Name: 인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 인간 신경전구세포를 기계적 절단법으로 배양하여 세포 간 접촉을 유지하며 40세대 이상 장기 증식하는 방법입니다. 이 기법은 효율적인 신경구체 전대를 가능하게 합니다.

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우리는 중요한 검토 및 본 보고서의 편집을 위해 박사 Soshana Svendsen은 감사합니다. 이 작품은 NIH / NINDS 1U24NS078370-01 및 CIRM DR2A-05320에 의해 기여했다.

저자가 공개하는 게 없다.

<img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6. 마 회로도. 기계적 마 방법을 사용하여 문화 구형 줄기 / 전구 세포를 확장. 중요한 단계 마 팽창 패러다임의 개요. hNPC 구면 사이즈을 neurospheres 계대 전에 관찰하는 중요한 기준 중 하나가도 6에 도시된다. 구체의 크기에서 큰 차이가 있지만, 구체의 적어도 30 %는 직경이보다 큰 300 μM을 가져야한다. 구체 통로에 너무 작은 경우에, 단순히 신선한 MM (25 % -50 %)과 CM을 교환하고 재평가 1-4일 후에. 구체는 직경이 너무 작은에서 계대 때별로 확장 요금이 발...

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Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

단층 1-3 또는 집계 neurosphere를 4-7 중 하나로 문화에 쥐 신경 줄기 세포 확장의 긴 역사가있다. 또, 현상 중추 신경계 8-17의 다양한 영역들로부터 격리 된 인간 신경 전구 세포 (hNPCs)는 시험 관내에서 확장되었다. 이 세포는 이중 강력한, 성상 세포 및 신경 세포 모두로 분화 할 수 있으며 신경 발달 (18, 19)과 질병 메커니즘 (20, 21)를 연구에 매우 유용한 도구가되고있다. hNPCs도 통합, 생존 및 기능 효과 22-24 다양한 수준의 중추 신경계 질환의 다양한 동물 모델에 이식되었다. 종종 표피 성장 인자 (EGF) 및 / 또는 섬유 아세포 성장 인자 -2 (FGF-2) 25 ~ 28 - - 및 접착 29 세 모두 전통적 설치류 또는 인간 태아 유래의 NPC가 성장 인자에 노출되어차원 타원체 시스템은 일반적으로 단일 세포 현탁액 30-34로 효소 적 분해를 사용하여 계대된다. 연구 또는 임상 사용을위한 세포를 확장하는 표준 방법은 쉬운 조작에 의한 부착 단층과 같다. 그러나, 우리는 효소 또는 화학 솔루션 계대 단층과 neurosphere hNPCs 초기 노화 35의 결과 것으로 나타났습니다. 또한, 효소 분해는 배아 줄기 세포 36-38 시연 데이터를 기반으로 차별화와 핵형 이상 수준 증가의 원인이 될 수 있습니다. 계대의 hNPCs의 표준 방법은 현재 우수 제조 단계로 1 임상 시험 (세포에게 주식, Neuralstem 주식 줄기) 갈 (의 cGMP) 수준의 제품을 생산하고 있지만,이 방법은 제한, 세포의 증폭 만 몇 라운드를 허용하는 잠재력을 은행. 분명, 많은 연구 실험 및 향후 임상 시험 할 수있는 기능 혜택을 누릴 수대규모 성장 및 세포 은행을 허락 대량 지​​연된 노화와 세포를 전파. 이러한 요구를 해결하기 위해, 우리는 세포 간 접촉을 유지하기 위해 작은 클러스터로 그들을 &quot;마&quot;의 소설 기계적으로 계대 손상을 neurospheres의 자동화 된 방법을 개발했다. 이 방법은 크게 다른 3D 생물 반응기 배양 방법 (40)으로 된 것과 같이 그들의 수명 (39) 및 현탁 배양은, 단층 배양에 비해 인큐베이터 공간을보다 효율적으로 사용할 수있게 증가 하였다. 제공된 마 프로토콜은 통로 (10), 표준 계대 방법을 사용하여 가능성 위업보다 한 태아의 샘플에서 대형 은행의 생산을 할 수 있습니다. 계대의 hNPCs이 방법은 틀에 얽매이지 않는 동안, 인기가 증가하고 있으며, 최근에는 이러한 인간의 배아와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 신경 줄기 세포 등 다른 세포 유형, V IN 등 다양한 애플리케이션을위한 대규모 확장을 가능으로 출판되었다나이트로 질환 모델링 41-46. 중요한 것은,의 cGMP 급 hNPC 세포 은행은 이미 기술이 미래의 임상 응용으로 적용 할 수 있다는 것을 보여 마 방법으로 생산되고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>비커, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Bio-Safety Cabinet, class II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>4 ft. 또는 6 ft. 모델.&nbsp; 6 ft. 모델 권장; 여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Blades, Double-edge Prep</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>여러 제조업체/공급업체.&nbsp; 주의: 샤프</td></tr><tr><td>셀 냉동 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, 무혈청</td></tr><tr><td>원심분리기, 15ml 인서트가 있는 스윙 버킷</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Conical Tubes, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>여러 제조업체/ 공급 업체</td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer</td><td>Planer</td><td>Kryo 750</td><td>여러 제조 업체/공급 업체</td></tr><tr><td>Cryovials, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>여러 제조 업체/공급 업체</td></tr><tr><td>Culture Flask, Vented, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>여러 제조 업체/공급 업체</td></tr><tr><td>Culture Flask, Vented, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>여러 제조 업체/공급 업체</td></tr><tr><td>문화 플라스크, 통풍구, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>문화 플라스크, 통풍구, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부 된 컵, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>여러 제조 업체 / 공급 업체</td></tr><tr><td>필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>필터, 0.22 &마이크로; m, 첨부된 컵, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>여과지, 8.5 cm 원형</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>집게, 표준 패턴 - 톱니/곡선/18 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>냉동실, 이소프로필 알코올</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>인큐베이터, 37 &deg; C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 시리즈</td><td>다수 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Hemacytometer, Phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>다수 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>&nbsp; 페트리 접시 수정이 필요합니다.&nbsp; &nbsp; 주의:&nbsp; 움직이고 날카로운 칼날.</td></tr><tr><td>Micropipettor, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td></td><td>F144562 여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Micropipettor, 100-1,000 &mu; L (스타터 키트)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Micropipettor, 2-20 &mu; L (스타터 키트)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Micropipettor, 20-200 &mu; l (스타터 키트)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Nutdriver, Autoclavable, 5/16"</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets, cotton-plugged</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>multiple Manufacturers/suppliers</td></tr><tr><td>Petri Dish, Glass, Autoclavable</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Shim 디스크</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 장벽 피펫 팁, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 장벽 피펫 팁, 1,000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>여러 제조 업체 / 공급 업체</td></tr><tr><td>멸균 장벽 피펫 팁, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 장벽 피펫 팁, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 일회용 피펫, 모든 플라스틱 랩, 10ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 일회용 피펫, 모든 플라스틱 랩, 2ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 일회용 피펫, 모든 플라스틱 랩, 25ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>멸균 일회용 피펫, 전체 플라스틱 랩, 5ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>살균 파우치, 19 x 33cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>스트레이너, 40 &마이크로; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시, 60mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr>관 <tr><td>랙, 연동 4방향</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>S52602Q 여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>신경 전구 세포 특이적 처리 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>신경 줄기 세포 팽창 매체 (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Stemline 브랜드</td></tr><tr><td>재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>재조합 인간 백혈병 억제 인자(LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>Trypan Blue (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>여러 제조업체/공급업체</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 신경의 집계의 cgmp-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

