Name: HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가 +를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포 예 생체 내 공동 문화 시스템. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 HIV-1 감염 CD4+ T 세포에 대한 형질 수지상 세포의 타고난 감지 평가 방법을 배우세요. 공동 배양 시스템을 통해 제1형 인터페론 생성을 측정하여 선천성 면역 반응을 연구합니다.

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우리는 유동 세포 계측법 및 세포 분류 실험을하는 동안 전문가의 기술 지원을 E. Massicotte 및 J. 주님 감사합니다. 또한, 우리는 혈액 샘플을 제공하기위한 IRCM 클리닉 직원과 모든 기부자들에게 감사의 말씀을 전합니다. 말초 혈액 샘플을 연구소 드 Recherches Cliniques 몬트리올 (IRCM)의 연구 윤리 심의위원회의 승인을 연구 프로토콜에서 헬싱키 선언에 따라 동의서를 작성 준 건강한 성인 기증자로부터 얻었다. 다음 시약은 NIH 에이즈 시약 프로그램, 에이즈, NIAID, NIH의 분할을 통해 얻을 수 있었다 박사 더글러스 리치맨에서 MT4 세포; 인적 RIL-2 박사 모리스 Gately, 호프만에서 - 라 로슈 주식 코헨 박사는 인간 Retrovirology에서 캐나다 연구 의장의받는 사람입니다. 이 작품은 코헨 박사에 CIHR (CIHR 111226)에서와 퐁 드 공들인 퀘벡 - 상테 (FRQ-S) 박사 BEGO와 코헨 박사에 에이즈 네트워크에서 보조금에 의해 지원되었다.

