의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

다음 실험의 전반적인 목표는 다른 발현 숙주에서는 생산할 수 없는 Miran Kinlin three를 곤충 세포 배양을 통해 밀리그램 단위로 효율적으로 생산하는 것입니다. 이는 KINLIN three 전달 벡터를 공학적으로 설계된 bao virus back mid와 함께 COT transecting하여 KINLIN three 유전자를 운반하는 재조합 bao virus를 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 향후 단계에 필요한 충분한 양의 비리온을 생산하기 위해 곤충 세포 내에서 바이러스를 증폭시킵니다.

다음으로, 고속 액체 크로마토그래피를 통한 정제가 가능하도록 곤충 세포를 감염시켜 대량의 Kinlin three 단백질을 생산합니다. SDS page 분석과 크기 배제 크로마토그래피를 통해, 고순도의 기능성 kinlin three를 밀리그램 단위로 생산할 수 있다는 결과가 도출되었습니다. 박테리아에서의 kindling three 발현과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 baculovirus 감염 곤충 세포 발현을 통해 재조합 단백질 수율을 10배 증가시킬 수 있다는 점입니다.

본 실험에 사용되는 SF nine 세포는 100 µg/mL penicillin과 100 µg/mL streptomycin이 첨가된 SF 902 배지를 사용하여 부유 배양 및 유지합니다. baculovirus 생성을 위해, 세포는 5 × 10⁵ ~ 1 × 10⁶ cells/mL의 밀도 범위로 배양해야 합니다. transfection을 위한 SF nine 세포 준비를 위해, 멸균된 6-well 조직 배양 플레이트의 각 well에 penicillin과 streptomycin이 첨가된 SF 902 배지 2 mL와 약 1 × 10⁶ cells를 분주합니다. SF nine 세포가 플라스틱 well 바닥에 부착되어 단층(monolayer)을 형성하도록 흄 후드 내 실온에서 약 20분간 방치합니다. 재조합 baculovirus 생성은 단층으로 배양된 SF nine 세포에 플라스미드 DNA와 BMid DNA를 공동 transfection함으로써 이루어집니다.

발현 벡터 papine neuron firm T three는 마우스 KINLIN three 유전자 firm T three를 포함하고 있습니다. P 10 BAO 바이러스 프로모터의 제어 하에 있으며, 백미드(back mid)와의 재조합을 허용하기 위해 측면 bao 바이러스 서열을 보유하고 있고, 이후 정제를 위해 C 말단 hiss six tag를 인코딩합니다. 각 형질전환마다 0.5 µg의 정제된 B mid 및 항생제가 없는 100 µL의 SF 902 SFM과 함께 1~2 µg의 정제된 MFI T three를 혼합합니다. 이것이 용액 A가 됩니다. 별도의 튜브에, 6 µL의 cell effect in two 시약을 항생제가 없는 100 µL의 SF 902 SFM으로 희석하십시오.

많은 수의 transfection이 필요한 경우, 액체 핸들링을 줄이기 위해 각 transfection 반응을 위한 마스터 믹스를 여기서 제조할 수 있습니다. 이것이 용액 B입니다. transfection당 각각 약 200 µL씩 사용하여 용액 A와 B 두 가지를 혼합하고, 지질-DNA 복합체를 형성하기 위해 상온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후, 항생제가 없는 SF 902 SFM을 transfection당 800 µL씩 넣어 지질-DNA 복합체를 희석합니다. 다음으로, SF nine 세포 단일층 배지를 조심스럽게 흡입하고, AB 용액과 배지 혼합물을 SF nine 단일층 위에 조심스럽게 피펫팅합니다.

세포가 건조되는 것을 방지하기 위해 가습된 환경을 조성하여, 형질전환된 세포를 27°C의 가습 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 6-웰 디쉬를 젖은 종이 타월과 함께 플라스틱 뚜껑이 있는 용기에 넣습니다. 다음 날, 각 단층 배양물에 항생제가 없는 SFM에 SF 900 1 mL를 추가하여 27°C에서 5일 더 배양합니다.

5일 후, 배양액에서 재조합 bao 바이러스를 직접 수확하여 깨끗한 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1000 Gs에서 5분간 원심분리하여 SF nine 세포 잔해를 제거합니다. 상온에서 상층액에 포함된 바이러스(P1으로 표기)를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. P1 바이러스 세대의 예상 바이러스 역가는 1 × 10⁷ PFU/mL로 간주할 수 있습니다.

