Name: 테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: 배우세요 분할 인테인 매개 반응을 이용하여 고안정성 단백질 히드로겔을 합성하는 방법을. 이 기술은 세균 숙주에서 단백질 빌딩 블록을 제작하고 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 혼합하여 자가조립 구조를 형성합니다.

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저자는 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN (11)의 자신의 종류의 선물을 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pQE9 AC 10 ATRP 12, 박사 톰 뮤어 (프린스턴 대학) 박사 데이비드 Tirrell (칼텍)을 인정하고 싶습니다 플라스미드의 자신의 유일한 선물 pJD757 13 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10, 박사 제이 D. Keasling (UC 버클리)의 자신의 종류의 선물 박사 다케 히사 마츠다 (기술, 하쿠산, 이시카와 현, 일본의 가나자와 연구원) . 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력, 미국 공군 YIP 노르만 핫쿠 고급 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 플라스미드 건설 참고 : 모든 유전자가 제조업체의 사양에 따라 Phusion 하이 피델리티 DNA 중합 효소를 사용하여 표준 PCR 반응에서 증폭되었다. 클로닝을 위해 사용 된 프라이머는 앞서 설명되었다 (9). 모든 구조는 표 1에 나타내었다. <ol><li> CUTA-NpuN (N, 표 1)를 생성하려면 : <ol><li> PCR은 적절한 프라이머를 사용하여, 각각 플라스미드 pET30-CUTA-TIP1 10 KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11에서와 CUTA NpuN 유전자를 증폭한다. </li><li> 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 N (그림 2A)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다. </li></ol></li><li> NpuC-S-CUTA (C, 표 1)를 생성하려면 : <ol><li> PCR 증폭 NpuC, CUTA 및 S fragmen적절한 프라이머를 사용하여 플라스미드 KanR-IntRBS-NpuNC - CFN 11 pET30-CUTA-TIP1 10 pQE9 AC 10 각각 ATRP 12 일부터 T [AG 3 (PEG)] 10. </li><li> 적절한 제한 효소로이 조각을 소화하고 순차적으로 T7 프로모터와 C (그림 2B)를 생성 할 수있는 C-말단 6xHistidine의 pET26b 벡터에이 조각을 삽입합니다. </li></ol></li><li> : NpuC-S-SH3 LIG-CUTA (C-SH3 LIG 손해, 표 1)를 생성하려면 <ol><li> PCR 증폭 CUTA SH3 LIG 손해 (PPPALPPKRRR) 및 조각 SH3 LIG-CUTA을 생성하는 유연한 링커 (GGGGS) 2를 포함하는 프라이머를 사용하여. </li><li> 조각 SH3 LIG-CUTA와 C에서 CUTA 유전자를 교체합니다. </li></ol></li><li> SH3-GFP (표 1)를 생성하려면 : <ol><li> 사용하여 플라스미드 pJD757 13에서 SH3 유전자를 증폭적합한 프라이머. </li><li> GFP 유전자에이 조각을 융합하고 T7 프로모터 (그림 2C)과 C-말단 6xHistidine 태그 사이의 pET26b 벡터에 삽입합니다. </li></ol></li></ol> 2. 