Name: 반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 학습하세요 HEP-2 세포를 이용한 간접 면역형광법으로 항핵 항체를 검출하는 방법을. 이 기술은 류마티스 관절염 등 자가면역 질환 진단에 필수적인 다양한 자가항체를 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 그녀의 전문 기술 검토를 위해 IIF 실험과 캐롤 흐너을 수행하기위한 카산드라 브라이언트 감사합니다.

1. 준비 및 기판 선택에게 샘플 <ol><li> 포장에서 시약을 제거하고 각 항목이 실내 온도에 올 수 있습니다. 시약을 준비하고 방향 삽입에 따라 환자의 혈청을 희석. 참고 : NOVA 라이트 슬라이드가 바코드이고 쉽게 실험실 정보 시스템 LIS 함께 자동화 시스템에 통합 될 수있다. 이 절차는 수동 슬라이드 처리를 도시한다; 높은 처리량 실험실은, 그러나, 자동 슬라이드 처리 장비를 선택할 수 있습니다. </li></ol> 컨트롤 및 샘플의 2. 추가 <ol><li> 양성 대조군 및 적절한 슬라이드 우물에 음성 대조군의 1 방울 1 방울을 분사합니다. 나머지 우물에 희석 한 환자의 혈청 피펫 20-25 μL. 한 번에 하나의 슬라이드를 처리합니다. </li><li> 바닥에 젖은 종이 타월로 얼룩 컨테이너에서 슬라이드를 놓습니다. 용기를 덮고 30 분간 슬라이드 (들)을 부화. 참고 : 습한 조건 의지마르지 기판을 방지합니다. 우물의 건조는 인공적인 염색 될 수 있습니다. 이 배양 기간 동안, 환자의 혈청에서 항 핵 항체를 각 웰에 고정 된 세포의 항원에 바인딩합니다. </li><li> 잠복기 후, 세척 버퍼의 부드러운 스트림을 사용하여 혈청을 씻어 낸다. 기판의 손상을 방지 우물 사이의 샘플의 크로스 오버, 각 슬라이드를 방지하기 위해 약간 우물에 직접 스트림을 연출 방지 할 수 있습니다. 초과 세척 버퍼를 누르고 약 5 분 동안 세척 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 놓습니다. </li></ol> 형광 복합체의 3. 추가 <ol><li> 하나 하나는, 세척 완충액에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 과잉 세척 완충액을 제거하기 위해 탭. 각 웰에 (FITC 항 - 인간 IgG 표시) 형광 공액 1 방울을 적용합니다. 가습 용기에 30 분 동안 슬라이드를 품어하고, 염색을 교체해야합니다용기 뚜껑. 참고 : ANA의 테스트를 위해, IgG의 구단 특정 공역의 사용을 권장합니다. 공액 민감한 가볍고, 커버는 습한 환경을 유지 이외에 빛에 대한 노출로부터 슬라이드를 보호 할 것이다. 이 배양 기간 동안 복합체는 세포 항원에 바인딩 한 환자의 항 - 핵 항체에 결합 할 것이다. 이 복합체는 웰에서 형광의 존재 하에서 결과 바인딩. </li><li> 린스 전술 한 바와 같이 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 종이 타월에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립의 아래쪽 가장자리에 연속 라인에 설치 매체를 적용 할 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼에서 각 슬라이드를 제거하고 여분의 세척 버퍼를 제거하기 위해 부드럽게 슬라이드를 누릅니다. 커버 슬립의 가장자리에 슬라이드의 하단을 터치합니다. </li><li> 부드럽게 커버 슬립에 장착 매체는 기포 형성없이 슬라이드의 상단에 유입되는 방식으로 커버 슬립 상에 슬라이드를 낮추기. 참고 : 공동, 설치 매체의 최적 량을 사용하여 포함 verslipping은 완벽하게 연습이 필요하는 기술입니다. </li></ol> 긍정 및 부정적인 결과 4. 확인 수동 해석 <ol><li> 보기 어두운 방에있는 형광 현미경으로 슬라이드. 세포의 분포와 형광의 균일 성을 평가하기 위해 20X 또는 25X 목적으로 전체 잘 스캔을 수행 </li><li> 양성과 패턴에 대한 최종 해석을 만들기 위해 40X 목표로 전환합니다. </li><li> 긍정적이고 부정적인 컨트롤 봐. 1 + 4 +에서 반응성의 등급을 매기는 척도를 사용하여 학년 양성. 참고 : 음성 대조군은 완전히 어둡게 표시되지 않을 수도 있습니다,하지만 종종 낮은 수준의 특이 형광을 표시합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 사과 녹색 형광 (그림 1)이 표시됩니다. </li></ol> 자동화 된 해석 참고 : 책상 외에도에서수동 해석, 부하 및 NOVA보기 자동 형광 현미경 또는 기타 자동화 된 디지털 영상 기기로 스캔 슬라이드에 대한; 더 암실이 필요하지 않습니다. 해당 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성 한 후, 기기는 물론 각 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한, NOVA보기 형광 강도를 측정하고, 양 또는 음으로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 이미지는 NOVA보기 결과의 최종 해석, 수정 및 확인 가능, 고해상도 컴퓨터 모니터에 운영자가 볼 수 있습니다. 보고서는 확인 결과를 생성 할 수있다. 이 결과의 해석에 도움을 것입니다 디지털 현미경 경험 실험실 기술자와 함께 사용되어야한다.

