골육종 세포의 광 역학 치료의 세포 독성 효능

다음 실험의 전반적인 목표는 골육종 세포에서 광역학 요법의 세포독성 효능을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 골육종 세포에 의한 광감작제 M-T-H-P-C의 세포 내 흡수를 측정함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 레이저 광을 세포에 적용하여 M-T-H-P-C를 활성화하고 세포독성 산소 라디칼을 생성합니다.

마지막으로, 세포 대사 및 세포 수는 수용성 테트라 발연황 1 또는 WST 1 분석법으로 측정됩니다. 궁극적으로, WST one assay와 직접 세포 계수는 골육종 세포에 대한 광역학 요법의 세포 독성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 시험관 내에서 광역학 치료 효능을 측정할 수 있고 현재 환자에게 사용되는 기술과 유사하기 때문에 골육종 치료로 확장됩니다.

골육종 세포주 간의 M-T-H-P-C 흡수를 비교하기 위해 먼저 웰당 6번째 Hoss 및 143개의 B 세포에 0.2배 10을 도금합니다. 6개의 우물 판에서 3 배로 세포가 80에서 90%co 유창성에 밤새 고착하게 하고, 그 후에 그 다음날에, 세포에 의하여 광감작제의 시간 의존하는 흡수를 평가하기 위하여 암흑 속에서 다른 기간 동안 M-T-H-P-C의 조정 농도로 세포를 배양하십시오. 배양 후 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 0.5ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리하고 계수합니다.

다음으로, 400배 G와 실온에서 5분 동안 셀을 스핀다운합니다. 배지를 흡입하고 PBS에서 펠릿을 밀리리터당 5번째 셀의 2배 10의 최종 밀도로 재현탁합니다. 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 96의 각 웰에 피펫으로 넣는다.

웰 플레이트를 만들고 417 나노미터 여기 및 652 나노미터 방출로 설정된 형광 분광 광도계에서 세포의 형광을 측정합니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 0에서 4 밀리리터 농도의 M-T-H-P-C를 3 배로 도금하여 표준 곡선을 준비합니다. 96 웰 플레이트에서 이전에 측정된 플레이트에서 웰을 포함하는 각 셀의 상대 형광 단위를 계산하기 위한 표준 곡선을 생성하기 위해 방금 설명한 바와 같이 형광을 측정합니다.

각 PHOTOSENSITIZER 농도에 대한 어두운 독성 제어 셀을 포함하여 96 웰 플레이트에서 각 M-T-H-P-C 농도당 3000 세포의 광독성을 측정하기 위해 웰 당 3000 세포. 세포가 하룻밤 사이에 접착되도록 다음 날 50-60% Co 유창성을 유지합니다. 배양 후 5시간 동안 어둠 속에서 다양한 M-T-H-P-C 농도의 세포를 배양합니다.

배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척하고 M-T-H-P-C 없이 새로운 배지를 추가한 다음 M-T-H-P-C 흡수 스펙트럼에 특이적인 배지를 추가하고 적절한 눈 보호구를 착용합니다. 652나노미터 다이오드 레이저를 13.5cm 높이에서 제곱센티미터당 21.88밀리와트 출력으로 설정합니다. 평방 센티미터당 5줄의 에너지 복용량을 얻기 위한 세포로부터의 거리.

그런 다음 조명 후 230초 동안 어두운 독성 제어 셀을 제외한 셀을 조명합니다. 세포를 섭씨 37도의 어두운 곳에 24시간 동안 보관하십시오. 그 후, 10 마이크로 리터의 wst를 첨가하고, 1 개의 시약을 첨가 한 후 3 시간 후에 매체의 100 마이크로 리터 당 하나의 시약을 첨가하고, 415 나노 미터에서 개별 웰의 흡광도를 측정한다.

마지막으로, WST one 분석 외에 남아 있는 세포의 수를 계산합니다. 세포의 직접 계수는 세포 독성을 측정하는 두 번째 방법입니다. 생존 가능한 세포의 비율을 계산하려면 2 24 웰 플레이트에 웰당 10에서 4번째 셀을 두 번 파종하고 밤새 접착시킵니다.

다음날, M-T-H-P-C로 어둠 속에서 5시간 동안 세포를 배양하고 방금 시연한 것처럼 조명을 비춥니다. 24 시간 후에 어두운 통제 세포를 어두운 곳에 두고, 상등액을 모으고, PBS로 세포를 한 번 세척하고 트립신은 마지막으로 세포를 아래로 회전시키고 세기를 위한 신선한 매체의 200 마이크로리터에 있는 펠릿을 refuset 눈으로 본다. 이 그래프에 표시된 결과는 상단 패널에서 M-T-H-P-C의 세포 내 수준을 나타내는 세포 현탁액의 형광 강도와 함께 시간 의존적 방식으로 M-T-H-P-C의 흡수를 보여줍니다.

아래쪽 패널에서. 선량에 따른 M-T-H-P-C 흡수는 형광 분광 광도계로 M-T-H-P-C의 형광을 측정하여 평가할 수 있습니다. 이 그래프는 M-T-H-P-C의 세포 내 수준을 나타내는 세포 현탁액의 형광 강도와 함께 시간 의존적 방식으로 M-T-H-P-C의 고정 농도의 흡수를 보여줍니다.

이 그래프에서는 5시간 배양 후 Haass 및 143 B 세포의 용량 의존적 M-T-H-P-C 흡수가 입증되었습니다. 높은 전이성 세포주 143 B에서의 흡수는 낮은 전이성 부모 숙주 세포주보다 유의하게 높았다. 골육종 세포의 용량 의존적 암흑 독성이 입증되었습니다.

143 B 세포를 상이한 M-T-H-P-C 용량으로 처리하고, 처리되지 않은 세포와 비교하고, WST 1 분석법으로 측정한 대사 활성 및 세포 수의 용량 의존적 감소를 관찰하였다. 세포 생존율 감소는 밀리리터당 2.5마이크로그램 이상의 M-T-H-P-C 농도에서 확인되었습니다. 아래 그래프에는 M-T-H-P-C의 용량 의존적 독성이 표시되어 있습니다.

세포는 상이한 M-T-H-P-C 투여량과 이어서 제곱센티미터당 5줄로 조명으로 처리되었습니다. 세포 대사 활동의 결과적 감소와 세포 수의 감소가 관찰되었습니다. 이 기술의 개발은 암 생물학 분야의 연구자들이 이 방법을 골육종의 생체 내 모델 및 기타 전임상 조사에 적용할 수 있는 길을 열었습니다.