일반 공지 사항 심지어 제어 된 세균 감염은 PBMC를 감지 할 수 있으므로, 어떤 항생제없이 배양에서 세포를 유지하는 것이 중요하다. 세균 등의 센싱 요소는 특정 HIV-1 촬상 트리거 그 구별 될 수없는 배경 인터페론 생산을 유도 할 것이다. 또한, 모든 셀들은 통상적으로 마이코 플라스마 오염의 부재에 대해 시험 할 수있다. 가능하면 항상 독소가없는 솔루션을 사용합니다. 상이한 세포의 유세포 특성화 공동 배양에 사용되는 (PBMC를는 올라가고, MT4 및 CD4 + T 세포)는 선택적 단계이지만, 주어진 실험의 적절한 해석에 필요한 유용한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 추천. 감염된 표적 세포의 제조 (1) <ol><li> RPMI 1640 메디칼 인간의 CD4 + T 세포 라인 MT4 유지RPMI-1640은 완전 배지이라 함, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. </li><li> 주요 CD4 + T 세포의 분리. <ol><li> 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. </li><li> 제조자의 권고 다음의 CD4 + T 세포를 음성 선별 키트를 사용하여 CD4 + T 림프구를 분리. </li><li> RPMI-1640 완전 배지에서 48 시간 동안 PHA-L (5 μg의 / ㎖)와 CD4 + T 림프구를 활성화하고 유지하는 세포는 재조합 IL-2 (100 U / ml)로 보충. 차 T 세포 오일 게시물 격리를 감염. </li></ol></li><li> 표적 세포 (MT4 T 세포주 또는 일차 이종 CD4 + T 세포)에 감염. <ol><li> HIV-1 바이러스 T 세포를, 문화를 공동 감염 이틀 전에. 여기에 기술 된 특정 실시 예에서 pNL4.3-GFP_ires_Nef 야생형 (WT) 또는 pNL4.3 GFP_ires_Nef 델타 - VPU (dVpu) 바이러스를 사용 하였다. 이 바이러스 균주는 GRE를 나타냅니다형광 단백질 (GFP)는 VPU를 표현하는 능력 만 다른 동종 전염성 분자 클론을 -marked 갖추고 있습니다. </li><li> 감염 (MOIs)의 다른 다중도를 사용하여 공동 문화에 대한 감염의 비슷한 수준의 문화를 선택합니다. 공동 배양 하루 계측법 감염의 마커로서 유동에 의해 GFP + 세포의 비율을 결정한다. 공동 문화에 대한 20-50% 감염된 세포의 범위 만 문화를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 옵션 단계 : 같은 BST2, 그리고 CD4 같은 관심의 분자 / 리간드의 표면 발현을 평가하는이 시점에서 유세포 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 항 CD4_PerCP / Cy5.5 1 μL 및 안티 BST2_A660 1 μL를 추가 세척 용액 100 ㎕에 0.5 × 106 T 세포를 재현 탁. 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어. 연구가 VPU 매개 BST2 길항 작용의 역할을 평가 대상으로하는 경우, HIV-1 입자를 수행이때 방출 분석은 앞서 설명한 15. 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고)를 감지 2. 분리 및 농축 주 : PBMC를 사용이 감지되면, 채혈 후 반 시간 내에 분리를 시작하고 적시에 그것을 수행. 공동 문화 또는 PDC 농축 즉시 PBMC를 사용합니다. <ol><li> 밀도 구배 원심 분리하여 인간 말초 혈액 단핵 세포를 분리. 선택적 단계 : 그 갓 격리 PBMC를 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함 확인하는 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 염색을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 ㎕에 10 6 된 PBMC를 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루, (골수 세포) 항 CD14-PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL와 (PDC의) 반 ILT7_PE 1 μL (T 세포)의 1 μl를 추가합니다. 품다세척 용액 유동 세포 계측법 세척 전에 4 ° C에서 45 분 동안 튜브,. </li><li> 제조업체의 권장 사항은 다음 PDC 부정적인 선택 키트를 사용하여 올라가고을 풍부. 그것은, 빠른 작동 차가운 세포를 유지하고, 미리 냉각 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 이는 PDC 최대 활성을 보장뿐만 아니라 세포 표면과 비특이적 세포 표지 항체에 캐핑을 방지 할 것이다. <ol><li> 순도, 농축 비율 (예 : ILT7과 BDCA2 등) pDC- 특정 표면 마커의 상대적인 양을 확인하기 위해 갓 격리 올라가고의 다중 매개 변수 유세포 분석을 수행합니다. 세포 표면 염색을 위해, 차단 된 Fc 용액 100 μL에 104 PDCS을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 분 동안 배양한다. 차단 한 후, 안티 CD3_Pacific 블루의 1 μL, 안티 CD14_PE_Texas 레드 1 μL, 안티 BDCA2_APC 4 μL 및 안티 ILT7_PE 1 μl를 추가합니다. (PBS, 5 세척 용액 유동 세포 계측법로 세척하기 전에, 4 ° C에서 45 분 동안 튜브를 품어mM의 EDTA, 5 % FBS). 40 % 순도의 PDC 최소 (출발 물질이 0.4 % PDC가있는 경우, 이는 100 배 농축 동등한 것)를 권장합니다. </li></ol></li></ol> 감염된 CD4 + T 세포와 감지 세포 (PBMC를 전체 또는 농축 올라가고) 3. 공동 문화 <ol><li> 웰당 (106 세포 / ml로 희석) 감염된 T 세포의 30 μL로하여 PBMC를 220 μL 또는 PDCS 220 μL (850,000 세포 / ml로 희석) (100,000 내지 500,000 세포 농도 범위 / ㎖)을 혼합 U-바닥 96 웰 플레이트. <ol><li> 혼자 컨트롤, 판 PBMC를 또는 올라가고 및 T 세포로. RPMI 1640 완전 배지 잘 250 μL의 볼륨을 조절합니다. </li><li> TLR7 및 TLR9 경로의 알려진 효능에 대한 세포 반응을 평가합니다. 이를 위해, PBMC를 접시 220 μL은 U 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 또는 (100,000 내지 500,000 세포 / ml 범위의 농도에서) PDCS 200 μL (850,000 세포 / ㎖로 희석) 및 (TLR7 작용제를 추가 IMIquimod, 최종 농도 2.5 μg의 / ㎖) 또는 TLR9 작용제 (2,216의 CpG ODN-A, 최종 농도 5 μM). 37 ° C에서 배양 한 세포 및 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안 후술 공동 배양 유사한 방식으로이를 처리한다. </li></ol></li><li> 37 ℃에서 동시 배양 물을 인큐베이션하고, 5 % CO 2, 18 ~ 22 시간 동안, 다음 V 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴다. 400 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. <ol><li> 평면 바닥 96 웰 플레이트에 상층 액을 전송합니다. 상청액을 -80 ℃에서 보관하거나 즉시 타입 I IFN 검출을 위해 사용될 수있다. </li><li> 2 % 파라 포름 알데히드의 공 배양 세포를 재현 탁하고 유세포 분석기를 사용하여 분석한다. 크기 및 과립의 차이로 인해, MT4 세포는 앞으로 산란 (FS) 프로파일 대 그들의 측면 산란 (SS)를 기반으로 한 PBMC 또는 올라가고 쉽게 구별된다. 프라이 머리 T 세포를 표적으로 감염된 세포를 사용하는 경우, 이들은 같은 CSFE 같은 임의의 셀 추적 염료 종래의 공동 배양을 염색 할 수있다. </li></ol></li><li> HEK-블루 IFN-α / β 리포터 세포를 사용하여 생체 활성 타입 I IFN의 측정. 주 : 이러한 세포 I은 신호 전달 경로를 완전히 IFN 활성 형을 얻기 위해 인간 및 STAT2 IRF9 유전자 HEK293 세포의 안정한 형질 감염에 의해 생성되었다. 또한 유도 ISG54 프로모터를 β / IFN-α의 제어하에 분비 알칼리 포스 파타 아제 (SEAP) 리포터 유전자를 포함한다. 유형 I IFN 이러한 세포의 자극은 JAK / STAT / ISGF3 경로를 활성화하고 SEAP의 생산을 유도한다. <ol><li> 10 % FBS 보충 된 DMEM에서 HEK-블루 IFN-α / β 세포를 유지한다. 180 μL의 최종 부피, 평평한 바닥 96 웰 플레이트에서 웰 당 50,000 세포의 밀도로 그들을 접시. </li><li> 중복에 각 웰에 공동 배양 상층 액의 20 μl를 추가합니다. 각 판은 내부 표준 컨트롤 세트 (인간 IFNα, 2500 U / ml의 100 U /에서 최종 농도)가 필요합니다. 18 일 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 플레이트-22의 시간. </li><li> 효소의 존재 퍼플 / 블루에 핑크에서 변경 정량화 - 블루 용액을 이용하여 알칼리 포스 파타 아제 활성의 수준을 결정합니다. 제조업체의 권장 사항은 다음 정량화 - 블루를 준비합니다. 평면 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에이 용액 180 μl를 추가합니다. 각 웰 또한 유도 HEK-블루 IFN-α / β 세포 상층 액 20 μL를 추가 한 색상 표준 IFN의 대조군 웰에 개발 될 때까지 37 ° C의 배양기에서 배양 플레이트. </li><li> 620-655 nm에서 분광 광도계를 사용하여 SEAP의 수준을 평가하고 IFN 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽 법에 의해 형-I IFN의 농도를 결정한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