실험 연구와 임상 시험을위한 단일 시료로부터 세포의 큰 숫자를 축적하는 셀 확장 기술은 크게 줄기 세포 사회를 유익 것이다. 현재의 많은 확장 방법은 힘들고 비용이 많이 드는, 완전한 분리를 포함하는 여러 줄기 및 전구 세포 유형의 분화 또는 초기 노화를 받아야하는 원인이 될 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 간단하고 저렴하다 &quot;마&quot;라 자동화 기계류 계대 방법을 개발했다. 이 기술은 단일 세포로 화학 물질 또는 효소 분해를 방지하고 대신 상수 세포 / 세포 접촉을 유지 정지, 회전 타원체 문화의 대규모 확장 할 수 있습니다. 초핑 방법은 주로 태아 뇌 유래 신경 전구 세포 또는 neurosphere를 위해 사용되었으며, 최근 배아 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 유래의 신경 줄기 세포를 사용하기 위해 발행되었다. 프로 시저 involv에스 조직 문화 배양 접시에 neurosphere를 파종 이후에 효과적으로 수동으로 기계적으로 각 영역을 해리의 지루한 과정을 자동화 세포를 통해 날카로운, 멸균 블레이드를 전달합니다. 문화의 세포를 일시 중단하면 유리한 표면적 - 부피 비율을 제공한다; 500,000 이상의 세포는 직경이 0.5 mm 미만의 단일 neurosphere 내 성장시킬 수있는. 한 T175 플라스크에서 50 백만 셀은 1500 만 자기편 문화에 비해 서스펜션 문화에서 성장할 수 있습니다. 중요한 것은, 마 절차는 임상 수준의 세포 제품의 대량 수량의 생산을 허용, 현재 좋은 제조 연습 (cGMP의)에서 사용되어왔다.

<img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> P19 냉동 hNPCs의 그림 5. 대표 데이터.) 예상 세포 수는 다음 해동 마 방법을 통해 계대 neurosphere를 비교하여 효소 분해를 사용하여 부착 단일 층으로 확장. 세포가 P20에 해동했을 때 일 0 나타냅니다. B) 분야의 대표 이미지를 미리 잘라, 구 후 절단, 10X. D) 색상 견본이 미디어 조절의 정도를 설명하는 데 사용의 cGMP-의 10 배. C) 대표 이미지 유사한 프로토콜. E) 1 일 동안 도금 및 네 스틴 (적색) 표현 염색 해동 P29의 hNPCs의 면역 세포 화학. 칠일 기미를 위...

