Name: 라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 학습하세요 식세포에서 파고솜 성숙 및 파고리소솜 생성의 실시간 동적 과정을 포착하는 방법을 형광 표지된 덱스트란을 사용하여 라이브 세포 이미징으로 관찰하고 정량적 분석을 수행하는 기법입니다.

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우리는 원고의 중요한 읽기의 phagosome 생물학 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 젊은 탐정 그랜트 (이니셔티브와 헬름홀츠 협회의 네트워킹 기금) 및 우선 순위 프로그램의 독일 연구위원회 (도이치 Forschungsgemeinschaft, DFG)의 SPP1580 교부금에 의해 지원된다.

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<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
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<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

다음 섹션에서 우리는 제시된 방법과 그 한계의 중요한 단계를 설명합니다. 또한, 우리는 그들의 솔루션과 일반적인 문제 중 일부를 연결 가능한 수정 사항을 소개하고 우리의 방법의 장점뿐만 아니라이 방법에 적합한 보완적인 방법을 고려할 것입니다. 비드 표면의 IgG의 결합을 포함한 비드의 제조는, 결정적이고 unfresh 제제의 사용은 피해야한다. 그것에 추가, 그것은 덱스 트란 갓 모든 실험 전에 냉동 보관 (희석 및 소독)에서 준비하는 것도 중요합니다. 이 덱스 트란의 로딩이 셀룰러 흡수 및 구획 분포 및 축적 일관성을 달성하기 위해 정확한 일정을 따르는 것이 중요하다. 또, 동일 현미경 설정 및 소프트웨어 설정뿐만 아니라, 가능 (예 TE 한 일정 주변 조건을 유지할뿐만 아니라 사용하는 것이 중요mperature, CO 2, 습도, 비드 또한 기술, 등.). 또 다른 중요한 점은 뷰 또는 그 셀의 필드의 선택이다, 샘플을 ...