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<li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li>
<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

저자 가브리엘라 Lakos, 카산드라 브라이언트, 캐롤 흐너, 안나 Eslami는 INOVA 진단의 직원입니다.

HEp-2 세포에 의한 스크리닝은 SARD 환자 진단의 중요한 첫 번째 단계입니다. 그러나 IIF 방법은 조화가 부족합니다. 가변성의 원인에는 슬라이드 준비, 접합체 특이성, 형광 현미경의 효율성 및 판독기의 경험이 포함됩니다. 이러한 우려에도 불구하고 IIF는 ANA 테스트의 "황금 표준"으로 남아 있습니다. HEp-2 세포는 다양한 자가항원을 함유하고 있으며, 이러한 자가항체의 검출에 이상적인 기질을 제공합니다. 일부 실험실에서는 IIF가 다중 분석 또는 ELISA와 같은 고체상 스크리닝 방법으로 대체되었습니다. 이러한 테스트의 단점은 충분히 민감할 만큼 항원의 전체 범위를 표시하지 않는다는 것입니다. 결과적으로 진양성 환자를 놓칠 수 있으며, 이는 해로운 결과를 초래할 수 있습니다. 치료 지연 및 잘못된 진단 문제 외에도 확증 검사의 반복이나 불필요한 진단 조사로 인해 추가 의료 비용이 발생할 수 있습니다. IIF에 내재된 과제를 감안할 때 결과의 주관성을 피하기 위해 이 기술을 적절하게 수행하는 것이 가장 중요합니다.
ANA 스크리닝 결과의 정확한 해석 및 보고를 보장하려면 최고 품질의 기판을 사용하는 것이 중요합니다. HEp-2 기질을 선택할 때 세포가 천연 단백질 상태에서 임상적으로 관련된 에피토프를 발현하도록 최적화하는 것이 중요합니다. 형질감염되거나 변형된 HEp-2 세포주는 적절한 항체-항원 결합을 허용하지 않을 수 있습니다. 또한, 여러 개의 상이한 자가항체가 동시에 존재할 때, 재조합 세포는 하나 이상의 패턴을 가릴 수 있다. 많은 수의 유사분열 세포도 기질에 존재해야 합니다. 적절한 수의 유사분열 세포를 통해 패턴을 빠르고 정확하게 식별할 수 있습니다. 
기판의 속성 외에도 이 비디오 프로토콜의 목적은 샘플 추가, 슬라이드 세척, 접합체 추가, 커버 슬립 및 양성 및 음성 결과 결정과 같은 중요한 단계를 보여줌으로써 IIF 기술을 설명하는 것입니다. 이러한 각 단계에 적절한 기술을 사용하지 않으면 결과가 손상될 수 있습니다. 결합되지 않은 항체를 모두 제거하려면 적절한 세척이 중요합니다. 일부 환자는 매우 많은 양의 자가항체를 나타내며, 이러한 경우 다른 우물을 오염시키지 않도록 우물에서 혈청을 세척하는 것이 중요합니다. 
