의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

다음 실험의 전반적인 목표는 다른 발현 숙주에서 생산할 수 없는 밀리그램 단위의 Miran Kinlin 3 및 곤충 세포 배양을 효율적으로 생산하는 것입니다. 이는 KINLIN 3 유전자를 운반하는 재조합 바오 바이러스를 생성하기 위해 조작된 바오 바이러스와 함께 KINLIN 3 전달 벡터인 COT transecting에 의해 달성됩니다. 두 번째 단계로, 바이러스는 곤충 세포 내부에서 증폭되어 향후 단계를 위한 충분한 양의 비리온을 생성합니다.

다음으로, 곤충 세포가 감염되어 빠른 액체 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있도록 많은 양의 Kinlin 3 단백질을 생성합니다. SDS 페이지 분석 및 크기 배제 크로마토그래피를 기반으로 고순도의 기능성 kinlin 3를 밀리그램 수량으로 생산할 수 있음을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 박테리아에서 3가지 발현을 점화하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 황반 바이러스에 감염된 곤충 세포 발현이 재조합 단백질 수율을 10배 증가시킨다는 것입니다.

이 절차를 위한 SF 9 세포는 밀리리터 페니실린당 100마이크로그램 및 밀리리터당 스트렙토마이신당 100마이크로그램이 보충된 SF 902 배지를 사용하여 배양 및 현탁액으로 유지됩니다. 바오 바이러스 생성을 위해서는 세포를 5 곱하기 10에서 5 곱하기 10 곱하기 10 곱하기 6 밀리리터 당 6 세포의 밀도 범위로 배양해야 합니다. 형질주입을 위해 SF 9 세포를 제조하기 위해, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 2 밀리리터의 SF 902 배지에 있는 멸균 6 웰 조직 배양 플레이트의 6 세포를 약 10 번 참조하고, 흄 후드에서 SF 9 세포를 실온에서 약 20분 동안 방치하여 플라스틱 웰의 베이스에 부착되어 단층 재조합 발로 바이러스 생성이 달성됩니다 플라스미드, DNA 및 BMid DNA를 단층 SF 9 배양물에 간이 transection.

발현 벡터 papine 뉴런 회사 T 3은 마우스 KINLIN 3 유전자 회사 T three를 가지고 있습니다. P10의 제어 하에, BAO 바이러스 프로모터는 측면 bao 바이러스 서열을 보유하여 백 미드와의 재결합을 허용하고, 다운스트림 정제를 위한 C 말단 히스 6개의 태그를 암호화하며, 각 형질주입에 대해 1-2마이크로그램의 정제된 MFI T 3를 0.5마이크로그램의 정제된 B 미드 및 100마이크로리터의 SF 902 SFM으로 항생제 없이 만듭니다. 이것은 별도의 튜브에 용액 A를 넣고 항생제없이 100 마이크로 리터의 SF 902 SFM으로 2 개의 시약에 6 마이크로 리터의 세포 효과를 희석합니다.

각 transfection 반응에 대해 많은 transfection이 필요한 경우 액체 취급을 줄이기 위해 여기에서 마스터 믹스를 생성할 수 있습니다. 이것은 용액 B.형질주입당 각각 약 200마이크로리터를 사용하여 두 용액 A와 B를 혼합하고 실온에서 20분 동안 배양하여 20분 후 지질 DNA 복합체를 형성하고, 항생제 없이 SF 902 SFM의 형질주입당 800마이크로리터로 지질 DNA 복합체를 희석합니다. 다음으로, SF nine cell monolayer media를 조심스럽게 흡인하고 SF nine monolayer 위에 AB 용액과 media mixture를 조심스럽게 피펫팅합니다.

형질주입된 세포를 섭씨 27도의 가습된 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위한 가습 환경을 조성합니다. 6개의 우물 접시를 젖은 종이 타월과 함께 플라스틱 조명이 있는 용기에 넣습니다. 다음 날, 항생제 없이 SFM에 SF 900 1ml를 추가로 첨가합니다.각 단층 배양에 섭씨 27도에서 5일 동안 세포를 더 배양합니다.

5일 후, 배양 배지에서 직접 재조합 바오 바이러스를 채취하여 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1000Gs에서 5분 동안 원심분리하여 SF nine 세포 파편을 투명화합니다. 실온에서 결과 슈퍼 이름에 있고 P1로 표시된 바이러스를 클린 튜브 P 1 바이러스 생성으로 전달하면 밀리리터당 7 PFU에 대해 1 곱하기 10의 예상 바이러스 역가를 갖는 것으로 가정 할 수 있습니다.

