Name: 마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 학습하세요 마우스 요추 척수에 비침습적 경막내 주사를 통한 siRNA 국소 전달 및 유전자 넉다운 기법. 이 방법은 신경과학 연구에서 유전자 기능을 효율적으로 연구할 수 있게 합니다.

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모든 동물의 사용 절차는 지역 관​​리기구 (Regierungspräsidium 카를 스루에, 카를 스루에, 독일)가 정한 윤리 지침에 따라했다. 1. 의 siRNA / PEI 단지의 제조 의 siRNA / PEI 복잡한 솔루션은 다음과 같은 제조 업체의 지침을 사용하여 제조된다 : <ol><li> 용액 A : 최종 부피의 분기까지 멸균 수있는 siRNA를 원하는 양 (필요한 경우)을 희석하고 최종 부피의 절반을 10 % 글루코스 용액쪽으로 추가로 이것을 희석. 소용돌이 부드럽게 아래로 pipetting에 의해 혼합. siRNA를 최적의 금액은 경험적으로 결정해야하지만, 동물 당 10 ㎕의 복잡한 솔루션에서 1 μg의 siRNA는 최적화를위한 좋은 출발점이 될 것입니다. </li><li> 용액 B : 최종 부피의 쿼터 멸균 위로 PEI 시약의 필요한 부피를 희석시켜 최종 용적의 절반 10 % 글루코스 용액쪽으로이 더욱 희석. 소용돌이 GEntly 아래로 pipetting에 의해 혼합. 참고 : PEI 시약의 양은 형질의 효율에 영향을 복잡 이온 밸런스를 결정한다. 마찬가지로 PEI 용액의 최적 량은 경험적으로 결정되어야한다. 우리 손에, 최적 량은 1 μg의 siRNA 당 PEI 솔루션의 0.12 μL입니다. </li><li> 솔루션 B와 용액을 혼합 한 번에, 소용돌이 부드럽게. </li><li> 사용하기 전에 실온에서 15 분 동안 혼합 용액을 품어. 이 단지는 4 ℃에서 실온에서 2 시간 동안 24 시간 동안 안정 </li></ol> 2. 척수강 내 주입 <ol><li> 이 반사 보상하기의 흔적을 보여줍니다 때까지, 3 % 이소 플루 란으로 마우스를 마취. 또한, 추가로 마취의 상태를 확인하기 위해 꼬리 및 / 또는 발 핀치 반사를 확인합니다. </li><li> 니들 삽입하는 동안 더 나은 시각화를 용이하게하기 위해 꼬리의 기부 근처 동물의 후방 단부에 퍼 작성된 2cm이 쉐이브. </li><li> 에 마우스를 놓고절차를 수행하는 동안 계속 이소 플루 란 관리를위한 코 콘, 1.5 %로 이소 플루 란을 감소시키고, 눈의 윤활유와 마우스의 눈을 포함한다. </li><li> 바늘에 30 G 0.5에 부착 된 25 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 siRNA의 혼합 용액을 사용하도록 준비를 준비합니다. </li><li> 가장 눈에 띄는 하나가 조심스럽게 눌러이 주변 척추 열을 수정해야 L6의 극돌기를 찾습니다. </li><li> 조심스럽게 L5와 L6 척추의 홈 사이에 바늘을 삽입하고이 기​​호가 막내 공간에서 바늘의 성공적인 진입을 표시로 꼬리 영화에 대한 관찰. 팁 : 손톱을 사용하여 한 번뿐만 아니라 그루브를 찾을 수 있어야한다. </li><li> 테일 플릭이 관찰되면, 즉시, 그러나 정중 한 손으로 바늘의 위치를​​ 고정하고 다른 손으로 천천히 물질의 원하는 양을 주입. 팁 : 5-10 사이의 볼륨이 μL 볼륨 5 이하로 최적 &amp;# 181; 난 신뢰할 수 10 μL보다 더 큰 볼륨이 너무 많은 압력에 이르게한다. </li><li> 분사가 수행되면, 마취에서 회복하기 위해 케이지에 다시 마우스를 이동합니다. </li><li> 대상 유전자의 최적의 하향 조절을 달성하기 위해이 주사 최소 2 번 이상 매일 24 시간을 반복합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