이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적​​인 성장을 할 수 있습니다.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 배양 세포의 수명 동안 세포 간 접촉이 유지되도록 신경구(neurosphere)를 효율적으로 계대 배양하는 것입니다. 이 기술은 인간 신경 전구 세포(human neural progenitor cells)에 필요한 확장 조건을 조성합니다. 이는 동일한 세포가 담긴 T 1 75 플라스크를 최대 두 개까지 합쳐 원뿔형 튜브로 옮긴 후, 두 번째 단계로 신경구를 페트리 접시에 옮겨 부유 상태의 신경구를 페트리 접시 위에서 관리 가능한 덩어리로 응집시킴으로써 수행하며, 이를 통해 블레이드로 H NPCs를 작은 클러스터로 절단할 수 있게 됩니다.다음으로, 계대 배양하거나 절단한 뉴로스피어를 재부유시켜 페트리 접시에서 세포를 제거하고 새 플라스크에 분주합니다. 분석 결과, 표준 효소 처리 방식을 통해 계대 배양한 세포와 비교했을 때, 절단 기법의 확장 곡선이 장기적인 로그 성장률을 나타냄으로써 해당 기법이 장기 성장 전략임을 보여줍니다. 스피어 형태의 이 기법에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다.응축 단계는 글로 설명하기 어렵습니다. 또한 공정을 돕기 위한 몇 가지 요령이 있습니다. 페트리 접시에서 과잉 배지를 완전히 제거하지 않으면, 구체들이 작은 클러스터로 분리되지 않고 단순히 배지 내에서 밀려나게 됩니다.H NPCs가 담긴 플라스크의 배지 색상을 확인하며 이 절차를 시작하십시오. 현미경으로 플라스크를 스캔하여 세포를 관찰하십시오. 가능하다면, 래디컬을 사용하여 여러 구체의 크기를 조사하십시오.직경이 300 µm 이상인 구체가 많다면, chopping 공정을 진행하여 7~10일마다 세포를 chopping 하십시오. 그 다음 플라스크를 배양기로 다시 넣고 chopper를 설치하십시오. chopper의 전원 스위치를 켭니다.BSC 내에서, 절단 두께를 200 micrometers로 설정하고 블레이드 힘을 180도 또는 9시 방향으로 설정하십시오. 다음으로, 자동 속도 조절 노브가 가능한 한 왼쪽(반시계 방향)으로 끝까지 회전되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 테이블 릴리스 노브를 가능한 한 오른쪽으로 끝까지 이동시키고, 플레이트 홀더가 안정적인지 확인하십시오.수동 암 조작기를 시계 방향으로 회전시켜 암을 최대 높이까지 올립니다. 그 후, 멸균된 양날 chopping blade를 chopper arm 볼트에 무균적으로 옮깁니다. 포셉을 사용하여 클램프를 blade 위에 배치합니다.클래스의 곡선 부분이 암의 상단 가장자리에 위치해야 합니다. 그다음, 클래스를 암에 대고 볼트에 너트를 고정합니다. 이때 멸균된 너트 드라이버를 사용하여 너트를 4분의 1바퀴 정도 느슨하게 남겨둡니다.이 절차에서는 권장량의 유지 배지를 새 플라스크로 옮깁니다. 그 후 배양기에서 BSC로 세포를 무균적으로 이동시킵니다. 플라스크를 튜브 랙에 기울여 놓고 구체들이 플라스크 바닥에 가라앉도록 둡니다.침전이 완료되면 상청액 12 milliliters를 흡입하여 제거합니다. 10 milliliter 세롤로지컬 피펫을 사용하여 플라스크 표면에 느슨하게 부착된 모든 구체를 헹구어 냅니다.필요에 따라 이 과정을 반복하고, 헹굼 단계 사이에 구체들이 가라앉도록 둡니다. 그다음, 권장량의 조건화 배지를 새 플라스크로 옮깁니다. 이어서 남은 모든 조건화 배지와 구체들을 새로운 15 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다.구체(spheres)가 가라앉을 때까지 기다린 후 사용한 플라스크를 폐기하십시오. 그 후, 15 milliliter 원심분리관의 세포를 가능한 최소 부피로 60 millimeter 페트리 접시 또는 심 디스크(shim disc)로 천천히 옮기십시오. 