필요한 경우 플라크 SA를 수행할 수 있지만, 현탁액에서 재조합 발로 바이러스의 증폭에 사용되는 SF 9개 세포가 밀리리터당 6개 세포의 1.4 곱하기 10의 밀도가 되어야 하고 배양액이 전체 플라스크 부피의 20분의 1을 차지해야 할 때까지 P one 바이러스 스톡을 암흑 속에서 섭씨 4도에 보관하십시오. 예를 들어, 2리터 플라스크에 50밀리리터가 들어 있습니다. 일반적으로 최적의 바오 바이러스 증폭 및 단백질 생산을 위해 SF 9 세포는 크기가 균일하고 구형이어야 합니다.

다음 공식을 사용하여 SF nine cell culture를 감염의 다양성 또는 MOI 0.1의 P one 바이러스 스톡으로 감염시킵니다. P one 감염된 곤충 배양을 섭씨 27도에서 100RPM으로 72시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 3일 후, 1000Gs에서 5분 동안 원심분리하여 배지에서 세포를 분리하여 바이러스를 수확합니다.

실온 이동에서 정화된 바이러스는 배지를 깨끗한 튜브로 농축했습니다. 이 바이러스 스톡은 P 2로 표시되며 예상되는 바이러스 역가는 밀리리터당 8 PFU의 10에 2를 곱한 값입니다. 이 바이러스 스톡을 사용할 때까지 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관하고, 생성된 세포 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 저장하여 나중에 재조합 바이러스 생산을 확인합니다.

이 절차를 시작하려면 현탁액 및 SF 902 s fm에서 적절한 양의 SF 9 세포 배양을 성장시킵니다. 밀리리터 페니실린당 100마이크로그램 및 밀리리터 스트렙토마이신당 100마이크로그램이 보충됩니다. 총 배양 부피 대 플라스크 부피의 비율은 1 대 5여야 합니다.

현탁액 배양을 섭씨 27도에서 100RPM으로 흔들면서 2배의 세포 밀도에 도달할 때까지 100rpm으로 배양하여 밀리리터당 6개의 세포에 도달합니다. SF 9 배양액이 밀리리터당 6개 세포에 대해 2배 10의 밀도에 있을 때, 그들은 발로 바이러스에 감염될 준비가 된 것입니다. 배양액에 1%의 소 태아 혈청의 최종 농도를 보충한 후 P 2 바이러스 스톡을 보충합니다.

감염 후 72시간 동안 100RPM으로 진탕하면서 섭씨 27도에서 감염된 배양물을 배양하기 위해 실온에서 20분 동안 1000GS에서 원심분리하여 SF 9 세포를 발현하는 lin 3 태그가 지정된 재조합 폴리 히스타민을 수확합니다. 생성된 세포 펠릿을 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하거나 장기 보관을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이 절차는 얼음 위에서 해동하는 것으로 시작됩니다.

vao 바이러스의 얼어붙은 펠릿은 SF nine을 감염시켜 재조합 kinlin 3을 발현하고 Resus는 펠릿을 lysis buffer로 현탁시킵니다. 5분에서 10분 동안 용해 완충액으로 재현탁 세포를 배양한 후, 추가 세포 파괴를 위해 균질한 소련 현탁액이 달성될 때까지 와류를 일으킵니다. 얼음 수조에서 샘플을 초음파 처리합니다.

48에 분리기에 의하여 lysate를 명백하게 하십시오, 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 000 GS. 생성된 슈퍼 이름을 분당 1밀리리터의 속도로 섭씨 4도에서 용해 버퍼로 사전 평형을 이룬 5ml 부피의 히스트 트랩 컬럼에 로드합니다. 단백질 용출 완충액 교환 및 단백질 농도에 대한 후속 단계는 여기에서 설명되지 않지만 함께 제공되는 원고에 자세히 설명되어 있습니다.

완충액 교환 단백질 용액이 얻어지면 분당 0.5ml의 속도로 ACTA FPLC를 사용하여 사전 평형을 이룬 5ml 용량의 높은 트랩 헤파린 HP 컬럼에 도포합니다. 결합된 KINLIN three는 동일한 완충액에서 선형 염화나트륨 구배를 사용하여 암시되며, 이는 밀리리터 재조합 히스타민 태그당 10밀리몰의 비율로 증가합니다. KINLIN three는 단백질을 농축한 후 약 0.6몰의 염화나트륨에서 용리될 것으로 예상되며, 마지막 단계는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 완충 교환하고 정제된 단백질을 SUEx S 210 30 컬럼에 적용하고 분당 0.5ml의 속도로 컬럼에 완충액을 적용하여 크기에 따라 단백질을 정제하는 것입니다.