여기에 설명 된 프로토콜은 최근의 보고서 (18)에 기술 된 바와 같이, VPU를 표현하는 능력 만 다를 GFP 표지 된 HIV-1 바이러스 감염된 T 세포의 검출을 측정한다. 그러나, 이들 방법은 쉽게 잠재적 타고난 센싱을 변조 할 수있는 다른 바이러스 유전자 결여 태그없는 바이러스뿐만 아니라, 바이러스의 검출을 연구하기 위해 수정 될 수있다. GFP를 발현하지 않는 사용 바이러스가 감염된 표적 세포의 백분율은 P24 (캡시드)로서, 세포 염색 공동 - 배양 세포 계측법 및 ELISA 또는 P24에 의해 흐르기 전에 다른 수단에 의해 결정되어야하는 경우. 더욱이, 이러한 프로토콜은 가능한 세포주 및 일차 전지를 포함하는 다양한 상이한 타겟 T 세포와 함께 사용될 수있다. HIV-1 센싱을 연구하는 데 이른 방법과 비교할 때,이 논문에서 설명하는 방법은 여러 가지 이점이있다. 무엇보다도 이것은 다수의 그룹 무 세포 HIV-1 (P)에 의해 확립 된기사 유형-I IFN 2,13,14의 가난한 유도한다. 또한, 초기 연구는 생산 타입 I IFN의 양을 정량화하기 이전 IFNα ELISA 기반 방법에 의존했다. 이러한 검출 기술의 한계는 IFNβ와 IFNα의 다른 유형을 바라보며 이전 IFNα ELISA 키트 대부분은 단지 한 종류의 IFNα를 측정한다는 것이다. 설명 리포터 세포주의 사용은 한 번에 측정 할 수있는 인간의 타입 I IFNs의 모든 형태의 생체 활성 농도 등이 제한을 극복한다. 기술은 IFN EL​​ISA 키트의보다 새로운 세대 및 타입 I IFN 다량 쉽게 검출 할 수있는 많은 도너 덜 비싼 매우 민감하다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 쉽게 ELISA를 다른 타입 I IFN 판독 방법에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 중요한 단계 : 모든 세포의 구성 요소 (목표와 이펙터 모두)의 품질을 엄격하게 제어하는​​ 것이 중요하다. 잠재적 인 오염에도 asymptomatic은 모니터링하고 제어 할 필요가있다. 우리는 앞서 언급 한 바와 같이, 무증상 세균 오염을 항생제 제어, 및 마이코 플라스마와 같은 잠재적으로 다른 세포 내 병원균은 HIV-1 감염, 유형 I IFN, 즉 생산 후 관찰 된 것과 유사한 면역 반응을 생성 할 수 있습니다. 또한, 모든 시약은 LPS 또는 다른 잠재적 독소가 없어야합니다. 인간 샘플은 종종 정상 감지에 영향을 미칠 수있는 기본 지속적인 감염에 의해 프라이밍 될 수 있으므로 마찬가지로 한 PBMC 및 PDCS의 모니터링은 또한 중요하다. 우리는 항상 제안 된 음성 대조군, 모의 감염된 세포와 같은 표적 세포의 유무뿐만 아니라 공동의 문화를 포함하는 것이 좋습니다. 감염된 세포의 생존도 유형-I IFN가 사멸 세포 2,14와 공동 배양 다음 생성되지 않기 때문에 적절한 PDC 감지 중요하다. 기술의 하나의 중요한 한계는 갓 절연 일차 전지에 대한 요구이다. 이 절차는 없었다중 이전에 냉동 또는 문화에 보관 된 PBMC를 또는 올라가고를 사용하여 테스트. PBMC를의 분리는 노동 집약적이며,이 세포는 매우 제한된 수명을 가지고있다. 인간의 피와 함께 작업하는 동안 또한, 혈액 매개 병원체에 대한 보호를위한 표준 프로토콜이 사용되어야한다. 갓 고립 된 인간 세포를 포함하는 작업과 관련된 변화의 여러 소스가 종종있다. 이들 중에서 도너 간에서 발생한 도너 이들 세포를 분리하도록 구현 상이한 절차 및 상속 가변성이다. 이 도너 간의 변동을 방지하는 것이 불가능하지만, 이러한 TLR7 및 TLR9 경로의 공지 된 효능에 대한 응답을 측정하는 등의 제안 양성 대조군의 사용은이 실험을위한 중요한 내부 제어를 제공 할 것이다. 우리는 반응 TLR7 경로는 HIV-1 (3)에 대해 적절한 응답을 요구하면서 TLR9 경로의 효능을 강력 응답, 건강 PDC 응답과 상관 될 수 있다는 것을 관찰했다. 2를 기반으로 SS = &quot;jove_content&quot;&gt;. 실험 설계에 필요한 경우 셀 선택 과정 후 항체의 자유 유지하지만, 음성 선별 (PDC 특정 표면 마커의 고갈이 필요한 상황에서 예를 들면), 양성 선별 이상이 바람직하다. 고립 된 올라가고 문화의 급속한 세포 사멸을받을. 이 세포를 필요로 실험은 오랜 기간 동안 배양하기 위해서는, 문화 미디어는 IL-3로 보충 할 수있다. 이러한 사이토 카인은 PDC 증식을 유도하고 이들 세포 사멸을 억제한다 (16). 이 PDC 성숙 또는 분화로 이어질 수 있기 때문에, IL-3 사용은 엄격하게 제어 할 필요가있다. 여기에 설명 된 방법은 타고난 감지시 관련된 초기 단계를 재현하기 위해 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고와 목표 HIV-1에 감염된 세포를 결합합니다. 이 방법은 의심 할 여지없이 EXPLOR에 도움이 될 것입니다HIV 감염과 관련된 전자 초기 선천성 면역 이벤트. 연관된 프로토콜 타입 I IFN 측정 목적이기는하지만 쉽게 감염된 세포의 인식에 PDCS로부터 방출 다른 생체 활성 분자를 측정하기 위해 수정 될 수있다. 다음은 포함 할 수있다 : 유형 III 인터페론 (IFN-λ) 및 케모카인의 CXCL10, 사염화탄소, 및 CCL5 (17) (예 : TNF-α와 IL-6 등) 염증성 사이토 카인.