단백질 발현 <ol><li> 적절한 발현 플라스미드와 화학적 유능한 대장균 BL21 (DE3)의 50 μL를 변형. </li><li> 변환 후, 순차적으로 이들 세포를 희석하고, 루리아 - 베르 타니 (LB)에 그들을 접시 / 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함하는 한천 플레이트. </li><li> ~ 15 시간 동안 37 ° C에서 형질 전환 된 세포를 포함하는 번호판을 품어. </li><li> 배양 후, 50 ~ 100 식민지를 포함하는 판을 선택하고 LB의 국물 5 ㎖의 모든 식민지를 재현 탁. </li><li> 전송 1 L LB의 국물 포함 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)에 서스펜션과 250 rpm에서 진탕 37 ° C에서 세포를 성장. 600 nm의 (OD 600)에서 흡광도를 모니터링합니다. OD 600 ~ 0.8까지의 문화를 성장. <ol><li> C 및 C-SH3 LIG 손해 보험의 경우, 문화 (1 mM의 최종 농도)에 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 4 시간 동안 37 ° C에서 문화를 품어. </li><li> N 및 SH3-GFP를 들어, 문화를 냉각 ~ ~ 5 분 동안 얼음 수조에서 배양 플라스크를 침지하여 18 ° C에서. 문화 (1mM의 최종 농도)에 IPTG를 첨가하여 단​​백질 발현을 유도하고 250 rpm에서 진탕하면서 14 ~ 18 시간 동안 18 ° C에서 문화를 배양한다. </li></ol></li><li> 단백질 발현 후, 펠렛을 수집하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 6,000 XG에 문화를 원심 분리기. -80 ° C까지 사용에 보관 세포 펠렛. </li></ol> 3. 단백질 정제 <ol><li> N의 정제 (변성 조건) <ol><li> 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼 A (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. </li><li> Immers빙수 욕에서 펠릿 서스펜션 및 전자 (1 초 펄스 및 1 분 10 초의 일시 정지와 앰프 10) 초음파 처리에 의해 세포를 방해. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 </li><li> 상층 액을 버린다. (8 M 요소를 포함하는) 버퍼 DA의 펠렛을 재현 탁하고 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 현탁액을 원심 분리 </li><li> 이전에 버퍼 DA와 평형을 5 ㎖ 니켈 니트릴 로트리 아세트산 (NTA) 칼럼을 통해 뜨는을 전달합니다. </li><li> 45 mM의 이미 다졸 보충 버퍼 DA 30 ㎖로 컬럼을 씻으십시오. 150 mM의 이미 다졸과 보충 버퍼 DA 20 ㎖를 사용하여 정제 된 단백질을 용출. </li><li> 3.1.7.1 또는 3.1.7.2에 주어진 다음 방법 중 하나가 &lt;1 mm로 단백질 샘플의 요소 농도를 감소 : <ol><li> &lt;20 kDa의 차단과 함께 튜브를 사용하여 4 ° C에서 하룻밤에 DPBS 버퍼 (표 2)에서 단백질을 Dialyze. </li><li> 원심 분리기는 30 &amp; # 단백질을 정제160, 2,800 XG에 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C 볼륨까지보다 1 ㎖이다. 단백질 시료를 희석하기 위해 열을 14 ML의 DPBS 버퍼를 추가합니다. 원심 분리 / 희석 세 번 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 버퍼 교환 한 후, 정제 된 단백질 (최종 2 ㎜)에 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가하고 2,800 XG에 30 kDa의 초 여과 스핀 열, 4 ° C.를 원심 분리하여 ~ 100 ㎎ / ㎖로 단백질을 집중 </li><li> 사용할 때까지 -80 ° C에서 농축 된 단백질과 상점을 나누어지는. </li></ol></li><li> C 및 C-SH3 LIG의 정화 (기본 조건) <ol><li> 버퍼 B (10) 습식 펠렛 ㎖ / g에서 1X 프로테아제 억제제 칵테일 보충 (산도 6.0) (표 2)에 재현 탁 세포 펠렛. 표적 단백질의 단백질 가수 분해를 최소화하기 위해 산성 완충액을 사용한다. </li><li> 3.1.2에 설명 된대로 초음파 처리하여 세포 현탁액을 방해. 리스를 원심 분리기4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 먹고 뜨는을 유지합니다. </li><li> 이전에 버퍼 B.