IIF는 전통적으로 매우 노동 집약적이고 주관적인 실험실 방법이었지만 슬라이드 프로세서, 바코드 슬라이드 및 자동 디지털 현미경과 같은 신기술은 작업 흐름을 크게 단순화하고 일관성을 높이며 해석의 가변성을 줄일 수 있습니다.

용어 항핵 항체 (ANA)는 DNA, 단백질과 리보 1, 2 등의 세포 핵의 성분과 반응하여자가 항체의 다양성을 설명합니다. HEP-2 세포, 항원의 수백 네이티브 단백질 배열, ANA 1의 검출을위한 이상적인 기판을 제공한다. 인간 혈청에서 ANA의 검출은 결합 조직 질환에 대한 중요한 검사 도구이며, IIF는 ANA 1 테스트를위한 참조 방법이다. 최근 HEP-2 세포에 IIF는 항원 특이적인 면역 및 다중 방법에 약간의 실험실에서 대체되었습니다. 때문에 위음성 결과에 대한 우려와 임상에 대한 투명성의 부족, 류머티스의 미국 대학은 HEP-2 세포를 사용하여 IIF는 ANA 1 심사에 대해 &quot;금 표준&quot;해야한다는 결론을 내렸다 태스크 포스를 형성했다. 때문에 ANA 검사의 주관적인 성격, 간염-2 세포의 품질에결과의 정확하고 자신이보고에 tegral. 유사 분열 세포의 높은 숫자의 존재는, 최적의 세포 형태, 충분한 컨 플루, 관련 항원의 발현이 특히 중요하다. IIF 패턴 인식은 환자의 진단에 도움이되는 중요한 도구 역할을합니다. 다양한 패턴의 의미를 이해하는 것은 임상 및 실험실 직원이 진단을 확인하기위한 적절한 후속 테스트를 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 균질 ANA 패턴 항 dsDNA 또는 염색질 항체의 존재 하에서 발생할 수 있고, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 3과 연관 될 수있다. 다른 측면에서, 최근 일반적으로 일상적인 시료의 최대 12 %에서 볼 수있는 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은, 주로 안티 DFS70 항체와 연관되어 있는지 설명하고있다. 이러한자가 항체는 (다른 질병 특정 ANA없이) 분리에있는 경우는 전신자가 면역 류마티스 질환과 연관되지 않은 &lt;&gt; 4-9 한모금. 안티 DFS70 항체에 대한 이에 확증 시험, 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다. IIF는자가 항체를 검출하는 제 선 스크리닝 방법임을 감안할 때, 그것은 사용자가 시약 및 티슈 기질의 선택이 결과에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것이 중요하다. IIF 기술은 본질적으로 주관적이기 때문에, 사용되는 시약이 최고 품질의 결과를 제공하는 것이 중요하다. 이 비디오 프로토콜이 목표는 IIF 법, ANA와 연관된 공통 패턴을 수행하기 위해 필요한 정확한 단계를 사용자에게 익숙하고, 실험실 작업 흐름을 간소화하고 결과를 표준화 할 수있는 새로운 발전을 도입하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA</td> View <td>Instrument INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation License</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td>바코드 스캐너</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

반핵 항체 hep-2 세포를 사용하여 상영

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

ANA 테스트에 류머티스 위치 문의 미국 대학은 ANA 1 선별을위한 황금 표준 방법으로 IIF의 사용을 규정하고있다. IIF는 전문가의 손에 우수한 선별 검사이지만, 처리 및 IIF를 열람하는 기술적 인 어려움은 슬라이드 - 같은 노동 집약적 인 슬라이드 처리, 수동 독서 경험에 대한 필요성, 훈련 기술자 및 어두운 방에서의 사용으로 - IIF 방법을 현대, 자동화 실험실의 워크 플로우에 맞게하기 어렵다. 고품질 ANA 검사 향한 첫 번째와 중요한 단계는주의 슬라이드 처리합니다. 이 절차는 노동 집약적이며, 전체 프로세스의 이해뿐만 아니라, 세부 사항 및 경험에주의가 필요합니다. 