남은 조건화 배지는 절단 후 접시의 세포를 헹구는 데 사용되므로 보관해 두십시오.디쉬에서 배지와 구체가 차지하는 표면적을 최소화하십시오. 다음으로, 상층액을 다시 15 milliliter 원추형 튜브로 옮겨 구체 풀을 응축시키기 시작합니다. 에어로졸 차단 팁이 장착된 마이크로 파이펫을 사용하여 배지 세포 풀의 상단에서 가능한 한 많은 배지를 제거하십시오.구체(spheres)를 건드리지 않고 배지를 제거할 수 없을 때까지 풀(pool)을 넓게 펼칩니다. 표면적을 넓히기 위해 피펫 팁의 측면을 사용하여 페트리 접시를 약간 기울이고, 피펫 팁의 측면으로 모든 구체를 풀의 한쪽으로 조심스럽게 밉니다. 모든 세포를 이동시킨 후, 페트리 접시를 반대 방향으로 천천히 기울여 배지가 구체로부터 분리되도록 합니다.그 후, 맑아진 배지를 15 milliliter 원추형 튜브로 다시 옮깁니다. 피펫 팁의 옆면을 사용하여 모든 구체들을 페트리 접시 중앙으로 조심스럽게 밀어 모읍니다. 이때 모인 구체 무리의 직경이 0.5 to 2.4 centimeters가 되도록 합니다.구체 풀(sphere pool)의 깊이를 얕게 유지하는 것이 중요합니다. 풀이 너무 깊으면 초핑(chopping) 과정에서 구체들이 옆으로 밀려날 수 있습니다. 이제 페트리 접시를 플레이트 홀더로 옮겨 플레이트 홀더 후크 아래에 고정하십시오.테이블 릴리스 노브를 사용하여 플레이트 홀더를 왼쪽으로 밀어 날이 구체들과 닿지 않게 하고 기어에 고정합니다. 다음으로, 매뉴얼 매니퓰레이터 노브를 시계 방향으로 돌려 초퍼 암을 내리고, 날이 페트리 접시 위에 완전히 밀착될 때까지 내립니다. 너트를 조이는 동안 암 마운트를 아래로 누릅니다.그런 다음 리셋 버튼을 누릅니다. 안정되면 한 손으로 페트리 접시를 고정한 상태에서 자동 암 매니퓰레이터 노브를 시계 방향으로 90도 또는 12시 방향으로 돌리고, 모든 구체가 절단되면 절단 작업을 시작합니다. 플레이트 홀더를 90도 회전시킵니다.그 다음 볼트를 풀고, 암을 내린 뒤 너트를 다시 조입니다. 절단 과정을 반복합니다. 그 후 무균적으로 페트리 접시를 플레이트 홀더에서 BSC 내의 작업 공간으로 옮깁니다.컨디셔닝 배지 1 mL를 절단된 구체 위로 옮깁니다. 그런 다음 부드럽게 재현탁하여 절단된 구체를 새로운 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며, 절단된 구체를 모두 수집할 때까지 필요한 만큼 이 과정을 반복합니다.배양액과 절단된 구체(sphere)의 부피를 측정합니다. 표 2의 E열에 제시된 권장 부피에 도달하도록 적절한 양의 유지 배지를 추가합니다. 그 후, 구체 현탁액을 각각의 새 플라스크에 분배합니다. 이때 한 번에 하나의 플라스크로만 현탁액을 옮기고, 옮기는 과정 사이사이에 구체를 재현탁합니다. 각 플라스크의 최종 부피는 표 2의 F열에 제시된 권장 부피와 같아야 합니다. 절단된 hNPC를 인큐베이터에 넣습니다.이 그림은 계대 배양 19단계에서 동결된 후, 효소 해리법을 이용하여 부착 단층으로 해동 및 확장시킨 H NPC의 예상 세포 수와 chopping 방법을 통해 계대 배양한 신경구(neurospheres)를 비교하여 보여줍니다. 여기서는 10배 배율에서 촬영한 chopping 전과 후 신경구의 대표 이미지들이 제시되어 있습니다. 이 이미지는 하루 동안 플레이팅하고 nest 및 발현을 염색한 해동 후 계대 배양 29단계의 H NPC를 보여주며, 반면 이 이미지는 성장 인자가 없는 상태에서 7일 동안 플레이팅하고 GFAP 및 beta three tubulin을 염색한 해동 후 계대 배양 29단계의 H NPC를 보여줍니다.이 영상을 시청하고 나면, 세포의 수명과 배양 전 과정 동안 세포 간 접촉을 유지하는 자동 쵸핑(chopping) 기술을 사용하여 HBC를 계대 배양하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차는 다능성 세포 유래 신경 줄기 세포나 카디오스피어(cardio spheres)와 같은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

