PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

이 절차의 전반적인 목적은 폴리디메틸실록산(poly dimethyl suboxane) 또는 PDMS 탄성 막 위에 패턴 세포를 신장시키는 것입니다. 이는 PDMS 시트를 제작한 후, PDMS 위에 마이크로 패턴을 적용함으로써 달성됩니다. 이후 마이크로 패턴이 형성된 PDMS 시트를 신장 장치에 장착하고 그 위에 배지 유지 풀을 배치합니다.

다음으로, 세포를 마이크로 패턴이 형성된 PDMS 시트 표면에 도말하고, 부착되지 않은 세포를 씻어내기 전에 패턴에 부착될 때까지 기다립니다. 마지막 단계는 세포가 포함된 PDMS에 신장력을 가하여 세포를 스트레칭하는 것입니다. 최종적으로, 비디오 현미경을 통해 세포 스트레칭 시 분열 중인 포유류 세포의 수축 섬유(retraction fibers)에 가해진 힘이 세포의 변형을 유도함을 보여줍니다.

이 방법은 외력이 세포 분열과 같은 세포 과정에 어떤 영향을 미치는가와 같은 생체역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 분열 중인 세포에 힘을 가하고자 했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 먼저 기성 시트에서 약 35 by 20 밀리미터 크기의 PDMS 조각을 자릅니다. 여기서는 맞춤 제작된 PDMS에 비해 재현성이 더 높고 파손 가능성이 적은 시판용 얇은 PDMS 시트를 사용합니다.

상단과 하단의 플라스틱 보호층을 제거하고, 핀셋을 사용하여 PDMS를 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 그 다음, 분당 30회 회전하는 로테이터에서 70% ethanol로 PDMS를 5분 동안 세척합니다. 세척 후, 공기를 흘려주어 표면을 건조시킵니다.

다음으로, 자외선 램프로부터 약 5 cm 거리에서 5분 동안 심자외선(deep ultraviolet light)을 조사하여 PDMS를 조사합니다. 그동안 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E-D-C-N-H-S 용액을 준비합니다. 용액의 반응성이 몇 시간 내에 감소하므로, 반드시 사용 직전에 준비해야 합니다.

PDMS 시트를 페트리 접시에서 빛을 받지 않은 페트리 접시 뚜껑으로 옮깁니다. 이렇게 하면 PDMS 주변이 매우 소수성 상태로 유지되어 다음 단계를 용이하게 합니다.

E-D-C-N-H-S 용액을 PDMS 위에 피펫으로 분주하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 과잉의 E-D-C-N-H-S를 물로 헹구어 제거합니다.

다음으로, PLL이 접합된 PEG 용액을 첨가하고 실온에서 3시간부터 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 물을 사용하여 PDMS에서 과량의 PLL 접합 PEG를 씻어냅니다. 이제 PDMS는 PLL 접합 PEG로 패시베이션(passivation) 또는 기능화되었으며, 4 °C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. PDMS에 패턴을 형성하려면, 패턴화할 마이크로 구조가 새겨진 합성 석영 포토마스크 위에 PDMS 시트를 배치합니다.

PLL이 접합된 PEG가 있는 PDMS 면을 포토마스크의 크롬 면과 마주하게 배치하십시오. 그다음 자외선 램프로부터 약 5 cm 떨어진 거리에서 포토마스크를 통해 7분 동안 조사하십시오. 조사 후에.

마스크와 PDMS 위에 물을 추가한 후, 마스크에서 PDMS를 천천히 떼어내어 이전에 패시베이션 처리를 한 PDMS를 스트레칭 장치에 장착합니다. PDMS의 한쪽 끝을 스트레처의 고정부에 부착합니다. PDMS 시트가 너무 많이 집히지 않도록 주의하며 반대쪽 끝을 스트레처의 가동부에 고정합니다.

PDMS를 너무 세게 고정하면 길이가 짧아져, 동일한 신장 거리에서 인장력이 더 커지므로 파손으로 이어질 수 있습니다. 나사가 잘 조여졌는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 신장이 시작될 때나 실험 도중에 PDMS 시트가 미끄러질 수 있습니다. 다음으로, PDMS를 피브로넥틴(fibronectin) 용액과 함께 1시간 동안 배양합니다.

실온에서 다른 세포외 기질 단백질을 사용할 수 있으나, 이들은 본 프로토콜에서 테스트되지 않았습니다. 마지막 단계로, PDMS를 인산염 완충 식염수로 헹굽니다. 다음으로, 두꺼운 PDMS 슬랩에서 PDMS를 직사각형 모양으로 절단합니다.

그런 다음 내부에 또 다른 직사각형을 절개합니다. 세포와 배지가 유지될 수 있는 풀(pool)을 만들기 위해, 이 직사각형으로 절개된 PDMS 아래에 실리콘 그리스를 바르고 이를 PDMS 시트 위에 올려 배지 유지 풀을 생성합니다. 그리스를 사용하면 세포 패턴 형성 과정 중 스트레칭 시 풀이 PDMS 시트 위에서 미끄러질 수 있게 됩니다.

먼저, 50% confluence 상태의 배양 플라스크에서 세포를 떼어냅니다. 세포가 부유 상태가 되면, 200 microliter 팁으로 여러 번 피펫팅하여 응집체를 분쇄함으로써 개별 세포가 패턴에 잘 결합하도록 합니다. 그 다음, 1 milliliter의 세포 현탁액을 풀에 추가합니다.

세포 종류에 따라 37°C 인큐베이터 내에서 10분에서 30분 동안 세포가 패턴에 결합하도록 둡니다. 세포가 패턴에 부착되면, 평형화된 배지를 사용하여 부유 세포를 조심스럽게 씻어냅니다.

흡입 피펫으로 배지를 제거함과 동시에 배지를 첨가합니다. 부착되지 않은 세포를 씻어낼 수 있도록 충분한 유량을 유지하면서도 세포가 배지에 잠겨 있도록 유지하는 것이 중요합니다. 다음으로, PDMS가 파손될 경우 배지가 누출되거나 증발하는 것을 방지하기 위해 웰 상단에 커버슬립을 덮고, 세포가 패턴 위에서 수 시간 동안 퍼질 수 있도록 둡니다.

그런 다음 장치를 도립 현미경 위에 올리고 이미징을 시작합니다. 초점 조절 문제로 인해 작동하지 않으므로 오일 침수 렌즈의 사용은 피하십시오. 마이크로 패턴 세포를 신장시키려면 x, y, z축의 스테이지 위치를 보정하면서 마이크로미터 나사를 돌리십시오.

PDMS의 확장과 초점 손실을 상쇄하기 위해 스테이지 위치를 보정해야 합니다. 본 비디오 프로토콜에서 제시하는 기술은 중기 시작 시점에 기질을 신장시켜 포유류 분열 세포의 수축 섬유(retraction fibers)에 힘을 가할 수 있게 합니다. 이러한 수축 섬유 중 일부가 세포체에서 당겨지면서 분열 세포의 피질에 기계적 힘이 가해지며, 이를 구현하기 위해 세포를 타원형 패턴 위에 플레이팅합니다.

패터닝은 포토마스크를 통해 원형 패턴을 찍어내는 동안 PDMS를 신장시켜 수행합니다. 신장 후에는 기판을 다시 늘려 패턴이 원형이 되도록 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 매크로 패턴 위에 세포를 도말하고 기판에 신장력을 가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.