슬라이드 판독 어두운 방에서 형광 현미경에 의해 수행되고, 세포주기의 문맥에서, 다양한 패턴에 익숙한 숙련 된 기술자에 의해 수행및 계면과 나누어 세포의 형태. IIF가 제대로이 기술을 수행하는 단계를 이해, SARD의 첫 번째 라인 검사 도구입니다 제공하는 것은 매우 중요합니다. 최근, 디지털 영상 시스템은 IIF 슬라이드의 자동 판독을 위해 개발되었다. 이러한 NOVA보기 자동 형광 현미경으로 이러한 시스템은, 일상 IIF 워크 플로우를 간소화하도록 설계되었습니다. NOVA보기함으로써 해석에서 이미지 수집을 분리, 우물의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장; 이미지는 고해상도의 컴퓨터 모니터에 해석을 볼 수 있습니다. 그것은 나중에 참조 할 수 있도록 이미지를 저장하고 이미지에 형광 강도 데이터를 제공하여 운전자의 해석을 지원합니다. 또한 예비 양수 또는 음수로 결과를 분류하고, 긍정적 인 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 요약하면, 그것은 암실에 대한 필요성을 제거하고, 자동화하고 IIF의 준비 상태를 간소화NG / 해석 워크 플로우. 가장 중요한 것은 독자와 수치 사이의 일관성을 증가시킨다. 또한, 바코드 슬라이드의 사용과, 전송 오류는 샘플 추적하고 긍정적 인 환자 식별을 제공하여 제거된다. 이 증가 된 환자 데이터의 무결성과 안전을 초래한다. 이 동영상의 전체적인 목적은 슬라이드 처리, 일반적인 IIF 패턴의 식별, 및이 기술을 단순화하고 조화 새로운 발전의 도입을 포함 IIF 절차를 보여주는 것이다.

HEP-2 세포의 염색 결과를 평가할 때, 다섯 가지 주요 핵 패턴은 가장 일반적으로보고 있습니다 : 균질, 얼룩덜룩 한, 센트로, nucleolar, 핵 점. 이러한 패턴은자가 항체는 핵의 특정 성분에 대한 결합의 결과이다. ANA 테스트는 핵 구조에 따라 다릅니다 만, 세포질 구조에 대한자가 항체와 관련된 세포질 패턴도 관찰 할 수있다. 일부의 경우, 몇개의 항체가 샘플에 존재할 수도 있고, 이미지가 혼합 된 패턴으로 나타날 수있다. 좀더 자주 관찰하고 IIF 방법에 의해 검출 될 수 종종 세포주기의 특정 패턴이있다; 가장 최근에, 특별한 임상 적 의의 소위 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬가 약간 ANA 양성 혈청에 설명되어 있습니다. 균일 한 패턴 균일 한 패턴을 확인하려면, 잘 스캔 및 유사 분열 또는 분할을 식별세포. 유사 분열 세포의 응축 된 염색질 (그림 2, 주황색 화살표는) 종종 균일 한 패턴, 휴식 세포 전시 유니폼, 전체 핵의 확산 형광 (그림 nuclei.In 휴식 세포에 비해 더 뚜렷하다 고체, 균일 한 형광을 나타내는 2, 흰색 화살표). 이 특성 패턴은 종종 항 dsDNA 항체 (10)의 결과입니다. 얼룩덜룩 한 패턴 거친 반점 패턴, 유사 분열 세포가 응축 된 염색체 영역에는 염색 (그림 3, 주황색 화살표)를 표시하지 않습니다. 휴식 세포 핵 전체에 걸쳐 입상 형광을 나타낸다. 핵 반점 거친 또는 벌금으로 정의 할 수 있습니다. 조악한 반점 패턴은 종종 안티 SM 및 안티 RNP (11)의 결과이다. 미세 얼룩덜룩 한 패턴에서 휴식 세포는 일반적으로 균일 한 D에, 핵을 통해 벌금이나 확산 반점을 보여istribution (그림 4, 흰색 화살표). 미세 얼룩덜룩 한 패턴은 종종 반대로 SSAand 방지 SSB (12)의 결과입니다. 조밀 한 미세 얼룩 무늬 그것은 지금 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬 (DFS)은 일상적인 테스트에서 일반적인 것으로 인식하고, 샘플의 많은 12 %에 방지 DFS70자가 항체에 대한 양성한다. 그러나, 격리에있는이자가 항체는 전신자가 면역 류마티스 질환 4 -6와 연관되지 않습니다. 이 항체는 건강한 개인과 SARD 6과 관련이없는 질병 베어링 환자에서 유행이다. 안티 DFS70 항체에 대한 확실한 테스트는 불필요한 반사 테스트를 줄이는 데 도움이 상당한 비용 절감 효과를 제공하고, 환자의 불안을 완화 할 수 있습니다. DFS 패턴을 확인하고 ANA 양성 환자와 의사 모두에게 불안을 일으킬 수 어렵 기 때문에, 그것은 매우 identi 후 확인 시험을 수행하는 것이 좋습니다<html> ANA의 임상 적 의의를 명확히하기 위해 항-DFS70 항체 암시 패턴을 붙였을 것은 5,6 positivty. 