대 식세포 등의 전문 식세포는 면역 시스템에서 중요한 재생할 수 있습니다. 선천성 면역 시스템 방어의 첫 번째 라인 인 이외에, 그들은 또한 역할 1-3 제시 그들의 시그널링 및 항원을 통하여 적응 면역의 활성화에 중요한 역할을한다. 전문 식세포의 기능이 다방면 동안, 성숙의 phagosome는 전문 식세포 4,5의 살균 및 항원 처리 기능의 중요한 골격이다. 수용체 매개 말림 및 박테리아와 같은 식세포 대상의 이해에 따라, 초기의 phagosome는 상호 작용과 세포 내 이입 네트워크의 구획 및 여러 다른 세포 소기관 6과의 교류의 복잡하고 잘 조율 된 순서를 통해 간다. 화합물의 성질은 이러한 셀룰러 엔티티뿐만 아니라 규제와 교환 및 융합 이벤트의 타이밍은 내강 phagosomal의 환경 및 phagos을 결정OMAL 막 조성과, 따라서 7, 성숙의 phagosome 8의 운명. 성숙의 phagosome의 생리 학적 관련성은 탈출 체포 또는 성숙의 phagosome 9를 파괴하기 위해 다양한 세포 내 병원균에 의해 사용되는 다양한 전략을들 수있다. 가수 분해 효소 및 성숙의 phagosome 7 안티 박테리아 요소 벌크 그들을 부여한다 늦은 엔도 솜 / 리소좀 구획의 phagosome의 융합, 이러한 전략의 대부분은 직접 또는 간접적으로 성숙의 phagosome 프로세스의 최종적이고 중요한 단계를 방지 , 8,10. 자연의 생리 학적 상태가 활용되고있는 특정 실험 설정에서 영향을 긍정적으로 또는 부정적으로되는 경우이 마지막 중요한 단계의 분석은 따라서 phagosomes를 성숙의 상태에 대해 강한 지표를 저희에게 제공 할 수 있습니다. 늦은 엔도 좀 / 리소좀 함설정 해제는 일반적으로 각종의 존재에 의해 초기 세포 내 이입 구획에서 정의한 고유 세포 내 이입 경로의 말단 구획, 특정 마커 분자를 무대로 간주된다. 예를 같은 사람 11 중 리소좀 관련 막 단백질 (램프)로 가수 분해 효소 또는 막 구성 요소에 대한. 단말 내 이입이 구획-금후 리소좀는 또한-식세포 / 이입 통로 (12)의 단부에 소화의 최종 단계를 위해 주요 위치 역할을 간단히 언급. 이러한 방식으로, 난소 화성 프로브는 세포 외 환경에서의 엔도 시토 시스와 macropinocytosis 통해로드 될 수 있고, 그것은 흡수 및 체이스의 정의 사이클에 따라도 13, 14를 축적 리소좀으로 세포 내 이입 경로를 통해 반송. 15-17 endocyticprobes 등 유기 난소 화성 고분자 덱스 트란 형광 현미경 형광 - 복합 프로브는 일반적으로 사용됩니다. <p clas이 방법의 = &quot;jove_content&quot;&gt;, 우리는 된 phagosomes에 리소좀 내강 내용의 전달을 분석하여 성숙의 phagosome을 조사하기 식세포화물로 IgG의 코팅 마이크로 비즈의 활용에 대해 설명합니다. 라이브 골수 유래 대 식세포 (BMM) 및 공 초점 레이저 주사 현미경 시간 경과 비디오 영상에서 리소좀의 즉시 검출 마커로 형광 - 복합 덱스 트란 프로브를 사용하여, 우리는 최고를 가진 된 phagosomes에화물 배달의 동적 프로세스를 따라야 시간 해상도. 우리는 통계적으로 Microsoft Excel을 사용하여 분석 및 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 (14, 18)를 사용하여 제시 수집 시간 경과 영상 데이터는 오픈 소스와 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어, 피지 (또는 ImageJ에)를 사용하여 평가 될 수있는 방법에 대해 설명합니다. 우리의 방법에 대한 설명에 이어, 유사한 실험의 phagosome 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위해 수정 된 설정 요인을 사용하여 설계 될 수 있으며, 거의 모든 OT부착 차 또는 세포 라인 포식 세포의 그녀의 유형을 포함하여 기능 실험의 유전 손실 유전자 아웃을 노크 노크 다운, 돌연변이 또는 융합 단백질, 식세포 - 대상, 마이크로 비드 코팅 화합물, 엔도 좀 / 리소좀 프로브 및 요인 등의 표현 그 중에서도 사이토킨, 화학 억제제 또는 siRNA의이 방법의 기본적인 접근 방식에 적용될 수있는 모든 변수이다. 우리는 다음과 같이이 방법의 목표와 기본 요구 사항을 정의 : <ul type="disc"><li> 방법의 목표 : 식세포의 살아있는 세포에서 높은 시간 해상도와 성숙의 phagosome의 직접 양적 및 질적 관찰과 분석을 가능하게하는. </li><li> 식세포화물 : 적절하게 코팅 된 미세 입자 또는 생물학적 대상입니다. 여기에서 우리는 쉽게 구단-γ 수용체 매개 식균 작용을 통해 내장되어 3 μm의 구형 폴리스티렌 미립자 IgG의 코팅 사용합니다. 또한, 모든 미생물 또는 코팅 된 마이크식세포 수용체는 세포에 존재하는 roparticle가 사용될 수있다. </li><li> 식세포 : 해당 식세포 수용체를 표현 자기편 식세포. 여기에서 우리는 풍부 구단-γ 수용체를 표현 마우스 기본의 BMMs를 사용합니다. 또한, 수지상 세포 (DC), 단핵구 또는 식세포 상피 세포 또는 유전자 돌연변이 또는 녹아웃 변형이 사용될 수있다. </li><li> 리소좀화물 : 찬란 리소좀 프로브. 여기에, 텍사스 레드 - 복합 70,000 킬로 달톤의 덱스 트란 (Dex70kD)는 리소좀의 내강화물로 사용됩니다. 대안 적으로, 산도있는 분해 능력으로 phagosomal 속성에 대한 세포 구획 또는 세포 기관, 또는 적절한 프로브의 형광 검출 마커, 성숙의 phagosome의 진행을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> , 예를 들어 분자, 화합물, 유전자 노크 다운, 또는 할 수 돌연변이 단백질의 일시적 발현 신​​호 : 요인에 영향을 미치는. 여기, 우리는 FORG있다간단히하기 위해 이러한 요소 중 하나를 사용하지만, 돌연변이 단백질 발현 및 Kasmapour 등. 18 된 phagosomes의 식균 작용 또는 상황과 이동성에 영향을 / 수있는 모든 요소를 참조하십시오 노크 다운에 영향을 미치는 요인과 최근의 예를 들면, 또는 성숙 된 phagosomes와 상호 작용하는 구획은 잠재적으로 사용될 수있다. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, 오스트리아</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)</td><td>PAA, 오스트리아</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>PAA, Austria</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAA, Austria</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Austria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>PAA, 오스트리아</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; 유리 바닥 접시 (35 mm &empty;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Netherlands</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM 유리 바닥 접시, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, 독일</td><td>627871</td><td>대안: 분절된</td></tr><tr><td>Carboxylated 라텍스 마이크로스피어로</td> 사용 가능 <td>Polysciences, USA#</td><td>09850</td><td>다른 직경에서 사용 가능, 우리는 3 &mu; m</td></tr><tr><td>폴리스티렌 미립자</td><td>Kisker Biotech, 독일</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, 독일</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>마우스 전체 IgG</td><td>Rockland, 미국</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC crosslinker</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1-ml 주사기 Omnifix -F</td><td>B.Braun, 독일</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; G 바늘 (0.45*25 mm)</td> <td>B.Baun, 독일</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, 오스트리아</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Gibco, 미국</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES 수화물</td><td>시그마-알드리치, 미국</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; M 실린지 장착 필터</td><td>Sartorius, 독일</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