따라서, 경 막내 주사 바늘의 상술 기법은 효과적 빠르고 구체적 지역화 및 비파괴이다. 기술적으로,이 절차의 가장 중요한 측면은 홈에 바늘 삽입의 포인트입니다. 그것은이 절차는 매우 침착 손과 인내심을 가지고 수행하는 것이 중요합니다. 많은 수술과 마찬가지로 훈련은 성공적으로 주입의 속도를 향상시킵니다. 실제의 실험 기간 동안,이 방법은 직접 주입이 성공인지 아닌지 확인하는 명백한 표시를 제공하지 않기 때문에이 또한 중요하다. 올바른 바늘 삽입 만 볼 지표는 반사적으로 관찰 꼬리 영화입니다. 이 방법은 완전히 같은 감소 된 투여 량 및 제한 부작용을 허용 척추 변조의 특이성과 같은 다른 systemical 전달 경로 (예 : 경구, 정맥 내, 복강 내 등), 경 막내 이상의 전달의 장점을 유지; 퍼thermore, 척수강 내 주사는 척수강 내 주입하는 동안 바늘이 경막과 척추 사이에 삽입되어 있기 때문에 일반적으로 크로스 혈액 뇌 장벽없는합니다...

척수 처리 및 통증 (통각) 입력 4-7의 전송 등 주요 생물 학적 과정과 생리 기능의 다양한 매우 중요한 중심지입니다. 다양한 실험 기술들은 척수강 내 카테터 13의 주입 만성 척수 마이크로 인젝션, 및 경 막내 주사 바늘 15 등의 척수의 약리학 적 변조를 용이하게하기 위해 개발되어왔다. 각각의 기술은 자신의 장점과 단점을 가지고 있으며, 실험 패러다임에 따라 하나의 기술은 다른 사람보다 더 적합 할 수 있습니다. 척수강 내 카테터의 만성 주입 쥐에서 쉽게 가능한 반면,이 방법은 크기 제한 주어진 마우스에 매우 어렵습니다. 성공률은 매우 낮은 모터 적자 인해 종종 마우스에서 심각하게 제한 경막 하 공간에 카테터의 부피가 큰 존재로 발생합니다. 또한, 약물의 장기로 인해 납기가 자주 응고에 렌더링만성적으로 카테터를 주입. 마지막으로, 면역 반응이 일반적이다. 이러한 문제는 생쥐의 척수에 약물 및 시약의 빠르고 해부학 제한된 애플리케이션을 가능 preimplanted 카테터의 부재에서 바늘을 통해 급성 경 막내 주입 방법을 사용하여 회피 될 수있다. 이 방법은 완전히 같은 척추 감소 투여 량 및 제한 부작용을 허용 변조뿐만 아니라 물질 그렇지 전달 능력의 특이성 등의 전신 전달 경로 (예 : 경구, 정맥 내, 복강 내 등) 위에 경 막내 전달의 장점을 유지 척수강 내 주입하는 동안 바늘이 경막과 척추 사이에 삽입되어 있기 때문에 일반적으로 혈액 뇌 장벽을 통과하지 않습니다. 중요한 그러나, 경 막내 대금의 다른 방법에 비해, 척수강 내 바늘 주입 방법은 수많은 응용을 허용 최소 침습어떤 상당한 조직 손상을 일으키는 원인이 나 때문에 이물질의 주입에 면역 반응을 불러 일으키는없이 같은 동물. 그러나, 효능을 허용하는 바늘의 매우 정확한 타겟팅에 대한 기술 능력을 필요로한다. 여기, 우리는 시각적으로 구체적으로 요추 척수를 대상에 대한 성공의 최적의 속도를 달성하기위한 방법을 보여줍니다. 이 실험에서 선택 주사 부위는 L5 척추의 손상의 가능성을 최소화하기 척수 끝나는 곳에 가까운 L6 척추 칼럼 사이의 홈이다. 또한, 우리는 siRNA를을 사용하여 척수 유전자를 노크하는이 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>In Vivo-jetPEI</td><td>폴리플러스</td><td>201-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>산타크루즈</td><td>sc-36832</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Control siRNA-A</td><td>산타크루즈</td><td>sc-37007</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>항-&szlig;-Tubulin III 항체</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-WAVE1 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>AF5514</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>빠른 녹색 염료</td><td>시그마</td><td>F-7252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>백스터</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Dr&auml <td>설정 Isoflurane</td><td>; 게르 L&uuml; 벡</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>면도기</td><td>웰라</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>해밀턴 시린지 Gastight 1702</td><td>해밀턴</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 인치 13 mm 바늘</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 qRT-PCR 용 역방향 프라이머</td><td>시그마</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>WAVE1 역방향 프라이머 qRT-PCR</td><td>시그마</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart 필수 DNA 그린 마스터</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 sirna의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

