라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

다음 실험의 전반적인 목표는 식세포에서 식염색체 성숙 및 식분해체 생물 발생의 실시간 동적 과정을 포착하는 것입니다. 이는 세포의 리소좀 구획에 형광 접합 덱스 가닥을 적재하여 리소좀 구획을 시각화하고 내강 화물을 식체로 이동시킬 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 식세포 모델(phagocytic model)로 작용하는 미세입자(microparticles)가 추가됩니다.

다음으로, 식체(phagosome)로의 리소좀 물질의 전달은 실시간 판매 이미징 및 후속 디지털 이미지 처리를 사용하여 분석됩니다. phagosome maturation process를 정량화하기 위해, 결과는 phagosomes에 대한 lysosomal content의 전달을 기반으로 phagosome mature 과정에 대한 다양한 요인의 영향을 보여줍니다. 고정 세포에서 대식세포 성숙 평가와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 높은 시간 분해능으로 정량적 판독을 할 수 있다는 것입니다.먼저 텍사스 레드로 표시된 70킬로달톤 DExT 가닥 또는 Dex 70KD를 PBS에 밀리리터당 20밀리그램으로 용해하고 섭씨 영하 20도에서 부분 표본을 저장합니다.

다음으로, 완전한 세포 배양 Docos, 변형된 독수리 배지 또는 DMEM에서 Dex 70 KD 스톡을 밀리리터당 약 1밀리그램으로 희석합니다. DExT strand 분취액을 초음파 수조에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기에서 용액을 최대 속도로 5분 동안 원심분리하여 용액에서 덩어리나 오염 물질을 제거합니다.

SuperAgent를 바닥에 있는 펠릿을 피하면서 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 완전한 세포 배양에서 용액을 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 작업 농도로 희석합니다. DMEM 및 필터.

0.22마이크로미터 주사기에 장착된 필터를 통해 용액을 멸균합니다. 다음으로, 2 밀리리터의 골수 유래 마우스 대식 세포를 5 곱하기 10의 농도로 4 밀리리터 당 4 번째 세포를 참조하십시오. 코팅되지 않은 유리 바닥 접시에 담긴 DMEM에서 5% 이산화탄소 완충 대기에서 섭씨 37도에서 최소 12시간 동안 세포

부착 후 부착 및 순응을 보장하기 위해 배지를 흡인하고 유리 바닥 접시에 전쟁 전 DExT 가닥 DMEM 2ml를 첨가한 다음 배양 후 2-8시간 동안 세포를 배양합니다. 예열 완전 DMEM으로 세포를 세 번 세척합니다. 최종 헹굼 후 배지를 흡입하고 2ml의 완전한 DMEM을 추가합니다.

세포를 4-12시간 동안 배양합니다. 그런 다음 예열 페놀 레드가 없는 완전한 DMEM으로 세포를 헹구고 이미징 시작 최소 30분 전에 완전히 필터링된 페놀 레드 프리 DMEM 2ml를 추가합니다. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 1%IgG 코팅된 비트 현탁액의 부분 표본을 실온으로 가져옵니다.

초음파 수조에서 용액을 2-3분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 클래스 2 생물 안전 캐비닛 아래에서 1-6 마이크로 리터의 비드 현탁액을 세포에 추가합니다. 피펫을 사용하여 유리 바닥 접시에 현탁액을 부드럽게 혼합하여 빽빽한 구슬 구름을 확산시킵니다.

그런 다음 샘플을 현미경으로 가져와 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 타임랩스 이미징 전. 스캔, 속도, 확대 및 해상도를 포함한 설정을 최적화하여 7초에서 20초마다 한 프레임을 캡처할 수 있습니다.

사용된 이미징 시스템과 프로브에 따라 여기 방출 설정을 조정하고 설정을 최적화하여 과도한 광표백을 방지합니다. 그런 다음 타임랩스 비디오를 캡처하고 현미경의 기본 파일 형식으로 저장합니다. JPG 또는 PNG와 같은 압축된 형식으로 비디오를 내보내지 마십시오.

다음으로, 재구성된 도구 메뉴와 무료로 사용할 수 있는 추가 기본 플러그인이 포함된 이미지 처리 패키지가 포함된 Fiji 및 Image J 배포판을 시작합니다. 다운로드. 피지에서 파일을 열고 평가할 비디오를 선택합니다. 그런 다음 옵션, 필터 및 측정 매개변수를 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 설정합니다.

다음으로, 완전히 형성된 초기 비드 phagosome이 형성되고 F acidic cup이 닫히는 프레임에 주목하여 이미지를 스캔합니다. 타원형 선택 도구를 사용하여 내부화된 비드에서 원형 관심 영역 또는 ROI를 선택합니다. 선택 항목이 비드의 바깥쪽 가장자리에 단단히 맞는지 확인합니다.

그런 다음 분석으로 이동하고 측정을 클릭하여 측정을 실행합니다. 결과는 results라는 제목의 별도 창에 표시됩니다. 다음 관심 프레임에서 비드가 이동한 경우 ROI의 위치를 조정하고 측정을 반복하면 결과 창의 목록에 추가됩니다.

분석된 각 프레임은 레이블 열의 값을 기반으로 식별할 수 있습니다. 모든 관련 프레임의 측정을 완료한 후 int den 열의 값을 스프레드시트 응용 프로그램에 복사합니다. int den 열은 선택한 영역의 강도를 나타냅니다.

이러한 방법을 사용하여 DExT 가닥 프로브로 로드된 골수 유래 대식세포의 선명한 이미지를 캡처했습니다. 이 이미지는 여기에서 지적한 IgG 코드 비드의 흡수를 세포가 완료한 시점인 시간 0에서 가져온 것입니다. 여기에 표시된 이미지는 더 나은 가시성을 위해 유사 색상이었으며 흡수 후 0분에서 85분까지의 식체를 묘사합니다.

측정된 phagosome, ROI는 점선으로 윤곽이 그려지며 phagosome의 dextran 전달 및 축적 사례는 화살표로 표시됩니다. 그런 다음 이러한 이미지에서 그래프를 생성하고 시간 경과에 따른 식체와의 신호 연관성의 명확한 시간적 추세를 보여줍니다. 이 그래프는 여기에 표시된 두 세포에서 평균 10개의 식체를 나타냅니다.

절대 신호 강도는 분석된 각 식체마다 다른 경우가 많지만 시간적 추세는 일반적으로 매우 유사합니다. Dex 70 KD를 Phagosomes에 전달하면 식세포작용 후 35-40분 이내에 고원에 도달했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 타임랩스 컨포칼 현미경을 사용하여 식체 성숙을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.