RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

이 절차의 전반적인 목표는 체외 세포 기반 분석의 조합을 사용하여 화학 라이브러리에서 광범위한 항바이러스제를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 루시퍼를 리포터로 암호화하는 홍역 바이러스의 재조합 균주의 체외 복제를 억제하는 화합물을 선택함으로써 달성됩니다. 이와 동시에 화합물의 독성은 루시페라제 기반 생존율 분석을 사용하여 추정됩니다.

두 분석법의 결합된 표현형 데이터는 HIIT 분자를 분리하는 데 사용됩니다. 마지막 단계는 용량 반응 복제, 홍역 및 닭 구나 바이러스의 억제를 위해 HIIT 화합물을 재검사하고 체외 독성을 보다 정확하게 측정하는 것입니다. 궁극적으로 광범위한 항바이러스 화합물이 스크리닝에 의해 식별되고 검증됩니다.

세포요법 효과를 기반으로 하는 표준 바이러스 복제 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 발광을 판독값으로 사용하고 루시페라아제를 리포터로 발현하는 매우 다양한 바이러스와 결합한다는 것입니다. El Niemans 팀의 기술자인 Olivier Ellan과 Fredrik JI의 연구 부서에서 저와 함께 일하는 엔지니어인 Marianne Luca Ori가 절차를 시연할 것입니다. DMSO에 있는 화합물의 10 밀리몰 스톡 용액을 포함하는 96개의 웰 마더 플레이트.

각 웰에 이미 20마이크로리터의 DMSO가 있는 새로운 96웰 플레이트로 각 화합물 5마이크로리터를 이동시켜 중간 희석 플레이트를 생성합니다. 이제 이러한 희석판 1마이크로리터를 흰색 바코드 조직 배양의 드라이 웰에 파이프로 넣습니다. 96웰 플레이트.

이들은 D one 플레이트이며 20 마이크로 몰에서 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 영하 20도에서 보관하십시오. 이제 10 배 더 희석 된 중간 희석 판에서 새 판을 만듭니다.

4마이크로리터의 각 희석된 화합물을 취하여 36마이크로리터의 DMSO가 있는 웰에 혼합합니다. 이 플레이트에서 샘플당 1마이크로리터를 평평한 바닥이 바커로 바barcode된 흰색 조직 배양의 드라이 웰로 옮깁니다. 96웰 플레이트.

이들은 D 두 개의 플레이트이며 MV 복제의 억제를 평가하는 데 사용됩니다. 섭씨 영하 20도에서도 보관하십시오. 안정화된 L-글루타민이 보충된 DMM에서 4-5일마다 HEK 2 93 T 세포를 성장시키고, 트립신으로 세포를 통과시켜 새 플라스크로 10분의 1 희석합니다.

로그 성장 단계에서 실험을 위해 세포를 수집하고 계수합니다. 밀리리터당 300, 000 세포로 세포를 재현탁합니다. 이 희석에서 12.5ml의 세포는 스크리닝될 각 플레이트에 필요합니다.

이제 플레이트에 1마이크로리터의 DMSO가 있는 제어 웰 한 세트의 스파이크를 준비합니다. 1마이크로리터의 DMSO와 2.5마이크로리터의 0.5%ipol 용액으로 두 번째 제어 웰 세트를 스파이크하여 세포를 죽입니다. 세포 현탁액을 트로프로 옮기고 D one 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 분배합니다.

침전을 피하기 위해 정기적으로 현탁액을 교반하십시오. 그런 다음 준비된 플레이트를 24 시간 동안 배양합니다. 이전 섹션에서 했던 것처럼 플레이트용 셀을 준비합니다.

배양 배지에 우리딘을 보충하여 피리미딘 생합성의 초기 단계를 표적으로 하는 항바이러스 분자를 걸러낼 수 있는데, 이는 매우 흔하기 때문입니다. 감염되지 않은 세포가 있는 제어 웰을 위해 세포 현탁액의 10분의 1을 저장하고 나머지 부피를 감염시킵니다. 충분히 해동하십시오.

RMV 2 luxe stock solution은 0.1 감염 배수를 위해 표적 세포당 0.1 감염 입자로 배양물을 감염시킵니다. 계산된 부피의 바이러스를 세포 현탁액에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 감염된 세포를 트로프로 옮기고 감염된 세포 100마이크로리터를 D 두 플레이트에 분배합니다.

2열부터 11열까지를 타겟으로, 1열과 12열에 스파이크 화합물과 양성 대조군 웰이 포함되어 있습니다. 1열과 12열에서 번갈아 가며 물마루의 세포를 부드럽게 혼합하고 감염되지 않은 세포 100마이크로리터를 분배합니다. 이제 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.

배양 시간 후, D one plate cell의 생존력을 결정한다. 50마이크로리터의 루시퍼라제 기반 생존도 시약을 각 웰에 혼합하고 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 광도계로 플레이트를 읽습니다.