필요한 경우 플라크 분석(SA)을 수행할 수 있지만, P1 바이러스 스톡은 사용 전까지 4°C의 암소에 보관하십시오. 재조합 balo 바이러스 증폭에 사용되는 현탁 배양 SF9 세포의 밀도는 1.4 × 10⁶ cells/mL여야 하며, 배양액은 전체 플라스크 부피의 1/20을 차지해야 합니다. 예를 들어, 2L 플라스크에 50mL를 넣는 것입니다. 일반적으로 최적의 vao 바이러스 증폭 및 단백질 생산을 위해 SF9 세포의 크기는 균일하고 구형이어야 합니다.

다음 공식을 사용하여 감염 다중도(MOI) 0.1로 SF nine 세포 배양물에 P one 바이러스 스톡을 감염시킵니다. P one이 감염된 곤충 세포 배양물을 27 °C에서 100 RPM으로 흔들어주며 72시간 동안 배양합니다. 3일 후, 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 배지로부터 세포를 분리함으로써 바이러스를 수확합니다.

실온에서 정제된 바이러스 농축 배지를 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 이 바이러스 스톡은 P2로 표시하며, 예상 바이러스 역가는 2 × 10⁸ PFU/mL입니다. 이 바이러스 스톡은 사용 전까지 4 °C 암소에 보관하고, 생성된 세포 펠렛은 나중에 재조합 바이러스 생산을 확인하기 위해 -20 °C에서 보관합니다.

이 절차를 시작하려면, 100 µg/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin이 첨가된 SF 902 s fm 배지에서 적절한 부피의 SF nine 세포 배양액을 부유 배양합니다. 전체 배양 부피와 플라스크 부피의 비율은 1:5가 되어야 합니다.

부유 배양액을 27°C에서 100 RPM으로 흔들어 주며 세포 밀도가 2×10⁶ cells/mL에 도달할 때까지 배양합니다. SF nine 배양액의 밀도가 2×10⁶ cells/mL가 되면 balo 바이러스 감염 준비가 완료된 것입니다. 배양액에 최종 농도 1%의 fetal bovine serum을 첨가한 후 P2 바이러스 스톡을 접종합니다.

MOI를 1로 설정하기 위해, 감염된 배양물을 27 °C에서 100 RPM으로 흔들어주며 배양합니다. 감염 72시간 후, 실온에서 1000 ×g로 20분간 원심분리하여 recombinant poly histamine tagged lin three를 발현하는 SF nine 세포를 수확합니다. 얻어진 세포 펠릿은 사용 전까지 -20 °C에 보관하거나, 장기 보관 시 -80 °C에 보관합니다. 이 절차는 얼음 위에서 해동하는 것으로 시작합니다.

재조합 kinlin 3를 발현하며 vao 바이러스에 감염된 SF nine의 냉동 펠릿을 용해 버퍼(lysis buffer)로 현탁합니다. 재현탁된 세포를 용해 버퍼와 함께 5~10분 동안 배양한 후, 세포 파쇄를 위해 균질한 현탁액이 될 때까지 볼텍싱(vortex)합니다. 샘플을 얼음 수조에서 초음파 처리(sonicate)합니다.

4°C에서 48,000 ×g로 1시간 동안 원심분리하여 용해물을 청징화합니다. 결과물인 상층액을 4°C에서 용해 버퍼로 미리 평형화시킨 5 mL 부피의 HisTrap 컬럼에 분당 1 mL의 속도로 로딩합니다. 이어지는 단백질 용출, 버퍼 교환 및 단백질 농축 단계는 여기에서 시연하지 않으나, 함께 제공된 논문에 자세히 기술되어 있습니다.

완충액 교환이 완료된 단백질 용액을 얻으면, ACTA FPLC를 사용하여 0.5 mL/min의 속도로 미리 평형화된 5 mL 부피의 HighTrap Heparin HP 컬럼에 적용합니다. 결합된 KINLIN 3은 동일한 완충액 내에서 NaCl 농도를 10 mM/mL의 속도로 증가시키는 선형 기울기를 사용하여 용출합니다. KINLIN 3은 약 0.6 M NaCl에서 용출될 것으로 예상됩니다. 단백질을 농축한 후, 마지막 단계로 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질의 완충액을 교환합니다. 정제된 단백질을 Superdex 200 10/300 GL 컬럼에 적용하고, 0.5 mL/min의 속도로 완충액을 흘려 단백질을 크기별로 정제합니다.

