반핵 항체 HEP-2 세포를 사용하여 상영

다음 실험의 전반적인 목표는 간접 면역형광 분석을 사용하여 항핵 항체를 스크리닝하는 것입니다. 이는 환자 혈청을 2개의 간염 기질 슬라이드로 배양함으로써 달성됩니다. 결합되지 않은 환자 혈청을 씻어내고, 결합된 자가항체를 특정 플루오레세인 표지 접합체로 배양하고, 결합되지 않은 시약을 씻어냅니다.

형광 현미경을 통해 볼 때, 자동 항체 양성 샘플은 항원이 존재함을 나타내는 형광 패턴으로 자동 항체가 결합된 세포 또는 핵 영역에 해당하는 사과 녹색 형광을 나타냅니다. 궁극적으로 아르나의 존재는 결합 조직 질환의 진단을 돕는 데 사용될 수 있습니다. 고체상 Eliza와 같은 다른 방법에 비해 간접 면역형광법의 주요 장점은 Hep 2 세포 기질에 native configuration으로 발현된 100개 이상의 항원이 포함되어 있다는 것입니다.

이를 통해 임상적으로 관련된 거의 모든 O 항체를 식별할 수 있으며, 이는 간접 면역형광 방법이 매우 전문화된 기술이기 때문에 고체 표면 기술로는 불가능합니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 슬라이드 처리 절차에 능숙해지기 위해 시간과 연습이 필요합니다. 현미경 이미지를 해석하고 관련 패턴을 식별하는 방법을 배우는 것도 숙달하는 데 시간이 걸리는 기술입니다.

올바른 시약과 도구를 사용하면 결과가 더 일관되고 해석이 더 쉬워집니다. 이 절차를 시연하는 사람은 면역형광 아세이 개발 연구소(Immunofluorescent Asay Development Laboratory)의 기술자인 카산드라 브라이언트(Cassandra Bryant)입니다. 포장에서 시약을 제거하고 각 품목을 실온으로 가져오고, 시약을 준비하고, 삽입 슬라이드가 바코드가 찍힌 방향에 따라 환자 혈청을 희석하고 자동화 시스템에 쉽게 통합할 수 있습니다.

이 절차는 수동 슬라이드 처리를 보여 줍니다. 그러나 처리량이 많은 실험실은 바코드 스캔 기능이 있는 자동 슬라이드 처리 장비를 선택할 수 있습니다. Inova 기기는 워크플로우 결과 및 보고를 제어할 수 있는 중앙 집중식 지능형 네트워크를 통해 연결됩니다.

IFA의 경우. 그 결과 처리에서 긍정적인 환자 식별이 가능하고 전사 및 관련 오류가 제거됩니다. 포지티브 대조군 한 방울과 네거티브 대조군 한 방울을 적절한 슬라이드에 분배합니다.

웰스 피펫 20-25 마이크로리터의 희석된 환자 혈청을 나머지 웰에 주입합니다. 한 번에 하나의 슬라이드를 처리합니다. 젖은 종이 타월을 바닥에 깔고 용기를 덮고 슬라이드를 30분 동안 배양한 상태로 슬라이드를 염색 용기에 넣습니다.

습한 조건은 기판이 건조되는 것을 방지하여 인공물 염색을 초래할 수 있습니다. 이 잠복 기간 동안 환자의 혈청에 있는 항핵 항체는 각 웰에 고정된 세포의 항원에 결합합니다. 잠복기가 끝나면 기질이 손상되지 않도록 부드러운 세척 완충액을 사용하여 세럼을 헹굽니다.

스트림이 기판을 직접 가리키지 않도록 슬라이드의 각도를 약간 맞춥니다. 이러한 슬라이드 방향은 또한 웰 간의 샘플 교차를 방지하는 데 도움이 됩니다. 여분의 세탁 버퍼를 두드리고 세척 버퍼가 들어 있는 Copeland 용기에 슬라이드를 넣습니다.

세척 단계의 배양 시간은 약 5분이어야 합니다. 세탁 버퍼에서 슬라이드를 제거하고 부드럽게 두드립니다. 과도한 세척 버퍼를 제거하려면 각 웰에 형광 접합체 한 방울을 바르십시오.

NA 검사의 경우 IgG FC 특이 접합체를 사용하는 것이 좋습니다. 가습 용기에서 슬라이드를 30분 동안 배양하고 염색 커버를 교체해야 합니다. 켤레는 빛에 민감하며 덮개는 슬라이드를 빛 노출로부터 보호합니다.

이 잠복기 동안 접합체는 세포 항원에 결합한 환자의 항핵 항체에 결합합니다. 이 conjugate binding은 배양 후 wells에 형광이 존재하는 결과를 낳습니다. 세척 버퍼로 슬라이드를 세척하십시오.

이전과 마찬가지로 종이 타월에 커버 슬립을 놓고 커버 슬립의 하단 가장자리에 연속적인 선으로 장착 매체를 적용합니다. 세탁 버퍼에서 각 슬라이드를 제거하고 슬라이드를 부드럽게 두드립니다. 여분의 세탁 버퍼를 제거하려면 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 커버 슬립의 가장자리에 대십시오.

기포 커버가 미끄러지지 않고 커버 슬립의 장착 매체가 슬라이드 상단 가장자리까지 흐르도록 슬라이드 슬립에 슬라이드를 부드럽게 내리는 최적의 장착 매체 양을 포함하여 완벽한 시야를 확보하는 연습이 필요한 기술입니다. 어두운 방에 있는 형광 현미경을 사용한 슬라이드, 전체 웰 스캔은 20 x 또는 25 x 대물렌즈로 수행해야 합니다. 세포 분포와 형광의 균일성을 평가하려면 40 x 대물렌즈로 전환하십시오.