와 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 가용성 해물 합격 </li><li> 버퍼 B와 세척 컬럼 45 mM의 이미 다졸로 보충하고, 150 mM의 이미 다졸 완충액 B로 보충 된 20 ml의 표적 단백질을 용출. </li><li> C의 경우, 3.2.6 단계로 이동합니다. C-SH3의 LIG 들어 단계에 따른다 부분적 분해 단백질을 제거하기 위해 추가로 이온 교환 정제 단계 3.2.5.3에 3.2.5.1을 수행 <ol><li> 3.1.7에 설명 된 절차에 따라 &lt;1 mm로 C-SH3 LIG 손해에 염화나트륨의 농도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 이전 인산 나트륨 완충액 (50 mM의, 산도 7.0)으로 평형을 5 ㎖의 이온 교환 구슬로 장식 된 아가 로스 매트릭스 칼럼에 목적 단백질을로드합니다. </li><li> 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8.0 buffe 함유 용액으로부터 구배를 실행하여 칼럼으로부터 용출 표적 단백질1 M NaCl로 보충 된 동일한 완충액을 함유하는 용액에 R. 도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 기초하여 높은 순도의 단백질 용출 및 풀 샘플 중에 샘플을 채취. </li></ol></li><li> 3.1.7에 설명 된대로, DPBS 버퍼로 정제 된 단백질을 교환 버퍼입니다. </li><li> 정제 된 단백질 (최종 농도 2 ㎜)에 DTT를 추가하고 3.1.8에 설명 된대로 ~ 100 ㎎ / ㎖ 30 kDa의 초 여과 스핀 컬럼을 사용하여 단백질을 집중한다. 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 집중했다. </li></ol></li><li> SH3-GFP의 정화 <ol><li> 10 젖은 펠렛 ㎖ / g에서 버퍼를 사용을 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 3.1.2에 설명 된 초음파에 의해 펠릿 현탁액을 방해. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기 및 뜨는을 수집합니다. </li><li> 이전에 평형을 5 ㎖의 니켈 - NTA 칼럼을 통해 상층 액 (수용성 해물을) 통과버퍼 A. </li><li> 버퍼 30 ㎖로 컬럼을 씻어 45 mM의 이미 다졸 보충. 버퍼 20 ㎖의 150 mM의 이미 다졸을 사용하여 보충 된 정제 된 단백질을 용출. </li><li> 버퍼 3.1.7에 기술 된 것과 유사한 방법을 사용 DPBS 완충액에 정제 된 단백질을 교환하고 단백질을 농축 ~ 150 ㎎ / 3.1.8에서 설명한 바와 같이 30 kDa의 울트라 여과 스핀 컬럼을 사용하여 ML. </li><li> 나누어지는 및 저장은 -80 ° C까지 사용에서 단백질을 정제. </li></ol></li><li> CUTA을 함유하는 정제 된 샘플의 SDS-PAGE 분석 <ol><li> 염화나트륨 ~ 1 mm까지의 농도를 줄이기 위해 두 번 증류수에 각각의 정제 된 단백질을 희석. 이 염화나트륨 농도에서 CUTA 량체 단백질의 대부분은 SDS-PAGE 겔에 단량체로서 실행. </li><li> 2X SDS 샘플 버퍼 (0.5 M 트리스 - 염산, 산도 6.8, 글리세롤, 10 % w SDS V / 0.1 % V의 브로 모 페놀 블루, 2 %의 β-머 캅토 에탄올 승 / 20 %), 95 ° C에서 배양과 샘플을 혼합 5 분. </li><li> 샘에게로드PLES 12 % SDS-PAGE 젤 상. 50 분 ~ 200 V의 일정한 전압에서 전기 영동을 수행하십시오. </li><li> 표준 프로토콜 (그림 1C) 다음 쿠마 화려한 푸른 R250로 염색하여 젤의 단백질을 관찰한다. </li></ol></li></ol> 4. 하이드로 겔 형성 참고 : 별도로 언급하지 않는 한이 연구에서 만든 샘플 하이드로 겔 각 하이드로 겔 빌딩 블록 1.6 밀리미터가 포함되어 있습니다. 이 단백질의 농도는 부드럽고 안정된 겔을 얻을 수 있습니다. 주의 : 아 지드 화 나트륨 (NaN이 3) 박테리아 오염을 방지하기 위해 V / w 0.5 %의 최종 농도로 하이드로 겔에 첨가된다. NaN의 3은 매우 독성 및 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 표시된 극단주의하여 취급해야합니다. <ol><li> 100 μL 샘플 하이드로 겔에서 1.6 ㎜의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 농축 단백질의 각각의 볼륨을 산출한다. 