통합 시간을 웰당 100밀리초로 설정합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 반딧불이 루시퍼 기질을 각 웰에 혼합하고 실온에서 6분 동안 대기하여 D 두 플레이트에서 MV 복제를 측정합니다. 그런 다음 독성 분석의 각 D 1 및 D 2 플레이트에 대해 Z 인자를 참조하십시오.

계속해서 바이러스 복제 억제를 계산합니다. Hi 화합물은 바이러스 복제를 적용된 컷오프 값 이하로 감소시키고 각 HI 화합물에 대해 독성이 없는 화합물입니다. DMSO에서 500 마이크로 어금니에서 시작하여 96웰 플레이트의 한 열을 따라 4개의 마이크로 어금니로 반 단계씩 내려가며 연속 희석을 수행하고, 복합 희석 플레이트에서 흰색 바코드 조직 배양 플레이트까지 1마이크로리터를 추가합니다.

이 과정을 두 번 반복하여 세 개의 테스트 플레이트 세트를 만듭니다. 그런 다음 조직 배양 플레이트를 50마이크로리터의 배양 배지로 채웁니다. 이제 37.5 밀리리터의 HEK 2 93 T 세포를 준비하고, 600, 밀리리터 당 000 세포를 보충 DM EM에 현탁시킵니다.

12.5ml의 셀 현탁액이 있는 15ml 튜브 2개를 로드합니다. 각각은 1개의 세포 튜브를 RMV 2개의 Luke로 0.1의 감염 다중으로 감염시킵니다. 세포의 두 번째 튜브를 바닐라 루시퍼를 발현하는 재조합 두부류로 감염시킵니다.

감염 다중도 0.2를 사용합니다. inversion을 사용하여 바이러스에 감염된 세포의 두 튜브를 혼합합니다. 이는 생물안전성 3등급 실험실에서 수행되어야 하는데, 그 이유는 이태 병원성이 이제 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 세트를 자체 HIIT 복합 플레이트 세트에 로드하기 때문입니다.

웰당 50마이크로리터의 셀을 분주하고 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 50마이크로리터의 반딧불이 루시페라아제를 RMV 2개의 Luke 감염 세포의 각 웰에 추가합니다. 마찬가지로, 감염되지 않은 대조군 세포에 Chick V Ren 감염 세포에 50마이크로리터의 런 바닐라 루시퍼 기질을 추가하고 50마이크로리터의 십자화과 염기 생존력을 추가합니다.

시약은 MV 및 Chick V 복제를 50% 억제하는 hi 화합물 농도를 측정하여 진행하며, 또한 세포 독성을 나타내는 화합물은 무시합니다. 이 스크리닝 파이프라인은 1차 및 2차 스크리닝에서 각각 결정된 바와 같이 유의한 세포 독성을 나타내지 않고 MV 및 Chick V 복제를 모두 억제하는 화합물을 선택하는 데 의존하며, 반딧불이 또는 런 바닐라 루시퍼를 발현하는 재조합 바이러스를 활용합니다. 기자로서.

복합 독성은 발광이 이 플레이트의 살아있는 세포와 상관관계가 있는 상업용 루시퍼 기반 분석을 사용하여 평가됩니다. 21개의 화합물은 양성 대조군 웰에 의해 설정된 임계값을 기반으로 독성으로 점수가 매겨졌습니다. 항바이러스 활성은 RMV 2를 사용하여 먼저 측정했습니다.

Luke Luminescence는 제어 우물에 의해 설정된 한계와 비교되었습니다. 여기서, 4개의 화합물은 다른 분석에서 바이러스 복제를 75% 이상 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이 중 2개는 모든 HIIT 화합물에 독성이 있는 것으로 밝혀졌습니다.

절반 최대 억제 농도는 루시페라아제를 발현하는 MV 및 Chick VRNA 바이러스 모두에서 측정되었습니다. 이 두 바이러스는 관련이 없으므로 화면을 더 강력하게 만듭니다. 이와 동시에, 선택된 화합물의 세포 독성 부족은 용량 반응 실험에서 확인되었습니다.

모두에서 13의 비독성 화합물은 10의 000의 분자의 화학 도서관에서 확인되었다. 이 화합물은 화학 구조와 생물학적 활성 측면에서 모두 새로웠습니다. 구조적 유사성에 따라 화합물은 세 가지 화학 계열로 나뉩니다.

참고로, 절반의 최대 억제 농도 값은 강력한 항바이러스 활성을 가진 물질로 얻어졌습니다. 이러한 값을 살펴보면 한 자릿수 미만의 크기로 인해 화면을 통해 식별된 가장 활성 히트에서 참조 분자가 분리되었습니다. 이것은 일단 마스터되면 선택된 화합물의 상대적으로 강력한 항바이러스 활성을 보여줍니다.

이 기술은 고처리량 설정에서 대규모 화학 라이브러리를 스크리닝하고 작은 분자 세트를 선택하고 광범위한 항바이러스제에 도달하는 데 사용할 수 있습니다.