반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

다음 실험의 전반적인 목표는 간접 면역형광법을 사용하여 항핵항체를 스크리닝하는 것입니다. 이는 환자의 혈청을 HEP-2 기질 슬라이드와 함께 배양하여 수행합니다. 결합하지 않은 환자 혈청을 세척하여 제거한 후, 결합된 자가항체를 특이적 플루오레세인 표지 컨쥬게이트와 함께 배양하고, 결합하지 않은 시약을 세척하여 제거합니다.

형광 현미경으로 관찰했을 때, 자가항체 양성 샘플은 자가항체가 결합한 세포 또는 핵 부위에서 항원의 존재를 나타내는 형광 패턴의 사과색 녹색 형광을 나타냅니다. 최종적으로, arna의 존재는 결합 조직 질환의 진단을 돕는 데 사용될 수 있습니다. 고체상 Eliza와 같은 다른 방법과 비교하여 간접 면역형광법의 주요 장점은 Hep two 세포 기질이 천연 구성으로 발현된 100가지 이상의 항원을 포함하고 있다는 점입니다.

이를 통해 거의 모든 임상적으로 유의미한 O형 항체를 식별할 수 있는데, 이는 간접 면역형광법이 매우 전문적인 기술이기 때문에 고형상(solid face) 기술로는 불가능합니다. 이 방법이 처음인 개인은 슬라이드 처리 절차에 숙달되기까지 시간과 연습이 필요합니다. 현미경 이미지를 해석하고 관련 패턴을 식별하는 방법을 배우는 것 또한 숙달하는 데 시간이 걸리는 기술입니다.

적절한 시약과 도구를 사용하면 결과의 일관성이 높아지고 해석이 더 쉬워집니다. 시연은 면역형광 분석 개발 실험실(Immunofluorescent Asay Development Laboratory)의 기술자인 Cassandra Bryant가 진행하겠습니다. 시약을 포장에서 꺼내 각각 실온에 도달하게 둔 다음, 설명서의 지침에 따라 시약을 준비하고 환자 혈청을 희석하십시오. 슬라이드에는 바코드가 부착되어 있어 자동화 시스템에 쉽게 통합할 수 있습니다.

본 절차는 수동 슬라이드 처리 과정을 보여줍니다. 다만, 처리량이 많은 실험실에서는 바코드 스캔 기능이 포함된 자동 슬라이드 처리 장비를 사용할 수 있습니다. Inova 장비들은 중앙 집중식 지능형 네트워크를 통해 연결되어 워크플로우 결과 및 보고에 대한 제어 기능을 제공합니다.

IFA를 위해 사용합니다. 이를 통해 처리 과정에서 환자 식별을 확실히 하고 전사 및 관련 오류를 제거할 수 있습니다. 적절한 슬라이드 위에 양성 대조군 한 방울과 음성 대조군 한 방울을 분주합니다.

나머지 웰에 희석된 환자 혈청 20 to 25 µL를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드는 한 번에 하나씩 처리합니다. 바닥에 젖은 종이 타월을 깐 염색 용기에 슬라이드를 넣고, 용기를 덮은 후 30분 동안 슬라이드를 배양합니다.

습윤 상태를 유지하면 기질이 건조되는 것을 방지하여 인위적인 염색 결과가 나타나는 것을 막을 수 있습니다. 이 배양 기간 동안 환자 혈청 내의 항핵항체가 각 웰에 고정된 세포의 항원에 결합하게 됩니다. 배양 기간이 끝나면 기질이 손상되지 않도록 세척 버퍼를 완만하게 흘려주어 혈청을 씻어내십시오.

스트림이 기질에 직접 닿지 않도록 슬라이드를 약간 기울이십시오. 이렇게 슬라이드를 배치하면 웰 간의 시료 교차 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다. 과잉 세척 완충액을 털어낸 후, 세척 완충액이 담긴 Copeland jar에 슬라이드를 넣으십시오.