세포 핵 (그림 5, 흰색 화살표) 핵에 걸쳐 전시 균일하게 분포 된 미세 얼룩을 쉬고이 패턴에서, 유사 분열 세포 (그림 5, 주황색 화살표), 중기 염색질의 긍정적 인 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다. 센트로 패턴 , 센트로 패턴을 식별하는 우물을 검사하고 유사 분열 또는 분할 세포를 식별합니다. 유사 분열 세포 (그림 6, 주황색 화살표)에서 이산 얼룩 밀접 종종 &quot;중기 바&quot;로 설명하는 것에 관련된다. 센트로 패턴에서 휴식 세포 (그림 6, 흰색 화살표)은 핵에 걸쳐 분산 약 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다. 센트로 패턴 안티 CENP의 결과, B는 C 13 항체. 단계 &quot;&gt; Nucleolar 패턴 다른 nucleolear 패턴이 염색체 지역의 긍정적 인 염색을 표시하는 동안 일부 nucleolar 패턴, 유사 분열 세포의 확산 세포질 염색 (그림 7, 오렌지 화살표)과 음의 염색체 영역과 연결되어 있습니다. nucleolar 패턴은 약한 얼룩덜룩 또는 핵질의 균일 한 염색과 함께, 핵소체의 동종 또는 얼룩덜룩 염색 (그림 7, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이러한 패턴이 반대로 RNA 중합 효소 III와 관련된, 안티 fibrillarin, anti-Th/To 및 anti-PM/Scl는 (14, 15)을 항체. 핵 도트 패턴 핵 도트 패턴은 음의 중기 유사 분열 세포 (그림 8, 주황색 화살표)로 및 휴식 세포 핵에있는 몇몇 개별 얼룩 (그림 8, 흰색 화살표)와 연결되어 있습니다. 이 특성 패턴은 종종 SP-100, PML, 또는 P80 콜린자가 항체의 결과입니다. 이 항체는 같다<html> 원발성 담즙 성 간경변과자가 면역 간염 (16) sociated. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . 그림 1 음성 대조군 (왼쪽) : 세포가 아닌 특정 형광 낮은 수준,하지만 특정 핵 염색을 표시 긍정적 인 제어 (오른쪽). 세포는 애플 그린 핵 형광을 표시합니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 동종 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 우수 형광을 보여줍니다. 휴식 세포도, 확산 염색 (whitearrow)를 보여줍니다. &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 3. 거친 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 얼룩덜룩 한 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 음의 얼룩을 보여줍니다. 휴식 세포는 별개의 미세한 반점이 얼룩 (흰색 화살표)를 보여줍니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 조밀 한 미세 얼룩덜룩 한 무늬입니다. 유사 분열 세포 (주황색 화살표) 미세 과립 고체 염색을 보여줍니다. 휴식 세포 (whitearrow) 아주 좋은, 확산 얼룩덜룩 한 얼룩을 보여줍니다. 그림 6. Centromere에 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow) 쇼 유니폼, 별도의 얼룩 무늬가있다. 세포 (whitearrow)을 휴식하는 세포 핵 당 40 ~ 60 이산 얼룩을 보여줍니다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7. Nucleolar 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow는) 세부 염색의 큰 클러스터를 나타납니다. 핵소체의 휴식 세포 nucleishows 형광 (whitearrow). <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> 그림 8. 원자력 도트 패턴. 유사 분열 세포 (orangearrow)는 부정적인 나타납니다. 휴식 세포가 거의 없음을 보여 discr핵 (whitearrow)의 ETE 얼룩은. 또한, nucelar 도트 패턴은 미토콘드리아 항원 (빨간색 화살표)에 대한자가 항체와 관련된 세포질 염색과 공존 할 수 있습니다.