예를 들면 : N의 농도 :100 ㎎ / ㎖ N의 분자량 26.3 kDa의 (표 1 참조) 원하는 양 : 100 ㎕를 원하는 농도 : 1.6 mM의 <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> 100 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C를 혼합 (X μL, 볼륨 4.1에 따라 계산) 5 % NaN의 3 (10 μL)로, 100 mM의 DTT (5 μL)와 N (Y μL, 양에 따라 계산 4.1) 2 ㎖ 유리 병 내부. </li><li> 100 μL의 최종 볼륨을 달성하기 위해 유리 병에 (Y) μL - X - (85), 수동 피펫 팁을 사용하여 소용돌이 치는 움직임을 통해 모든 구성 요소를 혼합 DPBS 버퍼를 추가합니다. 참고 :이 솔루션은 혼합시 점성이됩니다. </li><li> 기포를 제거하기 위해 8,000 XG에서 2 분 동안 상기 혼합물을 원심 분리기. </li><li> 방에서 혼합물을 품어테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응이 완성에 도달 할 수 있도록 밤새 온도. 거꾸로 튜브를 돌려 하이드로 겔 형성을 확인합니다. 하이드로 겔이 형성되는 경우에 단백질은 흐르지 않는다. </li><li> 3.4 (그림 1C)에 설명 된대로, 4.2 단계 전에 SDS-PAGE 젤에 4.5 단계 이후에 수집 된 시료 (0.5 ㎕의 각)을 확인하여 테인 트랜스 - 스 플라이 싱의 수익률을 예상하고있다. </li></ol> 5. 도킹 단백질 (DP)와 도킹 스테이션을 통한 GFP의 고정 펩타이드 (DSP)의 상호 작용 <ol><li> 50 μL의 GFP 기능화 된 하이드로 겔 (1.2 mm)를 만들기 위해 1.7 1:1 몰비 (4.1에 따라 계산, X μL) C-SH3 LIG 손해를 결합 SH3-GFP (Y μL, 4.1에 따라 계산) 밀리리터 microcentrifuge 관 및 실온에서 30 분 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> X - - ​​&lt;5 % NaN의 3 (5 μL), 100 mM의 DTT (2.5 μL), (42.5 추가같은 관에 EM&gt; Y) μL의 DPBS. N 및 C-SH3 LIG의 1:1 몰비를 달성하기 위해 N (Y μL, 4.1에 따라 계산)을 추가한다. 소용돌이 운동에 의해 피펫 팁을 사용하여 샘​​플을 섞는다. </li><li> 2 분 동안 8,000 XG에서 상기 혼합물을 원심 분리에 어두운 혼합물을 실온에서 밤새 배양한다. 배양 중에 SH3-GFP 양식을 캡슐화하는 하이드로 겔. </li></ol> 6. 유기 용매에서 효소 반응에 대한 고정화 발판 1.6 mM의 히드로 겔의 사용 <ol><li> 모델 효소로 HRP를 사용합니다. DPBS에 HRP (28 ㎎ / ㎖ 또는 0.63 ㎜)의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> HRP 포획 30 ㎕의 히드로 겔 (1.6 mm)를 만들려면 C 내부 HRP (2 μL), 5 % NaN의 3 (3 μL) 및 DTT (100 mm의 1.5 μL)과 (X μL, 4.1에 따라 계산) 겸용 1.7 ML의 원심 분리기 튜브. </li><li> N (Y 추가 &lt;/ EM&gt; 4.1에 따라 계산 μL) 및 DPBS (23.5 - X - Y) μL. 소용돌이 모션 피펫 팁과 섞는다. </li><li> 2 분 동안 8,000 XG에서 혼합물을 원심 분리하고, 실온에서 밤새 배양한다. 주의 : 다음 활동 분석에 사용되는 섭정은 매우 독성이 있습니다. 해당 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 의해 특정 안전 권고를 사용합니다. </li><li> 효소 반응을 위해, n-헵탄 (14)의 N, N-디메틸-p-페닐 렌 디아민 (5.8 ㎜), 페놀 (5.8 ㎜) 및 tert-부틸 하이드 로퍼 옥사이드 (2.9 mm)를 함유하는 반응 칵테일 1 ㎖의 하이드로 겔을 물속. 수동 하이드로 겔과 용매의 접촉 면적을 증가시키기 위해 피펫 팁을 사용하여 겔을 방해. </li><li> 플레이트 리더 (그림 5)에서 546 nm에서 다른 시간에 촬영 한 샘플의 흡광도를 측정하여, HRP 제품, 인도 페놀 형 염료를 감지합니다. </li> &lt;/ OL&gt;