긍정성과 패턴에 대한 최종 해석을 내리려면 긍정적 인 통제와 부정적인 통제를 살펴보십시오. 네거티브 대조군은 완전히 어둡게 나타나지 않을 수 있지만 종종 낮은 수준의 비특이적 형광을 표시합니다. 양성 대조군은 핵에 밝은 사과 녹색 형광을 표시합니다.

긍정성은 1 플러스에서 4 플러스까지의 반응성 등급 척도를 사용하여 등급을 매길 수 있습니다. 수동 해석 외에도 자동 형광 현미경으로 슬라이드를 로드하고 스캔할 수 있습니다. 암실이 필요하지 않습니다.

적절한 슬라이드 유형을 선택하여 프로젝트를 생성한 후 기기는 각 웰에 있는 세포의 고해상도 디지털 이미지를 획득하고 저장합니다. 또한 Nova view는 형광등 강도를 측정하고 결과를 긍정적 또는 음성으로 분류하며 양성 샘플에 대한 패턴 인식을 제공합니다. 작업자는 고해상도 컴퓨터 모니터에서 이미지를 볼 수 있으므로 Nova View의 최종 해석, 수정 및 확인이 가능합니다.

확인된 결과에 대한 결과 보고서를 생성할 수 있습니다. 핵 내의 구성 단백질 구조에 대한 자가항체 결합은 균질, 얼룩덜룩한 중심체, 핵 및 핵점을 포함한 5가지 주요 핵 패턴을 생성합니다. 여기에 표시된 것처럼 균질한 패턴을 식별하려면 유사분열 세포 또는 분열 세포를 식별하십시오.

유사분열 세포는 고체의 균일한 형광을 나타내며, 이는 종종 휴지 세포보다 더 뚜렷합니다. 휴지 세포핵은 확산 염색으로 균일해야 합니다. 이 특징적인 패턴은 이중 가닥 DNA에 대한 자가항체의 결과일 가능성이 가장 높습니다.

얼룩덜룩한 패턴의 주요 특징은 중기 유사분열 세포의 코인 슬롯 모양입니다. 이 세포의 염색체 영역은 음성입니다. 휴지 세포는 핵 전체에 걸쳐 얼룩 패턴을 나타냅니다.

스페클링은 굵거나 미세하게 정의할 수 있습니다. 코스 스페클링은 SM 및 RNP에 대한 자동 항체의 결과입니다. 미세한 반점은 S-S-A-S-S-B에 대한 자동 항체와 RNA 중합효소로 인해 발생할 수 있습니다.

DFS 패턴은 조밀하고 미세한 반점이라고 하며 DFS 70에 대한 자동 항체를 나타냅니다. 유사분열 세포는 얼룩덜룩한 염색을 보이는 반면 휴지 세포는 핵 전체에 균일하게 분포된 미세한 반점을 나타냅니다. 이러한 경우, DFS 70 자가항체가 결합조직질환 환자보다 건강한 개인에서 우세하므로 확증검사를 실시해야 합니다.

중심체 패턴을 식별하려면 웰을 스캔하고 유사분열 세포 또는 분열 세포를 식별합니다. 분열하는 세포는 종종 중기 막대(metaphase bar)라고 하는 서로 밀접한 연관을 이루는 수많은 불분명한 반점을 가지고 있습니다. 휴지 세포는 핵 전체에 분포된 약 40-60개의 개별 반점을 보여줍니다.

centromere 패턴은 자가항체와 nucleolar pattern을 가진 centromere 단백질과 연관되어 있습니다. 유사분열 세포에서 염색체 영역의 염색은 가변적입니다. nucleolar pattern은 휴지 세포 핵의 nucleoplasm의 약하거나 얼룩덜룩하거나 균질한 염색과 함께 핵의 균질

이 패턴은 RNA 중합효소, 3개의 피브릴린 및 PM SCL 항체에 대한 자가항체와 관련이 있습니다. 핵 점 패턴은 음의 중기(negative metaphase), 유사분열 세포(mitotic cells) 및 휴지 세포핵(resting cell nuclei)에 있는 몇 개의 불연속적인 점과 관련이 있습니다. 이러한 특징적인 패턴은 SP 100 PML 또는 P 80 colan에 대한 자가항체의 결과인 경우가 많습니다.

이 항체는 원발성 담즙성 간경변 및 자가면역 간염과 관련이 있습니다. 표시된 이미지에서 핵 점 패턴은 미토콘드리아 항원에 대한 자동 항체로 인한 세포질 염색을 표시합니다. 항핵 항체 검출 및 패턴 인식은 환자 진단을 돕는 중요한 도구 역할을 합니다.

다양한 패턴의 중요성을 이해하면 임상의와 실험실 개인이 적절한 후속 검사를 수행할 수 있습니다. 항핵 항체 패턴을 정확하게 식별하기 위한 가장 중요한 요소는 고품질 세포 기질을 선택하고 일관성 있는 우수한 기술로 슬라이드를 처리하는 것입니다. 슬라이드 판독은 전통적으로 암실에서 형광 현미경으로 수행되며 세포 주기 및 세포 형태학의 맥락에서 다양한 패턴에 익숙한 훈련된 기술자가 수행합니다.

지난 몇 년 동안 디지털 이미징 시스템은 슬라이드의 자동 읽기를 위해 개발되었으며, 이러한 기기는 작업 흐름을 자동화하고 읽기 및 해석의 일관성을 높입니다. 또한 바코드 슬라이드를 사용하여 프로세스 전반에 걸쳐 샘플을 추적할 수 있어 잠재적인 수기 오류를 제거하고 데이터 무결성과 환자 안전을 높일 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 간접 면역형광 절차의 각 단계를 수행하는 방법과 임상적으로 관련된 항핵 항체 패턴을 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.