간접 면역 형광 (IIF) 분석은 전통적으로 인간 혈청에 항핵 항체 (ANA)의 검출에 사용되어왔다. 이 항체의 존재는 전신자가 면역 류마티스 질환 (SARD)의 진단에 도움을 줄 수있다. 이 프로토콜은 효율적으로 정확하게 이러한자가 항체를 검출하기 위해 IIF 기술을 수행하는 방법을 보여줍니다.

반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

다음 실험의 전반적인 목표는 간접 면역형광법을 사용하여 항핵항체를 스크리닝하는 것입니다. 이는 환자의 혈청을 HEP-2 기질 슬라이드와 함께 배양하여 수행합니다. 결합하지 않은 환자 혈청을 세척하여 제거한 후, 결합된 자가항체를 특이적 플루오레세인 표지 컨쥬게이트와 함께 배양하고, 결합하지 않은 시약을 세척하여 제거합니다.형광 현미경으로 관찰했을 때, 자가항체 양성 샘플은 자가항체가 결합한 세포 또는 핵 부위에서 항원의 존재를 나타내는 형광 패턴의 사과색 녹색 형광을 나타냅니다. 최종적으로, arna의 존재는 결합 조직 질환의 진단을 돕는 데 사용될 수 있습니다. 고체상 Eliza와 같은 다른 방법과 비교하여 간접 면역형광법의 주요 장점은 Hep two 세포 기질이 천연 구성으로 발현된 100가지 이상의 항원을 포함하고 있다는 점입니다.이를 통해 거의 모든 임상적으로 유의미한 O형 항체를 식별할 수 있는데, 이는 간접 면역형광법이 매우 전문적인 기술이기 때문에 고형상(solid face) 기술로는 불가능합니다. 이 방법이 처음인 개인은 슬라이드 처리 절차에 숙달되기까지 시간과 연습이 필요합니다. 현미경 이미지를 해석하고 관련 패턴을 식별하는 방법을 배우는 것 또한 숙달하는 데 시간이 걸리는 기술입니다.적절한 시약과 도구를 사용하면 결과의 일관성이 높아지고 해석이 더 쉬워집니다. 시연은 면역형광 분석 개발 실험실(Immunofluorescent Asay Development Laboratory)의 기술자인 Cassandra Bryant가 진행하겠습니다. 시약을 포장에서 꺼내 각각 실온에 도달하게 둔 다음, 설명서의 지침에 따라 시약을 준비하고 환자 혈청을 희석하십시오. 슬라이드에는 바코드가 부착되어 있어 자동화 시스템에 쉽게 통합할 수 있습니다.본 절차는 수동 슬라이드 처리 과정을 보여줍니다. 다만, 처리량이 많은 실험실에서는 바코드 스캔 기능이 포함된 자동 슬라이드 처리 장비를 사용할 수 있습니다. Inova 장비들은 중앙 집중식 지능형 네트워크를 통해 연결되어 워크플로우 결과 및 보고에 대한 제어 기능을 제공합니다.IFA를 위해 사용합니다. 이를 통해 처리 과정에서 환자 식별을 확실히 하고 전사 및 관련 오류를 제거할 수 있습니다. 적절한 슬라이드 위에 양성 대조군 한 방울과 음성 대조군 한 방울을 분주합니다.나머지 웰에 희석된 환자 혈청 20 to 25 µL를 피펫으로 분주합니다. 슬라이드는 한 번에 하나씩 처리합니다. 바닥에 젖은 종이 타월을 깐 염색 용기에 슬라이드를 넣고, 용기를 덮은 후 30분 동안 슬라이드를 배양합니다.습윤 상태를 유지하면 기질이 건조되는 것을 방지하여 인위적인 염색 결과가 나타나는 것을 막을 수 있습니다. 이 배양 기간 동안 환자 혈청 내의 항핵항체가 각 웰에 고정된 세포의 항원에 결합하게 됩니다. 배양 기간이 끝나면 기질이 손상되지 않도록 세척 버퍼를 완만하게 흘려주어 혈청을 씻어내십시오.스트림이 기질에 직접 닿지 않도록 슬라이드를 약간 기울이십시오. 이렇게 슬라이드를 배치하면 웰 간의 시료 교차 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다. 