컬럼에서 용출된 단백질은 분획하여 280 nm에서 흡광도를 측정하며 모니터링합니다. 재조합 바이러스 생성의 성공 여부는 SDS-PAGE와 Western 분석을 통해 재조합 Kinlin 3의 존재와 COT-transfection된 Sf9 세포를 평가하여 확인하였으며, 이는 anti-His6 항체를 사용한 6개의 소규모 Sf9 배양액에 대한 대표적인 Western blot 결과에서 확인할 수 있습니다. 바이러스를 증폭하여 대규모 실험에서 Sf9 세포를 감염시킨 후, 각 샘플에서 75 kDa의 His-태그 단백질에 해당하는 명확한 밴드가 관찰되었습니다. 재조합 KINLIN 3는 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 통해 부분적으로 정제되었습니다.

이 그림의 메인 겔 이미지는 BAO 바이러스에 감염된 SF nine 세포에서 발현되어 니켈 친화성 정제로 정제된 재조합 마우스 kinlin 3의 SDS page를 보여줍니다. 흡착된 단백질은 겔 이미지 상단에 표시된 이미다졸 구배를 사용하여 용출되었습니다. MW는 분자량 마커를, LYS는 전세포 용해물을, FT는 통과액을, WI는 1차 세척액을, WII는 2차 세척액을 나타냅니다. 재조합 단백질에 엔지니어링된 His 태그의 존재를 확인하기 위해 용출 분획물을 이용한 웨스턴 블롯 분석도 수행되었습니다.

다음으로, 부분적으로 정제된 KINLIN three를 헤파린 컬럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 거의 균질한 상태까지 추가 정제하였습니다. 이 패널은 280 nanometers에서 관찰된 용출 프로필을 파란색으로 나타내며, 0.05 molar에서 1.0 molar의 sodium chloride 농도 범위의 선형 sodium chloride 구배(녹색으로 표시) 하에서 단일 대칭 피크가 용출되는 것을 보여줍니다. 하단 패널은 분획된 용출액의 SDS page 분석 결과를 보여주며, 75 kilodalton 단백질인 Kinlin three의 존재를 입증합니다.

마지막 단계로, 응집체를 제거하고 균질성을 확보하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 KINLIN three의 순도를 정제하였습니다. 이 대표적인 겔 여과 용출 프로파일은 Tris HCL pH 7.5, 150 millimolar sodium chloride 및 1 millimolar DTT 조건의 20 degrees Celsius에서 SUEx S 200을 사용하여 정제한 Kinlin three의 결과입니다. 용출 부피를 바탕으로 볼 때, KINLIN three는 75 kilodalton 단백질의 예상 이동 경로를 따라 이동하며, 이는 주로 단량체 형태로 존재함을 시사합니다.

다음 그림은 14.5 mg/mL로 고농도 정제된 재조합 kinlin 3(K3로 표기)의 SDS page 결과입니다. 곤충 세포 배양을 통해 고순도의 전장 마우스 kinlin 3를 밀리그램 단위로 생산함으로써, 해당 단백질에 대한 광범위한 구조 연구와 생화학적 분석이 가능해질 것입니다. 또한 본 연구에서는 kinlin 3를 안정화하는 버퍼를 결정하기 위해 thermo fluor 기반의 thermo shift 분석을 수행하였습니다.

KINLIN three를 pH와 염화나트륨 농도의 2차원 스크리닝을 포함하는 다양한 완충액으로 희석하였습니다. 상단 패널은 전이 온도의 3D 히스토그램이며, 하단 패널은 계산된 평균값인 50.4 °C로부터의 전이 온도 변화를 보여줍니다. 막대는 해당 온도 범위에 따라 색상으로 구분되었습니다.

KINLIN three는 pH 7.0에서 9.0 범위 내의 높은 염화나트륨 농도에서 안정적인 것으로 관찰되었으며, 전이 온도는 55 °C로 일정하게 유지되었습니다. 또한 염화나트륨 농도와 관계없이 pH 7.0에서 7.5 범위 내에서 Kinlin three의 전이 온도는 약 55 °C인 것으로 관찰되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면 고순도의 기능성 재조합 kindling을 제조하여 심층적인 생물물리학적 특성 분석 및 추가 연구에 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 유사한 접근 방식을 제조가 어려운 다른 단백질 샘플에도 적용할 수 있으며, 이러한 경우에 본 방법의 활용을 권장합니다.