입력-I ​​IFN 생산 올라가고는 바이러스 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인을 표현하고, 같은 선천성 및 후천성 면역 1 사이의 중요한 연결 역할을합니다. 무 세포 HIV-1의 입자가 어두울 선천 면역에 의해 검출되는 반면, HIV-1 감염된 CD4 + T 세포를 효과적으로 PDCS (2)에 의해 감지된다. 감지기구는 PDC에 의한 바이러스 포집 및 내재화 뒤에 PDC에 감염된 T 세포 및 CD4 분자의 표면에서 바이러스 외피 당 단백질 (gp120의) 사이의 초기 접촉을 필요로한다. TLR7에 의해 전송 된 HIV-1 RNA의 후속 인식에서 MyD88 / IRF7 경로의 활성화를 유발하고 궁극적으로 IFN 생산 3-I를 입력 연결됩니다. 중요한 것은, TLR9에 의해 매개된다 PDCS에서 본 제 2 센싱 경로는, PDC 특정 표면 마커 BDCA2 4, 바이러스 성 당 단백질 gp120의 상호 작용의 저해된다. 5라는 또 다른 PDC 특정 표면 억제 수용체와 (또한 Tetherin 또는 CD317 지정) BST2의 결합에 의해 조절 될 수있다. BST2은 PDCS 및 일부 암 세포의 표면에서 높은 수준으로 발현하지만, 이러한 B 세포, 대 식세포 및 T 세포와 같은 다른 세포 유형에서 상대적으로 낮은 수준이다. 중요한 BST2은 형질 전환 된 세포주의 수뿐만 아니라 인간 및 뮤린 기원 (6)의 일차 세포 배양 물에서 타입 I IFN에 의해 유도 될 수있다. 그 외에도 면역 조절 기능에서, BST2 최근에 HIV-1의 방출을 억제하는 것으로 발견되었고, 다른 하나는 감염된 세포 표면 (7) 상에 가교 미성숙 바이러스 입자로 바이러스 입자를 포위. HIV-1의 경우에, 인코딩 된 부속 바이러스 단백질 U (VPU)의 BST2 길항제로서 작용하는 것으로 하였다. 그것은 VPU는, HIV-1 감염 세포의 세포 표면에서의 테더의 사이트를 BST2 downregulates 것으로 여겨진다활성을 보내고,이 개념은 8,9 도전 하였지만, 결과적으로 바이러스의 분리를 강화하고 7 퍼졌다. VPU, 다수의 부재하에 완전한 형태 및 성숙한 자손 HIV-1의 입자가 세포 표면에서 유지된다. 이 닿는 입자가 면역 감지 효과적인 목표를 나타낼 수 있는지 여전히 의문으로 남아있다. 또한,이 표면은 VPU에게 BST2 수준을 변조함으로써 PDCS에서 타입 I IFN 생산 dysregulate 수 있는지 불명확하다. HIV-1 센싱을 평가하기위한 초기 연구는 일반적으로 타입 I IFN의 불량한 3,10-12 유도제 간주되는 무 세포 HIV-1 입자를 사용하여 수행 하였다. 최근의 연구는 PBMC를하고 올라가고 효율적으로 HIV에 감염된 CD4 + T 림프구 2,13,14를 감지하는 것이 좋습니다 감안할 때, 우리는 여기에 체외에서 HIV-1에 감염된 세포의 인식에 따라 올라가고에 의해 트리거 타고난 반응을 측정하는 간단한 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>MT4 세포</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>120</td><td>이 시약은 NIH AIDS 시약 프로그램, AIDS, NIAID, NIH : MT-4를 통해 Douglas Richman 박사로부터 얻었습니다.</td></tr><tr><td>HEK-Blu IFN-&alpha;/&beta; 리포터 셀&nbsp;</td><td>인비보젠</td><td>HKB-IFNAB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll-P&acirc; que 플러스</td><td>Myltenyi</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD4+ T 세포 분리 키트 II</td><td>Myltenyi</td><td>130-091-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>다이아몬드 플라스마사이토이드 수지상 세포 분리 키트 II&nbsp;</td><td>밀테니</td><td>130-097-240</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>시그마-알드리치</td><td>O2769</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Human rIL-2</td><td>NIH AIDS Reagent Program</td><td>136</td><td>이 시약은 NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 from Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc.를 통해 획득되었습니다.</td></tr><tr><td>이미퀴모드</td><td>인비보젠</td><td>TLRL-IMQS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ODN 2216 CpG-A</td><td>하이컬트 바이오텍</td><td>HC4037</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>인간 IFN&알파;</td><td>PBL 인터페론 소스</td><td>11100-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>콴티-블루&nbsp;</td><td>시다레인</td><td>REP-QB2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>유세포분석(항체/시약)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fc 차단 용액 (아래 구성):</td><td></td><td></td><td>참고: 세척 용액 (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)에서 제조하십시오</td></tr><tr><td>. 10% 염소 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% 토끼 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 9133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% 마우스 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 5909</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2.5 mg/ml 인간 IgG</td><td>시그마-알드리치</td><td>I 4506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 CD3_Pacific 블루</td><td>바이오 레전</td>드 <td>300417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 CD14_PE-TxRed</td><td>라이프 기술</td><td>MHCD1417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BDCA2_APC 방지</td><td>Myltenyi</td><td>130-090-905</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 ILT7_PE</td><td>바이오 레전</td>드 <td>326408</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 CD4_PerCP/Cy5.5</td><td>바이오레전</td><td>드 317427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>안티-BST2_Alexa 660</td><td>eBioscience</td><td>50-3179</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P 6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>셀 스트레이너</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>시안 ADP 기기&nbsp;</td><td>벡크만 쿨터</td><td>CY20030</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