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<li>Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yielding+Behavior+in+Injectable+Hydrogels+from+Telechelic+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins.</a> Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).</li>
</ol>

더 경쟁하는 금융 이익은 존재하지 않습니다.

이 작품에서 우리는 매우 안정적인 테인 매개 단백질 하이드로 겔의 합성을 보여 주었다. 분할의 사용은 테인 조건부이 액상 성분의 혼합에 대응하여 형성되는 히드로 겔을 가능하게한다. 구체적으로는, 분할 테인 공유 차례로 자기 하이드로 겔로 조립하는 것이 단위 가교 어귀 폴리펩티드 유닛을 수득 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해이 액상 빌딩 블록을 연결한다. 하이드로 겔의 혼합에 의한 형성은 크로마토 그래피 정제 열 젤 - 매개 막힘이 발생할 수있는 단일 성분의 단백질 하이드로 겔의 합성에 기술적 인 문제를 무시합니다. 또한, 불필요한 화학적 유도제 및 / 또는 물리적 트리거 없이도 생리적 조건 하에서 하이드로 폼. 테인 매개 하이드로 겔은 높은 산성과 염기성, 양쪽 모두의 버퍼의 안정성 및 생리적 온도를 유지합니다. 히드로 겔 무선을 형성 할 수있다더 나은 기계적 안정성 번째는 각각의 빌딩 블록 0.8 MM (데이터가 표시되지 않음) 등의 작은, 그러나 더 높...