세척 단계의 배양 시간은 약 5분이어야 합니다. 세척 완충액에서 슬라이드를 꺼내 가볍게 톡톡 쳐줍니다. 과량의 세척 완충액을 제거한 후, 각 웰에 형광 접합체 한 방울을 가합니다.

NA 테스트를 위해서는 IgG FC 특이적 접합체를 사용하는 것이 권장됩니다. 습윤 용기 내에서 슬라이드를 30분 동안 배양하고, 염색 커버를 반드시 다시 덮어주십시오. 접합체는 빛에 민감하므로, 커버를 통해 슬라이드가 빛에 노출되는 것을 방지해야 합니다.

이 배양 기간 동안, 접합물은 세포 항원에 결합한 환자의 항핵항체에 결합하게 됩니다. 이러한 접합물 결합의 결과로 배양 후 웰(well)에서 형광이 나타나게 됩니다. 세척 완충액으로 슬라이드를 세척하십시오.

이전과 마찬가지로 커버 슬립을 페이퍼 타월 위에 놓고, 커버 슬립의 아래쪽 가장자리를 따라 마운팅 용액을 연속적인 선 모양으로 도포합니다. 세척 버퍼에서 각 슬라이드를 꺼내어 가볍게 톡톡 칩니다. 과량의 세척 버퍼를 제거하기 위해 슬라이드의 하단 가장자리를 커버 슬립의 가장자리에 접촉시킵니다.

커버슬립 위의 봉입제가 슬라이드의 상단 가장자리까지 흐르도록 하여 기포가 생기지 않게 슬라이드를 커버슬립 위에 천천히 내립니다. 적절한 양의 봉입제를 사용하는 기술은 숙련이 필요합니다. 암실에 위치한 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하며, 20x 또는 25x 대물렌즈를 사용하여 웰 전체를 스캔해야 합니다. 세포 분포와 형광의 균일성을 평가하려면 40x 대물렌즈로 전환하십시오.

양성 여부와 패턴에 관한 최종 해석을 내리기 위해 양성 및 음성 대조군을 확인하십시오. 음성 대조군은 완전히 어둡게 나타나지 않을 수 있지만, 종종 낮은 수준의 비특이적 형광을 보입니다. 양성 대조군은 핵에서 밝은 사과색 녹색 형광을 나타냅니다.

양성 반응은 1+에서 4+까지의 반응성 등급 척도를 사용하여 등급을 매길 수 있습니다. 수동 판독 외에도, 슬라이드를 자동 형광 현미경에 적재하여 스캔할 수 있습니다. 암실은 필요하지 않습니다.

적절한 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성한 후, 기기는 각 웰 내 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한, Nova view는 형광 강도를 측정하여 결과를 양성 또는 음성으로 분류하고, 양성 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 작업자는 고해상도 컴퓨터 모니터로 이미지를 확인하며, 이를 통해 Nova View의 최종 해석, 수정 및 확정을 수행합니다.

확정된 결과에 대해 결과 보고서를 생성할 수 있습니다. 핵 내 구성 단백질 구조에 대한 자가항체 결합은 균질, 점상, 중심체, 인, 핵 점의 다섯 가지 주요 핵 패턴을 나타냅니다. 여기에서 보여주는 것과 같은 균질 패턴을 식별하려면, 유사분열 세포 또는 분열 중인 세포를 확인하십시오.

분열기 세포는 휴지기 세포보다 더 뚜렷하게 나타나는 경우가 많은, 균일하고 진한 형광을 보입니다. 휴지기 세포의 핵은 확산성 염색을 통해 균일하게 보여야 합니다. 이러한 특징적인 패턴은 이중 가닥 DNA에 대한 자가항체의 결과일 가능성이 가장 높습니다.