hiv-1 감염 cd4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 t 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 타고난 감지 형질 수지상 세포 (올라가고)에 감염된 CD4 + T 세포의 직접 접촉을 필요로한다. 이 과정을 연구하기 위해, 여기에 설명 된 프로토콜 T 세포주 (MT4) 또는 이종 주요 CD4 + T 세포 중의 감염을 감지하기 위해 신선하게 절연 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 형질 수지상 세포 (PDCS)를 사용한다. 적절한 감지를 보장하기 위해, PBMC는 혈액 수집 및 사용 감염된 T 세포의 최적 비율 직후 격리되어 필수적이다. 또한, 다중 파라미터 유세포 염색 PBMC 시료 생리 비율로 다른 세포 계통을 포함하는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 컨트롤의 개수는 생존 및 PDCS의 기능을 평가하기 위해 포함될 수있다. 이들은 수신자 같은 수용체의 공지 된 작용제 (TLR) 경로로 세포 반응을 평가하고 spon의 부족을 확인, 특정 표면 마커의 존재를 포함taneous 타입 I 인터페론 (IFN) 생산. 이 시스템에서 갓 격리 PBMC를 또는 올라가고은 18 ~ 22 시간 동안 96 웰 플레이트에서 HIV-1에 감염된 세포와 공동 배양. 이러한 공 배양 후 상청액으로부터 HEK-블루 IFN-α / β 세포에서 ISGF3 경로의 활성화를 모니터링함으로써 생리 활성의 타입 I IFNs의 수준을 결정하기 위해 사용된다. 종래와 공 배양 조건에서, 표적 세포는 감염된 세포의 백분율, 특정 표면 마커의 수준 및 감염된 세포의 차동 사멸을 포함한 다수의 파라미터를 측정하기 위해 유세포 분석을 흐르도록 실시 할 수있다. 이러한 프로토콜은 초기 타입 I IFN 생산을 수행하기 위하여 개발되었다하더라도, 이들은 잠재적 PDCS로부터 방출 다른 imuno - 조절 성 분자를 연구 및 HIV-1 타고난 센싱을 규제 분자 메커니즘에 추가 통찰력을 얻기 위해 사용될 수있다.