단백질 완전히 만든 하이드로 겔은 크게 조직 공학, 약물 전달 및 biofabrication 1 등 다양한 분야를 발전 할 수있는 잠재력을 가지고 다니십시오. 그들은 생체 적합성 및 비 침습적 생체 활성 구형 단백질의 결합을 지원하는 가능성을 포함하여 기존의 합성 고분자 하이드로 젤에 이점을 제공합니다. 이 작품에서 우리는 단백질 고정화 발판으로 분할 테인 매개 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응과 그 응용 (그림 1)를 통해 형성되는 새로운 단백질 하이드로 겔의 개발을 설명합니다. 이러한 하이드로 겔을위한 빌딩 블록은 각각 (IN 및 IC)를 테인 분할 및 가교제 다중 체 단백질의 서브 유닛의 N-또는 C-말단 단편을 포함 두 단백질 블록 공중 합체이다. 테인 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 DnaE 2,3 테인 분할 및 작은 삼량 단백질 피로 코커스 (12 kDa의) CUTA 리코 쉬이 &lt;로 사용되었다/ EM은&gt; 가교제 단백질 4,5로서 사용 하였다. 다른 가교 결합제는 고도로 가교 결합 된 단백질 네트워크 (하이드로 겔)의 형성으로 이어지는 테인 촉매 된 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 통해 결합된다. NPU의 테인이 때문에 빠른 반응 속도 (t 1 / 2 = 63 초)과 높은 트랜스 - 스 플라이 싱 수익률 (에 가까운 80 %), 3의 선택되었다. CUTA 단백질은 높은 안정성으로 인해 가교제로 선정되었습니다. CUTA 트리머 근처 150 ° C의 변성 온도를 가지고 많은 M 5로 구아니딘 염산염 4,6를 포함하는 솔루션 삼량 차 구조를 유지합니다. 다른 가교제 사이의 서브 유닛 교환이 물리적 하이드로 겔 표면 침식 7의 주요 원인이기 때문에, CUTA에서 매우 강한 서브 유닛 간 상호 작용은보다 안정적인 하이드로 겔로 이어지는, 그런 서브 유닛 교환을 억제해야한다. 이러한 빌딩 블록 중 하나는 물을 용이하게하기 위해 중간 블록으로 친수성이 높은 펩티드 S-단편을 포함보존 8. 하이드로 겔이 빌딩 블록의 혼합 양 말단에 가교제와 더 긴 폴리펩티드 사슬을 생성 단편 테인 IN과 IC 사이의 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 개시한다. 여러 그러한 분자 단위에서 가교제는 고도로 가교 하이드로 겔 네트워크 (도 1a)을 형성하는, 서로 상호 작용. 구체적인 &quot;도킹 스테이션 펩티드&quot;(DSP)는 &quot;도킹 단백질&quot;(DP) - 태그 된 하이드로 겔로 표적 단백질을 안정적으로 고정화를 용이하게 하이드로 겔 빌딩 블록 중 하나에 포함된다. 하이드로 겔 어셈블리를 중재하는 테인 분할의 사용은 표적 단백질이 종래의 하이드로 겔 형성에 로딩 될 때, 단백질의 겔 합성에 추가적인 유연성을 제공하지만, 또한 전체 하이드로 걸쳐 표적 단백질의 고밀도, 균일 한 하중을 가능 아닙니다. 테인 매개 단백질 하이드로 겔이 높은 역입니다과 수용액에 적합한 용 작은 - 투 - 더 실온에서 3 개월 만에 검출 침식. 안정성은 pH 값 (6-10)과 온도 (4-50 ℃)의 넓은 범위에서 유지하고, 하이드로 겔은 유기 용매와 호환된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)이 하이드로 겔은 두 개의 공 모양 단백질의 고정화에 사용됩니다. 후자 단백질을 포획 하이드로 겔은, 유기 용매 중에서 생물 촉매를 수행하는데 사용된다.

<table><tbody><tr><td> Phusion High Fidelity DNA polymerase </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competent Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </td></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td>VWR</td><td>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><td>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> Imidazole </td><td>VWR</td><td>EM-5720</td><td> <피></피> </td></tr><tr><td> 우레아 </td><td></td><td>VWREM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> 디티오트레이톨(DTT) </td><td>피셔</td><td>BP172-5 <</td><td>p></tr><tr><td> > 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><td>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> 브릴리언트 블루 R </td><td>Acros</td> <td>OrganicsA0297990</td><td> </td></tr><tr><td> 아지드화나트륨 </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> 주의, 독성이 높은 </td></tr><tr><td> 양고추냉이 과산화효소 </td><td>시그마</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-디메틸-p-페닐렌 디아민</td><td>Fisher</td><td>AC408460250</td><td> 주의, 고독성 </td></tr><tr><td> 페놀 </td><td>피셔</td> <td>AC149340500</td><td> 주의, 고독성 </td></tr><tr><td> tert- 부틸 하이드로 옥사이드</td> <td>피셔</td> <td>AC180340050</td><td> 주의, 고독성 </td></tr><tr><td> n 헵탄 </td><td>Acros 유기물</td> <td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td> Shaker/Incubator </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrifuge </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> 초여과관 </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp; Ni Sepharose High Performance HisTrap 컬럼 </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Sepharose FF 이온 교환 컬럼 </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Plate reader </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