과잉 세척 완충액을 털어낸 후, 세척 완충액이 담긴 Copeland jar에 슬라이드를 넣으십시오.세척 단계의 배양 시간은 약 5분이어야 합니다. 세척 완충액에서 슬라이드를 꺼내 가볍게 톡톡 쳐줍니다. 과량의 세척 완충액을 제거한 후, 각 웰에 형광 접합체 한 방울을 가합니다.NA 테스트를 위해서는 IgG FC 특이적 접합체를 사용하는 것이 권장됩니다. 습윤 용기 내에서 슬라이드를 30분 동안 배양하고, 염색 커버를 반드시 다시 덮어주십시오. 접합체는 빛에 민감하므로, 커버를 통해 슬라이드가 빛에 노출되는 것을 방지해야 합니다.이 배양 기간 동안, 접합물은 세포 항원에 결합한 환자의 항핵항체에 결합하게 됩니다. 이러한 접합물 결합의 결과로 배양 후 웰(well)에서 형광이 나타나게 됩니다. 세척 완충액으로 슬라이드를 세척하십시오.이전과 마찬가지로 커버 슬립을 페이퍼 타월 위에 놓고, 커버 슬립의 아래쪽 가장자리를 따라 마운팅 용액을 연속적인 선 모양으로 도포합니다. 세척 버퍼에서 각 슬라이드를 꺼내어 가볍게 톡톡 칩니다. 과량의 세척 버퍼를 제거하기 위해 슬라이드의 하단 가장자리를 커버 슬립의 가장자리에 접촉시킵니다.커버슬립 위의 봉입제가 슬라이드의 상단 가장자리까지 흐르도록 하여 기포가 생기지 않게 슬라이드를 커버슬립 위에 천천히 내립니다. 적절한 양의 봉입제를 사용하는 기술은 숙련이 필요합니다. 암실에 위치한 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하며, 20x 또는 25x 대물렌즈를 사용하여 웰 전체를 스캔해야 합니다. 세포 분포와 형광의 균일성을 평가하려면 40x 대물렌즈로 전환하십시오.양성 여부와 패턴에 관한 최종 해석을 내리기 위해 양성 및 음성 대조군을 확인하십시오. 음성 대조군은 완전히 어둡게 나타나지 않을 수 있지만, 종종 낮은 수준의 비특이적 형광을 보입니다. 양성 대조군은 핵에서 밝은 사과색 녹색 형광을 나타냅니다.양성 반응은 1+에서 4+까지의 반응성 등급 척도를 사용하여 등급을 매길 수 있습니다. 수동 판독 외에도, 슬라이드를 자동 형광 현미경에 적재하여 스캔할 수 있습니다. 암실은 필요하지 않습니다.적절한 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성한 후, 기기는 각 웰 내 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한, Nova view는 형광 강도를 측정하여 결과를 양성 또는 음성으로 분류하고, 양성 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 작업자는 고해상도 컴퓨터 모니터로 이미지를 확인하며, 이를 통해 Nova View의 최종 해석, 수정 및 확정을 수행합니다.확정된 결과에 대해 결과 보고서를 생성할 수 있습니다. 핵 내 구성 단백질 구조에 대한 자가항체 결합은 균질, 점상, 중심체, 인, 핵 점의 다섯 가지 주요 핵 패턴을 나타냅니다. 여기에서 보여주는 것과 같은 균질 패턴을 식별하려면, 유사분열 세포 또는 분열 중인 세포를 확인하십시오.분열기 세포는 휴지기 세포보다 더 뚜렷하게 나타나는 경우가 많은, 균일하고 진한 형광을 보입니다. 휴지기 세포의 핵은 확산성 염색을 통해 균일하게 보여야 합니다. 이러한 특징적인 패턴은 이중 가닥 DNA에 대한 자가항체의 결과일 가능성이 가장 높습니다.반점 패턴의 주요 특징은 중기 분열 세포가 동전 투입구 모양으로 나타난다는 점입니다. 이러한 세포의 염색체 영역은 음성입니다. 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 반점 패턴을 보입니다.