도 1에 기술 된 공 배양 시스템은 HIV-1의 감지 타고난 대조 시험을 허용한다. 때문에 일차 세포의 가변 특성으로 인해, 이는 골수와 T 세포 (각각 CD14 + 및 CD3 +)의 정상 비율은도 2a에 도시 된 예에서와 같이, 관찰하는 것이 중요하다. 또한, (비 - 활성화 T 세포에 비해 더 높은 FS CD3 레벨) 활성화 T 세포의 낮은 숫자는 갓 격리 된 PBMC 배양 물에서 바람직하다. 여러 세포 유형 사이의 비율이 비정상적인 PBMC를 인해 지속적인 감염의 결과로서 이미 활성화 된 표현형 종종 시험관 가능성에 적절한 선천성 면역 반응을 마운팅 불가능하다. 가장 중요하게는, PDCS의 상대적인 비율은도 2b에 도시 된 바와 같이 평가 될 필요가있다. 이 비율이 0.2 ~ 1.2 %에 따라 다를 수 있지만, 이상 감지 표현형은 extre 모두 관찰된다이 범위의 행. 그림 2B (92 %, 72 %)에서에서 두 가지 예에서 볼 수 있듯이 부정적인 선택을 사용하는 PDC의 농축은 종종 50~95% PDC의 순도를 얻을 수 있습니다. 전체 실험의 전형적인 예는도 3 및도 4에 도시된다. 이 예에서, MT4 세포를 공 배양 (도 3a)의 시간에 30 %의 감염을 달성 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 델타 VPU에 감염되었다. 전술 한 바와 같이, 오직 WT 바이러스 감염 표면 BST2의 상당한 하향 조절 (도 3b)였다. 때문에 크기와 입도 (granularity)에서의 차이로, MT4 세포는 유동 세포 계측법 (그림 4A)에 의해 PBMC를 쉽게 구별 할 수 있습니다. 공동 문화 배양 한 후, 타입 I IFN (그림 4B)의 HIV-1에 감염된 세포 출시 상당한 양의 접촉 알려진 TLR7이나 TLR9 작용제와 PBMC를 접촉 만 PBMC를. 어떤 IFN는 PBMC를 공동 CU에서, 혼자 PBMC를 검출되지 않았다모의에 감염된 MT4 세포와 ltured, 또는 단독으로 감염된 MT4 세포 (그림 4B)에서. 여기에 제시된 실시 예에서, 한 PBMC에 의한 HIV-1 감염 MT4 세포의 타고난 감지 크게 VPU의 존재 하에서 감소되는 것으로 밝혀졌다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1 :. 실험 설계의 개요도 SUP : 상층 액을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2 : 갓 격리 된 PBMC와 ENR의 표현형 특성iched PDCS. (A) 골수 세포와 건강한 공여자로부터 단리 된 PBMC에서 관찰 된 T 세포의 정규 분포 (골수 세포의 백분율은 55~65% 사이 % 및 T 세포 사이의 범위 10-20한다). PBMC를 시료 표면의 CD14 (골수 계통 마커) 및 CD3 (T 세포 마커)를 인식 형광 - 복합 항체를 사용하여 염색 하였다. (B) 올라가고의 표현형 특성. 농축 PDCS에 앞서 PBMC를 내의 셀들의 총 수 (도시 예에서는 0.99 %)의 % 0.2에서 1.2 사이 사이에 나타낸다. 이들 세포를 세포 표면에 존재하는 이러한 BDCA2 ILT7 및 특정 마커의 발현에 기초하여 식별 될 수있다. 음성 선별 크게 PDCS 수가 풍부 및 CD14 + 골수 세포 (보충 보인 두 예에서 92 % 및 72 %에 도달하는)와 같은 잠재적으로 해로운 오염을 제거하는데 사용될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">CLI</a>큰 이미지를 보려면 여기를 CK. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> 도 3 :. pNL4.3-GFP_ires_Nef WT 또는 dVpu 감염 MT4 감염된 배양 물 내의 세포의 HIV-1 감염 대상 MT4 세포의 특성 (A) 백분율 GFP 양성 세포의 백분율에 의해 측정. 감염된 세포에서 (B) BST2의 세포 표면 발현은 표면 염색 후에 평가 하였다. 회색 가득 히스토그램 미리 면역 된 토끼 혈청 (흠 제어)로 염색 모의 - 감염된 세포를 나타내고; 나머지 히스토그램은 항 -Bst2 클론 토끼 혈청으로 염색 된 세포를 나타냅니다. 실선과 히스토그램 제어 GFP 네거티브 (NEG) 세포를 나타냅니다; 점선 히스토그램 감염된 GFP 양성 (POS) 셀들에 대응한다. 독감 평균orescence 강도 (MFI) 값을 각 샘플에 대해 표시된다. 유동 세포 계측법 그림 2에 설명 된대로 수행하고 분석 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> 도 4 :. 갓 격리 된 PBMC 감염된 MT4 T 세포의 공동 배양 된 PBMC와 MT4 T 세포 사이의 단독 MT4 T 세포 관찰 FS / SS 프로필, 단독으로 한 PBMC 또는 공동 배양 유세포의 (A)와 비교. 때문에 크기와 입도 차이에 따라, MT4 T​​ 세포는 유세포 분석기를 이용하여 공동 배양 물에서 PBMCs를 쉽게 구별 할 수있다. (B) TLR와 PBMC를 자극 후에 릴리스 타입 I IFN의 양의 대표적인7 TLR9 작용제 (전), 또는 모의 또는 pNL4.3-GFP_ires_Nef (WT) 또는 dVpu에 감염 표시된 MT4 세포와 공동 배양 후. 원시 데이터는 OD 650 값을 표시하고 해당 converseion는. / ㎖ U로 표시 IFN 농도-I를 입력 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

