 다른 사각형을 자릅니다. 셀과 매체를 유지할 풀을 가지려면 이 직사각형 절단 PDMS 아래에 실리콘 그리스를 추가하고 PDMS 시트 위에 올려 매체 유지 풀을 만듭니다. 그리스는 세포를 패턴화하기 위해 스트레칭하는 동안 PDMS 시트 위로 풀이 미끄러지도록 합니다.
먼저, 배양 플라스크에서 세포를 50% co fluency로 분리합니다. 세포가 현탁액에 들어가면 200마이크로리터 팁으로 여러 번 피펫팅하여 응집체를 분해하면 개별 세포가 패턴에 결합할 수 있습니다. 다음으로, 1ml의 세포 현탁액을 풀에 추가합니다.
세포에 따라 10분에서 30분 동안 세포가 패턴에 결합하도록 합니다. 섭씨 37도의 인큐베이터를 입력합니다. 세포가 패턴에 부착되면 부동 세포를 평형 매체로 부드럽게 세척하여 세포를 세척합니다.
흡인 피펫으로 매체를 제거하는 동시에 배지를 추가합니다. 세포를 배지에 담근 상태로 유지하면서 부착되지 않은 세포를 씻어낼 수 있도록 충분한 플럭스를 유지하는 것이 중요합니다. 다음으로, PDMS가 파손될 경우 증발 및 매체 누출을 방지하기 위해 풀 상단에 커버 슬립을 추가하고 세포가 패턴에 몇 시간 동안 퍼질 수 있도록 합니다.
그런 다음 장치를 도립 현미경에 놓고 이미징을 시작합니다. 오일 이멀젼 대물렌즈는 초점 문제로 인해 작동하지 않으므로 사용을 피하십시오. 마이크로 패턴 셀을 늘리려면 마이크로미터 나사를 돌리면서 x, y, Z축의 스테이지 위치를 수정합니다.
PDMS의 확대와 초점 상실에 대응하기 위해 스테이지 위치를 수정해야 합니다. 이 비디오 프로토콜에 제시된 기술은 중기 시작 시 기질을 늘려 유사분열 포유류 세포의 수축 섬유에 힘을 가할 수 있게 했습니다. 이러한 수축 섬유 중 일부는 세포체에서 분리되어 늘어나기 전에 유사 분열 세포 피질에 기계적 힘이 가해졌고, 세포는 이를 달성하기 위해 타원형 패턴으로 도금되었습니다.
패터닝은 포토 마스크를 통해 둥근 패턴이 인상되는 동안 PDMS가 늘어나는 상태에서 수행됩니다. 스트레칭 후, 패턴이 원이 되도록 기판이 늘어납니다. 이 비디오를 시청한 후에는 매크로 패턴에 셀을 도금한 다음 기판에 신축력을 가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 원고는 일방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 또는 조직에 힘을 가하거나 해제하는 기술을 제시합니다. 이 방법은 폴리 디메틸 실록산(PDMS)의 탄성 멤브레인 위에 패턴화된 세포를 스트레칭하는 것을 포함합니다.
Mechanical stimulation of adherent cells enables interrogation of force-dependent signaling pathways critical for target validation in mechanobiology. This method supports phenotypic screening by applying controlled, reproducible stretch to micropatterned cells, facilitating de-risking of hypotheses linking cellular mechanics to disease mechanisms. The approach provides quantitative, imaging-compatible readouts that enhance predictive confidence in early discovery workflows.
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through phenotypic screening to mechanistic validation, particularly for targets implicated in mechanical stress response pathways.