우리는 분할 테인-촉매 단백질 트랜스 - 스 플라이 싱 반응에 의해 매개되는 매우 안정한 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 블록 공중 합체이다. 친수성이 높은 임의의 코일은 물 보존을위한 블록 공중 합체 중 하나에 삽입된다. 두 단백질의 블록 공중 합체의 혼합은 한쪽 끝에서 가교제와 폴리 펩타이드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 유발하는 하이드로 겔에 신속하게 자기 조립. 하이드로 겔은 50 ° C까지, 및 유기 용매에 온도에서 모두 산성과 염기성 조건에서 매우 안정적입니다. 전단에 의한 파열 후 하이드로 겔은 빠른 속도로 개혁. 하이드로 겔 빌딩 블록에 &quot;도킹 스테이션 펩티드&quot;의 설립은 &quot;도킹 단백질&quot;- 태그 표적 단백질을 편리하게 결합 할 수 있습니다.히드로 겔은 조직 배양 성장 배지와 호환되는 20 kDa의 분자 확산을 지원하고, 생리 활성 단백질의 구형 고정화를 가능하게한다. 유기 용제 대응의 생체 촉매로서 테인 - 매개 단백질 겔의 적용은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 효소를 캡슐화하고 그 활성을 확증에 의해 입증되었다.

테인 매개 단백질 하이드로 겔 형성을위한 회로도는 그림 1A에 제시되어있다. 하이드로 겔의 빌딩 블록은 단백질 CUTA NpuN-(N) 및-S-NpuC CUTA (C) (도 1a, 표 1)를 공중합. NpuN / C는 Nostoc의 punctiforme (NPU)에서 테인 자연스럽게 분할 DnaE의 N-/C-fragments 있습니다. CUTA는 피로 코커스 호 리코 쉬이 4,5에서 안정적인 삼량 단백질이다. (도 1A 및 1C) : 라이 게이션 생성물 (CUTA-S-CUTA J) - 환원제 DTT의 존재하에 정제 된 N 및 C의 혼합은 제 단백질의 형성을 유도한다. 개별적으로, 하이드로 겔 빌딩 블록 N 및 C는 점성 유체 (도 1b)에 존재한다. N 및 C의 혼합은 하이드로 겔 (15, 16) (도 1b)...

우리는 분할 테인 - 매개 단백질 겔의 합성을 제시한다. 이러한 하이드로 겔의 빌딩 블록은 각각 분할 테인의 가교제 및 ​​반 역할 삼량 단백질의 서브 유닛을 포함하는 단백질이 공중 합체이다. 두 단백질 공중 합체의 혼합은 하이드로 겔로 자기 조립 폴리펩티드 단위를 산출 테인 트랜스 - 스 플라이 싱 반응을 트리거합니다. 하이드로 겔은 높은 산도와 온도 안정, 유기 솔벤트와 함께, 쉽게 기능을 구형 단백질을 포함하고 있습니다.