라이브 식세포에 phagolysosome 속생의 연구

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

식세포는 삭제 및 된 phagosomes에 침입하는 미생물을 제거함으로써 선천성 면역 시스템에서 중요한 역할을한다. 성숙의 phagosome는 초기의 phagosome는 세포질에있는 다양한 세포 소기관 및 구획이 잘 조율 된 상호 작용을 통해 급격한 변화를 겪게되는 동안의 복잡하고 단단하게 통제 된 과정입니다. 자신의 세포 용해 및 살균 속성으로 된 phagosomes를 부여하는에 의한 식세포의 생리 기능을 위해 필수적이며이 과정은, 리소좀과 phagosomes를위한 성숙의 마지막 중요한 단계로 간주됩니다 phagolysosomes의 생합성로 된 phagosomes의 융합에 절정에 이른다. 이 보고서에서, 우리는 phagolysosome의 생합성의 특징이다 콘텐츠 전달을의 phagosome하는 리소좀의 역동적 인 과정의 정성 및 정량 분석​​을 위해 라이브 셀 이미징 기반 방법을 설명합니다. 이 접근법은 phagocy 모델로의 IgG 코팅 된 마이크로 비드를 사용내강 리소좀화물 프로브로 tosis 및 형광 - 복합 덱스 트란 분자, 시간 경과 이미징 및 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 라이브 대식 세포에서 실시간으로 된 phagosomes에 lysosmal 콘텐츠의 동적 전달을 수행하기 위해. 여기에 우리가 자세히 배경, 준비 단계 및 기타 실험실에서이 방법의 쉽고 정확한 배치를 가능하게하는 단계별 실험 설정에 대해 설명합니다. 우리의 기술 방법은, 간단한 강력한, 가장 중요한 것은, 쉽게 다른 시스템과 같은 각종 식세포 종류, 기능 상실 실험 상이한 프로브의 사용과 같은 여러 가지 실험 설정에서 phagosomal 상호 작용 및 성숙을 연구하기 위해 적응 될 수 있으며, 식세포 입자.

이미징을위한 세포와 구슬의 올바른 준비가 중요합니다. 그림 1은 BMMs에 대한 우리의 최적화 된 프로토콜을 기반으로 파종, 프로브 로딩이 방법의 초기 이미징 단계의 개요를 보여줍니다. 그것은 프로토콜 파라미터가 세포와 사용되어야 프로브의 종류에 따라 시험하고 최적화 할 수 있다는 것이 필수적이다. 사전로드 된 세포의 IgG 코팅 된 비드를 첨가 한 결과, 소정 배율 설정으로 유지하면서 시야가 가능한 셀들의 가장 큰 수있는 잠재적 인 흡수 이벤트의 최대 개수를 제공하는 방식으로 선택되는 것이 중요 프로토콜. 도 2에 도시 된 바와 같이,이 방법은 각 시간 경과 비디오 분석 가능한 된 phagosomes의 큰 수를 제공 할 수있다. 각 실험 세트의 비디오 수율 당 데이터 포인트의 증가에 더하여,이 변화에 의해 도입 periphe 편차 감소RAL 조건과 데이터의 안정성을 증가시킨다. <p class="jove_c...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