이 보고서는 비 침습적 인 방법으로 급성 경막 바늘 주사의 기술, 카테터 주입, 즉 독립적 인 방법을 단계별로 설명합니다. 이 수술 기법의 기술적 한계는 손의 기교에있다. 주입은 특히 숙련 된 실험자에 대한 신속하고,이 기술과 조직의 혼란을 최소화하기 때문에 반복 주사가 가능합니다; 외국 도구 또한 면역 반응 (. 예 카테 테르)는 발생하지 않습니다, 따라서 더 많은 특정를 읽기 제공 척수 변조. 물질의 응용이 크게 척수의 타깃 영역에 한정되기 때문에, 약물은 큰 투여 량에 적용될 필요가 없으며, 다른 조직에 더 중요하게 원치 않는 효과는, 전신 전달 관찰로, 1 피할 수 2. 또한, 우리는 polyethylenim의 도움으로 핵산의 생체 내 형질과이 기술을 결합오프라인 (PEI)되는 약물의 전달뿐만 아니라 유전자, RNA, 단백질 변조기를 통해 척추의 기능을 연구하는 엄청난 다양성을 제공 시약 3.

성공적인 주입을 예시하기 위해, 우리는 성인 C57BL6 마우스 패스트 그린 FCF 염료 (나이 8-10 주)를 이용하여이 기술을 수행. 동물은 염료 확산하고 CO 2의 과다로 사망 할 충분한 시간을 제공하기 위해 주입 후 몇 분 동안 회복시켰다. 이어서, 척추 칼럼을 해부하고, 척수가 노출되었다. 확산 염색에 대응 puncta에 청색이 주사 부위를 표시. 척수 손상의 흔적이 기술 (그림 1A)의 최소 침습 성격을 확인하고, 볼 수 없었다. 주입 된 색소는 척수 주사 (그림 1B) 후 단 몇 분의 흉부 영역에 도달, rostrally 주사 부위에서 확산. 또한 경막 외 공간에서의 염료의 성공적인 주입은 척수의 스테인드 표면에 의해 입증 만 할 수없는 내부 (그림 1C). 생체 형질에...

이 보고서는 짧은 지속 가벼운 마취 쥐의 요추 척수의 siRNA의 지역화 된 형질에 대한 막내 바늘 구멍의 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

이 절차의 전반적인 목표는 척수 내로의 정맥 내 투여를 통해 IRNA를 국소적으로 적용하는 것입니다. 이는 먼저 최적의 I-R-N-A-P-E-I 복합체 시약을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 정맥 내 주입을 위해 마우스를 준비하는 것입니다.최소 15분 동안 배양한 후, SI RNA 혼합 용액을 Hamilton 주사기로 흡입합니다. 마지막 단계로 척수강 내 주사를 주의 깊게 수행하며, 최적의 다운레귤레이션을 보장하기 위해 24시간마다 주사를 반복합니다. 최종적으로 면역 블로팅 및 정량적 실시간 PCR을 수행합니다.PCR은 INA transfection을 통한 단백질 및 mRNA 수준의 성공적인 다운레귤레이션을 입증하는 데 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 인트라 카테터 또는 척수 주입보다 침습성이 낮다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 척수를 손상시키지 않고 척추 사이의 작은 틈을 통해 주입하는 데 필요한 정밀한 기술을 습득해야 합니다.SIR A 용액을 준비하려면 먼저 원하는 양의 SIR A를 멸균수로 희석하십시오. 그 다음, 피펫팅으로 섞어 10% glucose 용액으로 추가 희석합니다. PEI 용액을 만들려면 필요한 양의 PEI 시약을 멸균수로 희석하고, 다시 피펫팅으로 섞어 10% glucose 용액으로 추가 희석하십시오.다음으로, Irna 용액을 PEI 용액에 한 번에 첨가하고 가볍게 볼텍싱한 후, 혼합 용액을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물이 배양되는 동안 척수강 내 주사를 위해 마우스를 준비합니다. 3% isoflurane으로 마우스를 마취시킨 후, 꼬리 기저부 근처의 털을 약 2cm² 정도 깎아내고 주사 부위를 알코올로 소독합니다. 그런 다음 시술 중 isoflurane을 계속 투여할 수 있도록 마우스를 노즈콘(nose cone)에 고정하고 isoflurane 농도를 1.5%로 낮춥니다. 30G 0.5인치 바늘이 장착된 25µL Hamilton 시린지를 사용하여, 5~10µL를 주사할 수 있을 만큼의 irna PEI 용액을 흡입합니다.다음으로, 가장 돌출된 극돌기인 L6를 찾습니다. L6 바로 윗부분을 부드럽게 눌러 척주를 고정하되, 전체 신체를 압박하지 않으면서 극돌기가 느껴질 정도의 압력만 가합니다. 그 다음 손톱을 사용하여 L5와 L6 척추 사이의 홈을 찾습니다.이제 L5 및 L6 척추 사이의 홈에 바늘을 조심스럽게 삽입하고, 바늘이 경막하 공간에 성공