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 고정화를 위한 일반적인 스캐폴드로 사용할 수 있는 고안정성 단백질 하이드로겔을 합성하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아 숙주에서 두 가지 단백질 하이드로겔 빌딩 블록을 합성함으로써 달성됩니다. 각 빌딩 블록은 가교제로 작용하는 키메라 단백질의 하위 단위와 NPU split ene의 절반을 포함하고 있습니다.그 다음 두 번째 단계에서 이 단백질들을 친화성 크로마토그래피로 정제합니다. 정제된 단백질 빌딩 블록들을 혼합하여 트랜스 스플라이싱 반응을 개시하며, 이를 통해 가교제(cross linkers)가 측면에 배치된 자기 조립 폴리펩타이드가 재구성되어 하이드로겔 형성을 유발합니다. 단백질 블록에 적절한 결합 모티프를 통합하면 이 하이드로겔은 용액 내에서 매우 안정적입니다.공중합체는 기능성 각질 단백질의 편리한 부위 특이적 결합을 하이드로젤 구성 단위에 가능하게 하여 하이드로젤 형성을 유도하며, 이는 단백질을 고정시킵니다. 고정된 각질 단백질은 실온에서 3주 동안 낮은 용출률을 보입니다. 마지막으로, 이 단백질 하이드로젤에 고정된 효소는 유기 용매에 의한 변성으로부터 보호됩니다. 따라서 이 하이드로젤은 유기 합성을 위한 생물 반응기로도 활용될 수 있습니다.표면 LI 가교 결합 또는 고체 지지체 내 효소 캡슐화, 다공성 지지체 내 효소 캡슐화, 또는 효소 간 가교 결합을 포함한 기존의 안정적인 단백질 고정화 방법과 비교했을 때 본 기술의 주요 장점은 단백질 측쇄의 화학적 변형 없이 다공성 및 고수화 환경에서 표적 단백질을 안정적으로 고정할 수 있다는 점입니다. 또한, 이 기술은 경로 내의 여러 효소를 미리 정해진 3차원 배열로 조립할 수 있게 하여 효소 간의 기질 채널링을 촉진할 수 있습니다. 본 절차를 시작하기 전에, 재조합 DNA 기술을 통한 플라스미드 구축 후 단백질 발현 및 E. coli BL21(DE3)에서의 정제를 통해 두 개의 단백질 블록 공중합체 N과 C를 생성하십시오. 그다음, 젖은 펠릿 1g당 10mL의 버퍼 A로 세포 펠릿을 재현탁하십시오.그 후 펠릿 현탁액을 얼음물 배스에 담그고, 10 amps에서 1초 펄스와 6초 휴지 시간을 설정하여 1분 동안 초음파 파쇄기로 세포를 파쇄합니다. 용해물을 4 °C에서 6,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리기로부터 튜브를 꺼낸 후 상층액을 버리고, 이전과 동일한 조건으로 원심분리하여 펠릿을 buffer DA에 재현

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

세포 및 약물 전달을 위한 장치로서 RGD 기능성 하이드로겔을 합성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차에는 알킨 변성 폴리아크릴산(PAA)과 RGD-아지드 유도체 사이의 구리 촉매 알카인-아지드 고리첨가(CuAAC)가 포함됩니다. 하이드로겔은 마이크로파 보조 중축합을 사용하여 형성되며 물리화학적 특성이 조사됩니다.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

나노겔은 생물학적 제제 전달을 위한 우수하고 다재다능한 나노입자 플랫폼입니다. 단백질 기반 페이로드를 캡슐화할 수 있는 자극 반응성 폴리(에틸렌) 글리콜 기반 고분자 나노 겔은 수성 조건에서 1단계 가교 공동 나노중합 전략을 사용하여 합성되었습니다. 이러한 새로운 나노 입자의 최적 제조 및 특성화가 여기에 제시되어 있습니다.

Aqueous One-step Crosslinking 및 Co-nanopolymerization을 이용한 Stimuli-responsive Nanogel 합성

여기에 제시된 프로토콜은 강력한 접착성 하이드로겔 젤라틴 o-니트로소벤즈알데히드(젤라틴-NB)의 합성을 보여줍니다. Gelatin-NB는 빠르고 효율적인 조직 접착 능력을 가지고 있어 상처 표면을 보호하기 위해 강력한 물리적 장벽을 형성할 수 있으므로 부상 복구 생명 공학 분야에 적용될 것으로 기대됩니다.

강력한 접착력 하이드로겔, 젤라틴 O-니트로소벤즈알데히드의 합성

여기에서 우리는 외부 액상 없이 매크로 스케일 하이드로겔 매트릭스에 cell-free 단백질 합성 반응을 포함하기 위한 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

거시적 규모의 하이드로겔에 cell-free 단백질 합성 반응을 임베딩하는 방법

이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.

기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

배우세요 분할 인테인 매개 반응을 이용하여 고안정성 단백질 히드로겔을 합성하는 방법을. 이 기술은 세균 숙주에서 단백질 빌딩 블록을 제작하고 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 혼합하여 자가조립 구조를 형성합니다.

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

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