다음 실험의 전반적인 목표는 식세포 내에서 파고좀(phagosome)의 성숙과 파고리소좀(phagolysosome) 생성의 실시간 동적 과정을 포착하는 것입니다. 이는 세포의 리소좀 구획에 형광 결합 덱스트란(dex strand)을 로딩하여 리소좀 구획을 시각화하고, 그 내부의 화물이 파고좀으로 전달되는 것을 가능하게 함으로써 달성됩니다. 그 다음 단계로, 식세포 작용 모델 역할을 하는 미세 입자를 첨가합니다.다음으로, 라이브 셀 이미징과 후속 디지털 이미지 프로세싱을 통해 리소좀 물질의 파고솜 전달을 분석합니다. 파고솜 성숙 과정을 정량화하기 위해, 리소좀 내용물의 파고솜 전달을 기반으로 파고솜 성숙 과정에 미치는 다양한 요인의 영향을 결과로 보여줍니다. 고정된 세포에서 대식세포 성숙을 평가하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 높은 시간 분해능을 가진 정량적 판독이 가능하다는 것입니다. 우선 Texas red 표지 70 kDa DExT 스트랜드 또는 Dex 70 KD를 PBS에 20 mg/mL 농도로 용해한 후, 분주하여 -20 °C에서 보관합니다.다음으로, Dex 70 KD 스톡을 완전 세포 배양 Docos, modified eagles medium 또는 DMEM을 사용하여 약 1 mg/mL로 희석합니다. 초음파 세척기에서 DExT 가닥 분액물을 5분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기를 사용하여 최대 속도로 5분 동안 원심분리하여 용액에서 응집물이나 오염 물질을 제거합니다.바닥의 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 SuperAgent를 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 완전 세포 배양 DMEM 및 필터 용액을 사용하여 최종 작동 농도가 20 µg/mL가 되도록 희석합니다.0.22 µm 시린지 마운트 필터를 통해 용액을 멸균합니다. 다음으로, 골수 유래 마우스 대식세포 2 mL를 5 × 10⁴ cells/mL 농도로 준비합니다. 코팅되지 않은 유리 바닥 디시에 DMEM과 함께 세포를 넣고, 5% CO₂ 완충 분위기의 37 °C에서 최소 12시간 동안 배양합니다.부착 및 부착 후 적응을 확실히 하기 위해, 배지를 흡입하여 제거하고 유리 바닥 디쉬에 2 mL의 pre-warm DExT strand DMEM을 첨가한 후, 2~8시간 동안 세포를 배양합니다. pre-warm complete DMEM으로 세포를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 배지를 흡입하여 제거하고 2 mL의 comp

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을...

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

우리는 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 대식세포에서 전례 없는 고해상도 phagosome formation 및 close를 3차원으로 시각화하는 실험 설정을 설명합니다. 이를 통해 phagocytic cup의 기저부, 확장된 pseudopods, phagosome scission의 정확한 위치를 모니터링할 수 있습니다.

&quot;Phagosome 폐쇄 분석은&quot;사용하여 입체적으로 Phagosome 형성을 시각화하는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)

우리는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 1형에 감염되거나 감염되지 않은 살아있는 세포에서 세포 중심을 향해 이동하는 식체체의 속도를 측정하는 방법을 설명하며, 회전 디스크 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 형광 감염 세포를 식별하고 명시야 현미경을 사용하여 식체를 검출합니다.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

여기에서는 zymosan 및 IgG 코팅 비드를 포함하여 0.5μm보다 큰 곰팡이, 칸디다 알비칸스 및 미립자와 같은 병원체의 식세포작용 중 이벤트의 초기 폭포를 시각화하고 정량화하는 현미경 기반 기술에 대해 설명합니다.

탐식의 초기 단계를 시각화

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Efferocytosis, phagocytic 제거 apoptotic 세포의 항상성 유지 하는 데 필요한 하 고 수용 체와, engulfment, 인식과 apoptotic 세포의 국제화에 대 한 허용 하는 신호 통로 의해 촉진 된다. 여기, 우리는 efferocytosis의 정량화와 efferocytic 신호 통로의 활동에 대 한 형광 현미경 검사 법 프로토콜을 제시.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Leishmania 감염에서 식균작용과 관련된 메커니즘은 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기에서, 우리는 숙주 세포와의 리슈마니아 상호작용 동안 발생하는 초기 사건을 평가하는 방법을 설명한다.

공초점 현미경을 사용하여 리슈마니아 의 식균작용 조사

이 연구는 포유류 세포에서 Godanti Bhasma(GB) 입자의 식세포 처리를 규명하여 세포 흡수, 액포 역학, 산성화 및 분해를 특성화합니다. 이러한 발견은 근본적인 식균작용 메커니즘에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 GB를 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 모델 시스템으로 확립했습니다.

포유류 세포에서 Godanti Bhasma에 의해 유발된 식세포작용의 순차적 세포 이벤트 탐색

학습하세요 식세포에서 파고솜 성숙 및 파고리소솜 생성의 실시간 동적 과정을 포착하는 방법을 형광 표지된 덱스트란을 사용하여 라이브 세포 이미징으로 관찰하고 정량적 분석을 수행하는 기법입니다.

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

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