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서...

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

출처: Tadokoro, T., et al. 성인 마우스에서 연하 아데노 관련 바이러스 9(AAV9) 벡터 전달. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 마우스의 척수에 유전자 전달을 위한 연막하 주입 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 경막을 노출시키고, 연막을 천공하고, 형광 단백질 발현 유전자를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)를 연막하 공간에 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 및 회복 후 바이러스는 척수 세포의 유전자 발현을 촉진하여 표적 유전자 발현을 연구할 수 있습니다.

유전자 발현을 평가하기 위한 마우스 척수에서 연막하 유전자 전달

출처: Li, D., et al. 성인 마우스에서 재조합 아데노 관련 바이러스의 직접 척수강내 주사. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 깨어 있는 마우스의 뇌척수액(CSF)에 아데노 관련 바이러스(AAV)를 척수강내 주사하는 절차를 보여주며 주사기 준비, 척추 정렬 및 정확한 바늘 삽입을 다룹니다. 이 방법은 표적 유전자 전달을 검증하여 CNS 치료의 잠재력을 뒷받침합니다.

중추신경계 질환 치료를 위한 마우스 모델에서 바이러스의 척수강내 전달

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

여기에서는 설치류 좌골 신경의 슈반 세포(SC)로 유전자를 전달하는 생체 내 기술을 제시합니다. 이 간단한 기술은 수초성 SC의 발달 및 유지와 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

여기에 우리가 작은 동물에 게 효율적인 adeno 관련 바이러스 전달 되도록 하 여 중앙에서 변환 효율 예측 점수 시스템 구축 바이러스 솔루션에서 1 %lidocaine 염 산 염을 사용 하 여 직접 intrathecal 사출 기법 제시 lidocaine에 의해 유도 된 과도 함의 정도 따라 신경 시스템.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

여기서, 우리는 척추의 요추 내 공간에 카테터를 이식하여 쥐 중추 신경계에 약물을 전달하는 방법을 설명합니다. 우리는 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 전달에 초점을 맞추고, 이 방법은 뿐만 아니라 다른 치료 양식의 전달에 적합 하지만.

쥐 중추 신경계에서 안티 센스 올리고 뉴클레오티드의 내 전달

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

요추 척추내 주사는 중추 신경계에 유전자 요법을 전달하기 위한 번역적으로 관련된 투여 경로를 나타냅니다. 신생아, 청소년 및 성인 마우스와 쥐의 요추 척추 내 주사에 대한 이 포괄적이고 표준화된 프로토콜은 연구자들이 전임상 유전자 치료 연구에 이 기술을 채택하도록 안내하는 것을 목표로 합니다.

마우스와 쥐에서 중추 신경계 표적화를 위한 유전자 치료 벡터의 요추 내 주입

이 글에서는 성체 마우스에서 CNS 표적 치료제의 테스칼 내 전달 방법을 자세히 설명하며, 프로토콜의 정확성과 반복 주사 허용에 중점을 둡니다. 이 연구에는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 SOD1-ALS 모델 마우스에서 돌연변이 SOD1 발현을 감소시킨 검증 연구 결과가 포함되어 있어, 신경퇴행성 질환 전임상 연구에서 이 접근법의 유용성을 뒷받침합니다.

SOD1-ASO의 요추 수막내 주사, 인간 SOD1-G93A ALS 마우스에서 정밀한 중추신경계 표적 지정과 예측 효능을 위한 방법

학습하세요 마우스 요추 척수에 비침습적 경막내 주사를 통한 siRNA 국소 전달 및 유전자 넉다운 기법. 이 방법은 신경과학 연구에서 유전자 기능을 효율적으로 연구할 수 있게 합니다.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

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