다음 절차의 전반적인 목적은 plasmacytoid dendritic cells(PDCs)에 의한 HIV-1 감염 CD4+ T 세포의 선천적 감지 능력을 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 CD4+ T 세포를 HIV-1로 감염시킵니다. 두 번째 단계에서는 감염된 T 세포를 PDCs와 공동 배양합니다.18~22시간 후, PDC 제1형 인터페론 생성량을 정량화하기 위해 공동 배양액의 상층액을 회수합니다. 최종적으로, 제1형 인터페론의 생성량은 CD4 양성 T세포의 HIV-1 감염에 대한 인간 혈액 유래 분리 PDC의 민감도를 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 plasmacytoid lytic cells에 의한 HIV-1 감염 CD4 T세포 인식과 같이, 병원체 인식 과정에서 초기 선천성 면역 반응을 조절하는 바이러스 및 숙주 인자를 연구하는 데 유용할 수 있습니다.이 프로토콜들은 1형 인터페론 측정을 목표로 하지만, 감염된 T 세포를 인식했을 때 PC에서 방출되는 인터페론 감마, TNF 알파 또는 카인(kins)과 같은 다른 생성 활성 분자들을 검출하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 일차 CD4 양성 T 세포를 감염시키기 위해, 먼저 인간 말초혈액에서 분리한 CD4 양성 T 세포를 PHAL로 48시간 동안 활성화합니다. 감염 전 최소 3일 동안 재조합 IL-2가 보충된 완전 배지에서 세포를 유지합니다. 그 후, 생물안전 3등급(BSL-3) 실험실에서 다양한 감염 다중도(MOI)를 사용하여 T 세포를 HIV-1 바이러스로 감염시킨 뒤, 감염 2일 후에 분석을 진행합니다.세포 배양물의 GFP BST 2 및 CD 4 발현 정도를 평가합니다. 생물안전등급 2(biosafety level two) 시설에서 수행하는 공동 배양 실험에는 GFP 양성률이 20~50%인 배양물만 사용하십시오. 다음으로, 혈액 채취 후 30분 이내에 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 말초 혈액 샘플에서 단핵 세포를 분리합니다.그런 다음 적절한 항체로 세포를 염색하여 원하는 세포 계통이 생리학적 비율로 분리되었는지 확인합니다. 세포를 차갑게 유지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 제조사의 권장 사항에 따라 PDC 음성 선택 키트를 사용하여 분리된 PBMC 내에서 PDC를 농축하십시오.그 다음, 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 농축된 시료의 순도 백분율과 I LT7 및 BDCA2와 같은 PDC 특이적 표면 마커의 상대적 양을 확인합니다. 농축된 시료에는 최소 40%의 PDC가 포함되어야 합니다. 이제 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰당 220 µL의 센싱 세포(sensing cells)와 30 µL의 감염된 T세포를 함께 공동 배양합니다. 센싱 세포 또는 표적 세포만 포함된 대조군 웰을 포함시키며, 완전 배지를 사용하여 이 웰들의 최종 부피를 250 µL로 맞춥니다. 알려진 톨 유사 수용체(toll-like receptor) 작용제에 대한 PDC의 반응을 평가하려면, 해당 웰에 TLR7 또는 TLR9 작용제를 첨가하고 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 18~22시간 동안 배양합니다.공동 배양 종료 후, 세포를 96-well V-bottom 플레이트로 옮기고 실온에서 400 Gs로 5분간 원심 분리합니다. 그다음 상층액을 96-well flat-bottom 플레이트로 옮깁니다. 세포 펠릿을 2% paraformaldehyde에 재현탁하고, 전방 산란(forward scatter) 대 측방 산란(side scatter) 도표에서 세포 크기와 과립도를 이용하여 유세포 분석기로 분석하여 세포를 구분합니다.hcbl 인터페론 알파 베타 리포터 세포를 사용하여 생물학적 활성 제1형 인터페론을 측정하려면, 먼저 96-웰 평底 플레이트에 리포터 세포를 웰당 50,000 cells의 밀도로 최종 부피 180 µL가 되도록 분주합니다. 그다음, 방금 수확한 공동 배양 상청액 20 µL를 각 웰에 듀플리케이트로 첨가하고 내부 표준 컨트롤 세트를 포함시킨 후, 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 18~22시간 동안 배양합니다. 리포터 세포에서 방출된 알칼리성 인산분해효소의 수치를 결정하기 위해, 새로운 평底 플레이트의 각 웰에 180 µL의 quantum blue 용액을 넣습니다. 그런 다음, 유도된 HEC PLU 인터페론 알파 베타 세포 상청액 20 µL를 각 웰에 첨가하고, 표준 인터페론 컨트롤 웰에 색상이 나타날 때까지 플레이트를 37 °C에서 배양합니다.퀀텀 블루 용액은 효소가 존재할 때 분홍색에서 보라색 푸른색으로 변합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 620에서 655 nanometers 범위에서 분비된 알칼리성 인산분해효소의 수치를 평가하고, 인터페론 표준 곡선의 선형 부분으로부터 외삽하여 제1형 인터페론의 농도를 결정합니다. 일차 세포의 가변적인 특성으로 인해, 이 대표 도트 플롯에 표시된 것과 같이 CD 14 양성 골수성 세포와 CD 3 양성 T 세포의 정상적인 비율이 관찰되는 것이 중요합니다.또한, 높은 전방 산란광과 CD3 수준으로 식별되는 활성화된 T 세포는 신선하게 분리된 PBMC 배양물에서 적은 수만 존재하는 것이 바람직합니다. 가장 중요한 점은 PDC의 상대적 비율을 결정해야 한다는 것이며, 이 비율은 0.2에서 1.2%까지 다양할 수 있습니다. 이 범위의 양극단 모두에서 비정상적인 감지 표현형이 관찰됩니다. 음성 선택을 이용한 PDC 농축은 서로 다른 공여자로부터 얻은 이 두 개의 대표적인 도트 플롯에서 볼 수 있듯이, 대개 50에서 95%의 PDC 순도를 나타냅니다.전체 실험의 전형적인 예시가 다음의 몇 가지 그림에 제시되어 있습니다. 본 대표 연구에서는 공동 배양 시점에 30%의 감염률을 달성하기 위해 MT-4 세포에 P and l 4.3 GFP, IRIS NF 야생형 또는 delta VPU를 감염시켰습니다.이전에 설명한 바와 같이, 야생형 바이러스에 감염된 경우에만 표면 BST2의 유의미한 하향 조절이 나타났습니다. MT-4 세포는 크기와 과립성의 차이로 인해, 공동 배양 후 유세포 분석법을 통해 pBMC와 쉽게 구별될 수 있습니다. 알려진 TLR7 또는 TLR9 작용제가 존재할 때의 pBMC, 또는 HIV-1 감염 세포와 접촉한 pBMC에서는 상당한 양의 제1형 인터페론이 방출되었습니다. pBMC 단독, 모의 감염된 MT-4 세포와의 pBMC 공동 배양, 또는 감염된 MT-4 세포 단독으로는 인터페론이 검출되지 않았습니다. 여기에 제시된 예시에서, pBMC에 의한 HIV-1 감염 MT-4 세포의 선천적 감지는 Vpu가 존재할 때 유의미하게 감소하는 것으로 나타났습니다.이 절차를 수행할 때는 모든 오염원을 차단하는 것이 중요합니다. 항상 엔도톡신 프리(endotoxin free) 용액을 사용하십시오. 마이코플라스마 오염 여부를 정기적으로 확인하고, 조절된 세균 감염조차 PBM에 의해 감지될 수 있으므로 항생제 없이 세포를 배양하십시오.PC는 매우 취약한 세포라는 점을 잊지 마십시오. PC는 수명이 제한적이며, 절차가 적시에 수행되지 않을 경우 반응성이 영향을 받을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