반점상 형광 패턴(speckling)은 거친 형태 또는 미세한 형태로 정의할 수 있습니다. 거친 반점상 패턴은 SM 및 RNP에 대한 자가항체의 결과입니다. 미세한 반점상 패턴은 RNA polymerase뿐만 아니라 S-S-A-S-S-B에 대한 자가항체로 인해 나타날 수 있습니다.DFS 패턴은 조밀하고 미세한 점상(dense, fine speckled)으로 정의되며, DFS 70에 대한 자가항체를 나타냅니다. 분열기 세포는 점상 염색을 보이는 반면, 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 미세한 점상 패턴을 보입니다. 이러한 경우, DFS 70 자가항체는 결합 조직 질환 환자보다 건강한 개인에게서 더 흔하게 나타나므로 확인 시험을 수행해야 합니다.Centromere 패턴을 확인하기 위해 웰을 스캔하여 유사분열 중이거나 분열 중인 세포를 식별합니다. 분열 중인 세포는 서로 밀접하게 연관된 수많은 개별 반점들을 나타내며, 이는 흔히 중기 바(metaphase bar)라고 불립니다. 휴지기 세포는 핵 전체에 걸쳐 분포하는 약 40~60개의 개별 반점을 보여줍니다.중심절 패턴은 인 패턴과 함께 중심절 단백질에 대한 자가항체와 관련이 있습니다. 분열기 세포의 염색체 부위 염색 양상은 다양하게 나타납니다. 인 패턴은 핵의 균질한 또는 반점형 염색과 더불어, 휴지기 세포핵의 핵질에서 나타나는 약한 반점형 또는 균질한 염색과 관련이 있습니다.이 패턴은 RNA 중합효소 III, 피브릴린 및 PM-SCL 항체에 대한 자가항체와 관련이 있습니다. 핵 점 패턴(nuclear dot pattern)은 중기 및 분열기 세포에서는 음성으로 나타나며, 휴지기 세포 핵에서는 소수의 뚜렷한 점들이 관찰되는 것과 관련이 있습니다. 이러한 특징적인 패턴은 흔히 SP 100, PML 또는 P 80 colan에 대한 자가항체의 결과로 나타납니다.이 항체들은 원발성 담즙성 간경변증 및 자가면역성 간염과 관련이 있습니다. 제시된 이미지에서 핵 점 패턴은 미토콘드리아 항원에 대한 자가항체로 인해 세포질 염색을 나타냅니다. 항핵항체 검출 및 패턴 인식은 환자 진단을 돕는 중요한 도구로 활용됩니다.다양한 패턴의 중요성을 이해함으로써 임상의와 실험실 담당자는 적절한 후속 검사를 수행할 수 있습니다. 항핵항체 패턴을 정확하게 식별하기 위해 가장 중요한 요소는 고품질의 세포 기질을 선택하고 일관되게 우수한 기술로 슬라이드를 처리하는 것입니다. 슬라이드 판독은 전통적으로 암실에서 형광 현미경을 통해 수행되며, 세포 주기 및 세포 형태의 맥락에서 다양한 패턴에 익숙한 숙련된 기술자에 의해 이루어집니다.최근 몇 년 동안 슬라이드의 자동 판독을 위한 디지털 이미징 시스템이 개발되었으며, 이러한 장비들은 워크플로우를 자동화하고 판독 및 해석의 일관성을 높여줍니다. 또한, 바코드가 부착된 슬라이드를 사용함으로써 공정 전반에 걸쳐 샘플 추적성을 확보하여 잠재적인 전사 오류를 제거하고 데이터 무결성과 환자 안전을 증진시킵니다. 이 영상을 시청한 후에는 간접 면역형광법의 각 단계를 수행하는 방법과 임상적으로 유의미한 항핵항체 패턴을 식별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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생물학

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

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