반점 패턴의 주요 특징은 중기 분열 세포가 동전 투입구 모양으로 나타난다는 점입니다. 이러한 세포의 염색체 영역은 음성입니다. 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 반점 패턴을 보입니다.

반점상 형광 패턴(speckling)은 거친 형태 또는 미세한 형태로 정의할 수 있습니다. 거친 반점상 패턴은 SM 및 RNP에 대한 자가항체의 결과입니다. 미세한 반점상 패턴은 RNA polymerase뿐만 아니라 S-S-A-S-S-B에 대한 자가항체로 인해 나타날 수 있습니다.

DFS 패턴은 조밀하고 미세한 점상(dense, fine speckled)으로 정의되며, DFS 70에 대한 자가항체를 나타냅니다. 분열기 세포는 점상 염색을 보이는 반면, 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 미세한 점상 패턴을 보입니다. 이러한 경우, DFS 70 자가항체는 결합 조직 질환 환자보다 건강한 개인에게서 더 흔하게 나타나므로 확인 시험을 수행해야 합니다.

Centromere 패턴을 확인하기 위해 웰을 스캔하여 유사분열 중이거나 분열 중인 세포를 식별합니다. 분열 중인 세포는 서로 밀접하게 연관된 수많은 개별 반점들을 나타내며, 이는 흔히 중기 바(metaphase bar)라고 불립니다. 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 분포하는 약 40~60개의 개별 반점을 보여줍니다.

중심절 패턴은 인 패턴과 함께 중심절 단백질에 대한 자가항체와 관련이 있습니다. 분열기 세포의 염색체 부위 염색 양상은 다양하게 나타납니다. 인 패턴은 핵의 균질한 또는 반점형 염색과 더불어, 휴지기 세포핵의 핵질에서 나타나는 약한 반점형 또는 균질한 염색과 관련이 있습니다.

이 패턴은 RNA 중합효소 III, 피브릴린 및 PM-SCL 항체에 대한 자가항체와 관련이 있습니다. 핵 점 패턴(nuclear dot pattern)은 중기 및 분열기 세포에서는 음성으로 나타나며, 휴지기 세포 핵에서는 소수의 뚜렷한 점들이 관찰되는 것과 관련이 있습니다. 이러한 특징적인 패턴은 흔히 SP 100, PML 또는 P 80 colan에 대한 자가항체의 결과로 나타납니다.

이 항체들은 원발성 담즙성 간경변증 및 자가면역성 간염과 관련이 있습니다. 제시된 이미지에서 핵 점 패턴은 미토콘드리아 항원에 대한 자가항체로 인해 세포질 염색을 나타냅니다. 항핵항체 검출 및 패턴 인식은 환자 진단을 돕는 중요한 도구로 활용됩니다.

다양한 패턴의 중요성을 이해함으로써 임상의와 실험실 담당자는 적절한 후속 검사를 수행할 수 있습니다. 항핵항체 패턴을 정확하게 식별하기 위해 가장 중요한 요소는 고품질의 세포 기질을 선택하고 일관되게 우수한 기술로 슬라이드를 처리하는 것입니다. 슬라이드 판독은 전통적으로 암실에서 형광 현미경을 통해 수행되며, 세포 주기 및 세포 형태의 맥락에서 다양한 패턴에 익숙한 숙련된 기술자에 의해 이루어집니다.

최근 몇 년 동안 슬라이드의 자동 판독을 위한 디지털 이미징 시스템이 개발되었으며, 이러한 장비들은 워크플로우를 자동화하고 판독 및 해석의 일관성을 높여줍니다. 또한, 바코드가 부착된 슬라이드를 사용함으로써 공정 전반에 걸쳐 샘플 추적성을 확보하여 잠재적인 전사 오류를 제거하고 데이터 무결성과 환자 안전을 증진시킵니다. 이 영상을 시청한 후에는 간접 면역형광법의 각 단계를 수행하는 방법과 임상적으로 유의미한 항핵항체 패턴을 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.