HIV에 감염된 세포 자연 킬러 세포 lytic 응답을 측정하기 위해 세포 독성의 assays는 대상 세포의 순도에 의해 제한됩니다. 우리는 여기서 CD4 아래로 조절하는 HIV - 1의 능력을 활용하여 HIV - 1 감염 기본 T - 세포 폭발의 고도 정화 인구의 절연을 보여줍니다.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

이 비디오는 HIV-1에 감염된 CD4+ T 세포에 의한 형질세포(plasmacytoid dendritic cell)의 자극 후 방출되는 I형 인터페론(IFN)을 정량화하기 위해 HEK-Blue 인터페론-α/β 리포터 세포를 사용하여 분비된 배아 알칼리 인산가수분해효소 분석을 보여줍니다.

Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay를 사용한 Bioactive Type-I 인터페론의 정량화

이 동영상은 면역조절 약리제를 사용하여 수지상 세포(DC)를 허용 DC(TolDC)로 변환하는 방법을 보여줍니다. 이 변환은 CD4+ T 세포에 대한 면역억제 효과를 통해 TolDC 기능을 평가하여 확인됩니다.

수지상 세포와 CD4+ T 세포 사이의 상호 작용에 대한 면역조절 약리학적 제제의 효과

우리는 HIV 특정 CD4 T 세포에 의한 사이토 카인 분비의 조절에 면역 경로의 역할을 조사하기 위해 시험 관내 분석을 개발 하였다.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

항체 중화를 평가하고 효과적인 백신 면역원의 설계를 안내하려면 바이러스 표면 항원 구조를 이해하는 것이 필요합니다. 여기에서는 특정 anti-Env 항체에 의해 transfection된 세포의 표면에서 발현되는 trimeric HIV-1 Env의 인식에 대한 연구를 가능하게 하는 세포 기반 ELISA 분석에 대해 설명합니다.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

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여기에서는 인간 항응고 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포에서 자기 비드 분리에 의해 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 5일 동안 배양한 후 인간 단핵구는 미성숙 수지상 세포로 분화되고 비임상 환경에서 실험 절차를 수행할 준비가 됩니다.

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여기에서는 특히 HIV-1 감염에 중점을 두고 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(UPR) 활성화를 측정하기 위한 몇 가지 확립된 방법에 대해 설명합니다. 이 기사에서는 또한 ER 스트레스/UPR이 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에 미치는 영향을 조사하기 위한 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

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암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

학습하세요 HIV-1 감염 CD4+ T 세포에 대한 형질 수지상 세포의 타고난 감지 평가 방법을 배우세요. 공동 배양 시스템을 통해 제1형 인터페론 생성을 측정하여 선천성 면역 반응을 연구합니다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가

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