컬럼에서 파생된 단백질은 280나노미터에서 흡수제를 사용하여 분획되고 모니터링됩니다. 재조합 바이러스 생성의 성공은 SDS 페이지와 서양 분석에 의한 재조합 Kinlin 3 및 COT TRANSFECTED SF 9 세포의 존재 여부를 항 히스 6 항체를 사용하여 6 개의 작은 규모 SF 9 배양물의 대표적인 서양 혈액에서 볼 수 있듯이, 바이러스가 증폭되어 감염에 사용되면 각 샘플에서 75 kilodalton hiss 태그 단백질에 해당하는 명확한 띠를 볼 수 있음을 검증했다. 대규모 실험에서 9개의 세포를 SF화했습니다. 재조합 KINLIN three는 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었습니다.

이 숫자에 있는 주요 젤 이미지는 젤 이미지의 위에 보이는 ole 기온변화도를 사용하여 단백질을 흡수한 BAO 바이러스에 의하여 감염된 SF 9개의 세포에서 표현된 니켈 친화력에 의하여 순화된 재조합형 쥐 kinlin 3의 SDS 페이지를 보여줍니다. MW는 분자량 마커를 나타내고, LYS는 전체 세포 용해물, FT는 WI를 통한 흐름, WI는 세척 1, WII는 세척 2를 나타냅니다. 또한 용출 분획을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 재조합 단백질에 엔지니어링된 his 태그의 존재를 확인했습니다.

다음으로, 부분적으로 정제된 KINLIN three를 헤파린 컬럼을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 거의 균질성에 가깝게 추가로 정제하였다. 이 패널은 280나노미터에서 관찰된 엘루시안 프로파일을 파란색으로 표시하며, 0.05몰에서 1.0몰의 염화나트륨 농도 범위를 사용하여 녹색으로 표시된 선형 염화나트륨 구배 아래에서 회피하는 단일 대칭 피크를 표시합니다. 하단 패널은 75 킬로달톤 단백질 Kinlin three의 존재를 입증하는 분획 용리의 SDS 페이지 분석 결과를 보여줍니다.

마지막 단계로, 응집체를 제거하고 균질성을 달성하기 위해 크기 배제 크로마토그래피로 KINLIN 3 순도를 연마했습니다. 이 대표적인 겔 여과 elucian 프로파일은 Tris HCL의 SUEx S 200, pH 7.5, 150 밀리몰 염화나트륨 및 섭씨 20도에서 1 밀리몰 DTT를 사용하여 정제 된 Kinlin 3입니다. 용리 부피에 기초하여, KINLIN three는 75 킬로달톤 단백질에 대해 예상대로 이동하며, 이는 주로 단량체임을 시사합니다.

이 다음 그림은 밀리리터당 14.5 밀리그램으로 K 3로 표시된 고농축 정제 재조합 킨린 3의 SDS 페이지의 결과를 보여줍니다. 밀리그램 단위의 고순도 전장 마우스 kinlin three 및 곤충 세포 배양을 통해 단백질의 광범위한 구조 연구 및 생화학적 분석이 가능합니다. 이 연구에서는 KINLIN three에 대해 어떤 완충액이 안정화되고 있는지 확인하기 위해 열 바닥 기반 열 이동 분석도 수행되었습니다.

KINLIN three를 다양한 완충액으로 희석하여 pH 대 염화나트륨 농도의 2차원 스크린을 구성했습니다. 상단 패널은 전이 온도의 3D 히스토그램이고 하단 패널은 계산된 평균 섭씨 50.4도에서 전이 온도의 변화를 보여줍니다. 막대는 해당하는 온도 범위에 따라 색상이 지정됩니다.

KINLIN three는 섭씨 55도의 일관된 전이 온도와 함께 7.0 - 9.0의 PA 범위 내에서 높은 염화나트륨 농도에서 안정적인 것으로 관찰되었습니다. 또한 Kinlin 3의 전이 온도는 7.0에서 7.5의 PA 범위 내에서 약 55 °C임을 관찰했다. 염화나트륨 농도에 관계없이.

이 비디오를 시청한 후에는 고순도 기능성 재조합 킨들링을 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 3개는 심층적인 생물물리학적 특성화 및 추가 조사를 위한 것입니다. 준비하기 어려운 다른 단백질 샘플에도 유사한 접근법을 사용할 수 있으며, 이러한 경우 이를 적용하는 것이 좋습니다.