형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

이 방법은 형광 표지된 바실러스 수틸리스(bacillus sutilis)의 공동 배양을 사용하여 시간이 지남에 따라 박테리아 세포 집단에서 유익하고 해로운 돌연변이의 빠른 클론 확장과 제거를 모니터링합니다. 먼저, 경쟁 실험을 위해 박테리아의 사전 배양을 준비합니다. 형광 표지된 균주를 동일한 양으로 혼합하고 다양한 영양 조건에서 박테리아를 공동 배양합니다.

그런 다음 다른 시점에서 샘플을 수집하고 적절하게 희석하여 한천 플레이트에서 세포를 증식시킵니다. 이제 입체 형광 현미경으로 살아남은 균주를 시각화하고 계산합니다. 궁극적으로, 결과는 계산된 군집의 전체 수에 대해 살아남은 박테리아의 비율을 결정할 수 있습니다.

균주 라벨링을 위해 다른 항생제 재 카세트를 사용하여 종 내 경쟁을 모니터링하는 것과는 다릅니다. 이 방법에서 형광 표지된 경쟁사 균주는 거의 완전히 등장성이며 동일한 AGA 플레이트에서 추출할 수 있습니다. 사전 절차는 제 연구실의 박사 과정 학생인 Lorena가 발표할 예정이며, 4밀리리터의 LB 배지에 섭씨 영하 80도의 박테리아 1마이크로리터를 접종하고, 극저온 스톡을 주입하고, 섭씨 28도에서 하룻밤 사이에 사전 배양을 성장시키고 220RPM으로 0.1밀리리터의 배양액을 1.5밀리리터의 베트에서 0.9밀리리터의 LB 배지로 묽게 합니다. 광학 밀도를 결정합니다.

그런 다음 경쟁 실험을 위한 혼합 세포 집단을 얻기 위해 20ml의 CGLC 및 CGLC가 포함된 100mL 쉐이크 플라스크를 접종합니다. 1:1 비율의 최소 매체, 10ml의 배양물을 15ml 플라스틱 튜브로 옮깁니다. 4, 000 시간 중력에 10 분 동안 분리기분리에 의하여 세포를 가을걷이하고 상등액을 버리십시오.

그런 다음 0.5 밀리리터의 새로운 LB 배지에 세포를 재현탁시키고 세포를 멸균 1.5 밀리리터 반응 컵에 옮기고 0.5 밀리리터의 50 % 멸균 글리세롤을 첨가합니다. 엄격한 와류로 현탁액을 혼합하고 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오. 다음 배양, 쉐이크 플라스크에 남아 있는 박테리아.

세균총의 광표백을 방지하기 위해 진탕 플라스크를 어두운 곳에 보관하고, 7시간 및 24시간 성장 후 배양물 샘플 0.1ml를 측정하고, 샘플의 1-10 희석의 광학 밀도를 기록하고, 섭씨 영하 80도에서 보관할 샘플의 극저온 스톡을 만듭니다. 모든 샘플을 수집한 후 극저온 스톡을 해동하고 각 균주 플레이트에 대해 0.9% 식염수 용액으로 세포를 희석합니다. 0.1 밀리리터의 10 내지 음의 5 차 희석을 SP 매체 한천 플레이트에 분배하고, 멸균 유리 피펫을 사용하여 세포를 분배한다.

검은 펜으로 단일 군체가 나타날 때까지 섭씨 37도의 어둠 속에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 더 나은 방향을 위해 한천 플레이트의 바닥을 네 부분으로 나누고 실체 형광 현미경에서 생존자를 계산합니다. 이제 현미경 아래에 플레이트를 거꾸로 놓고 차가운 광원을 사용하여 군체에 초점을 맞춥니다.

군체에 초점이 맞춰지면 CFP Flora four에 적합한 필터 세트로 전환합니다. CFP로 표시된 균주의 생존 세포를 시각화하려면 펜으로 콜로니를 표시하여 이 균주의 생존 세포를 세십시오. 그리고 숫자를 기록해 두십시오.

에탄올로 라벨을 제거합니다. 그런 다음 YFP 필터 세트로 전환합니다. YFP로 표지된 균주의 생존 세포를 시각화합니다.

펜으로 식민지에 라벨을 붙여서 생존자를 다시 세십시오. 그리고 숫자를 기록해 두십시오. CFP 필터 세트와 YFP 필터 세트로 촬영한 한 지점에서 사진을 엽니다.

대비와 밝기를 최적화하여 미디어의 배경 형광을 줄입니다. 사진 중 하나로 이동하여 모두 선택합니다. 사진을 복사하여 다른 사진에 붙여넣습니다.

레이어 메뉴에서 더 밝은 색상 옵션을 선택하여 사진을 병합합니다. 이 실험에서는 두 개의 BCI 균주로 구성된 세포 집단을 Fluor CFP 및 YFP로 라벨링하여 한천 플레이트에 적절한 희석액을 도금하여 성장에 대한 다양한 질소 공급원의 영향을 평가했습니다. 시간 경과에 따른 세포 집단의 클론 구성은 노란색 및 파란색 형광 군체를 세는 것만으로 정확하게 측정할 수 있습니다.

글루타메이트 탈수소효소 활성은 외인성 글루타메이트의 가용성에 따라 오투스의 적합성에 큰 영향을 미칩니다. 외인성 글루타메이트가 없는 경우, 높은 수준의 GDH 활성은 효소가 G를 흔들고 좋은 B가 동화작용에 필요한 글루타메이트를 분해하기 때문에 박테리아에 불리합니다. 대조적으로, 두 가지 기능성 gdhs의 합성은 G 포도당 글루타메이트 외에도 글루타메이트가 탄소원으로 사용되기 때문에 외인성 글루타메이트를 사용할 수 있을 때 박테리아에 유리합니다.

다이 스위치 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 다시 말하지만, 높은 수준의 GDH 활성을 가진 박테리아는 글루타메이트가 결핍된 성장 배지에서 GDH 활성이 감소된 세포와 경쟁에서 우위를 점했습니다. 대조적으로, 단 하나의 활성 GDH만 합성하는 박테리아는 배양에서 제거되었습니다.

배지에 글루타메이트가 보충되었을 때, 혼합 세포 집단의 초기 조성은 분명히 시간이 지남에 따라 거의 일정하게 유지되었습니다. Fluor를 함께 복용하는 것과 무관합니다. Flora Force의 사용은 경쟁 우위가 생성되면 박테리아 세포 집단에서 종 내 경쟁을 모니터링하기 위한 강력한 도구입니다.

이 기술은 제대로 수행되면 5일 안에 완료할 수 있습니다.