체외에서 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 조작하는 능력은 치료 목적을 위해 세포 이식으로 자신의 유틸리티를 조사하고 인간의 신경 발달을 탐험하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간의 줄기 세포 연구의 증가 재현성의 희망에 culturing 및 passaging hNSPCs의 방법을 보여줍니다.

인간 신경 줄기 세포를 Passaging

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 비형질전환 및 형질전환 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 신경전구세포의 생성을 보여줍니다. hPSC는 신경세포 분화 배지를 사용하여 신경전구세포로 분화됩니다. 분화는 작은 분자를 사용하여 비형질전환 세포에서 유도되는 반면, 형질전환 hPSC는 뉴런 분화 특이적 전사 인자를 위해 프로모터를 유도하는 항생제를 첨가하여 분화됩니다.

Non-Transgenic 및 Transgenic Human Pluripotent Stem Cells into Neural Progenitor Cells (비유전자 변형 및 형질전환 인간 만능 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화)

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포의 제어된 크기 응집을 생성하고 단일 사용 생물 반응기를 사용하여 화학적으로 정의되고 피더가 없는 조건하에서 소뇌 유기체의 분화를 더욱 자극하는 동적 배양 시스템을 설명합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오르가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화

이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

배우세요 인간 신경전구세포를 기계적 절단법으로 배양하여 세포 간 접촉을 유지하며 40세대 이상 장기 증식하는 방법입니다. 이 기법은 효율적인 신경구체 전대를 가능하게 합니다.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

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