깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

다음 실험의 전반적인 목표는 담배 잎 표피 세포에서 GFP 태그가 지정된 리포터의 일시적인 유전자 발현을 관찰하는 것입니다. 이것은 먼저 엽록체와 과산화소체에서 발현될 DNA 구조를 설계함으로써 달성됩니다. 그런 다음 PCR 증폭 및 Gibson 어셈블리를 사용하여 구축됩니다.

다음으로, 유전자 총을 사용하여 구축물을 담배 잎 표피 세포에 전달합니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사에 의한 담뱃잎의 이미징은 엽록체와 과산화소체에서 GFP 발현을 보여줍니다. 고아한 클로닝과 같은 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은 제한 효소를 요구하지 않다는 것, 그러므로, PCR에 의해 증폭될 수 있는 어떤 순서든지 복제될 수 있습니다.

유전자 설계의 유연성으로 인해 이러한 기술의 적용은 더 큰 규모로 확장됩니다. 농업 식물의 유전 공학 최종 단백질 발현을 위해 식물 세포 내의 부위를 결정하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다. 이 연구의 목표는 엽록체, 과산화소체 및 세포질에 대한 발현을 목표로 하는 것입니다.

다음으로, 표현식 구문을 디자인합니다. 구조체는 단일 플라스미드 내에 promoter, detectable gene 및 terminator를 포함해야 합니다. 이 경우, 구성적 프로모터 P 말단 컵 2는 GFP의 발현을 유도하고, 그 다음에는 Nolene Synthe, terminator 또는 nos t가 이어집니다.

이 실험에서는 엽록체 및 과산화소체에서 발현하기 위해 일련의 태그, trit 태그, 1, 2 및 3 발현 말단 말단을 테스트 할 것입니다. Gibson 조립 방법은 이중 가닥 DNA의 말단을 부분적으로 소화하고 인접 DNA 염기쌍의 상보적 염기쌍의 어닐링을 용이하게 하기 위해 미리 만들어진 혼합물에서 여러 효소의 작용에 의존합니다. 최종 구조에는 Gibson 조립 전에 4개의 PCR 반응에서 증폭해야 하는 3개 부품이 있습니다.

첫 번째 및 두 번째 반응은 GFP NOS T와 cany resistance marker를 포함하는 8, 000 염기쌍 플라스미드 벡터인 PORE를 증폭합니다. resistance marker는 이 큰 DNA를 PCR이 더 쉽게 증폭되는 두 개의 작은 template으로 나눌 수 있는 좋은 지점입니다. 세 번째 반응은 프로모터 P 말단 컵 2를 증폭하고, 네 번째 반응은 각 조각 사이에 50개의 염기쌍 중첩이 있도록 원숭이 디자인, 베이스에 대한 구성 베이스와 같은 인실리코 설계 소프트웨어를 사용하여 트라이액 1을 증폭합니다.

PCR용 프라이머를 주문할 경우, 각 방향에 25개의 염기쌍을 프라이머로 하여 50개의 염기쌍이 겹치는 것을 사용할 수 있으며, PCR을 실시하여 각 성분을 증폭한 후 PCR 산물을 따로 정제하여 증류수 탈이온수에 희석합니다. PCR 템플릿이 제한 효소 DPN을 사용한 대장균 처리의 미니 프렙인 경우 오염 템플릿 DNA를 제거합니다. 다음으로, 각 DNA 조각의 농도를 측정합니다.

대조군을 포함하여 조립할 각 구조체에 대해 벡터 농도를 마이크로리터당 약 150나노그램으로 조정하고, 냉동고에서 Gibson Assembly 혼합물의 15마이크로리터 부분 표본을 꺼내 얼음에서 해동합니다. 온라인 오픈 소스 tool@gibbon 사용합니다. org, 각 단편의 등몰 양에 대한 부피를 결정합니다.

각 단편의 계산된 부피를 15마이크로리터 Gibson 혼합물에 추가합니다. 또한 벡터 DNA의 대조군을 단독으로 준비합니다. 각 반응의 총 부피는 20마이크로리터여야 합니다.

필요한 경우 물을 사용하여 볼륨을 조정하십시오. 튜브를 섭씨 50-55도에서 30-60분 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.

섭씨 영하 80도의 냉동고에서 200마이크로리터의 염화칼슘 유능 대장균을 시판하는 제제가 들어 있는 마이크로 퍼지 튜브를 제거하고 손으로 약간 데웁니다. 그런 다음 20 마이크로 리터의 반응을 모두 대장균에 첨가하십시오. 배양물을 얼음 위에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 42도의 수조에 옮기고 60초 동안 열 충격을 가합니다.

전기 호환 셀을 사용하지 마십시오. 상대적으로 높은 염 농도와 낮은 DNA 농도로 인해 세포가 형질전환 후 아크를 일으킬 수 있습니다. 배양액을 2분 동안 ICE에 다시 넣은 다음 750마이크로리터의 SOC 또는 LB 배지를 바르고 섭씨 37도에서 30분 동안 회복시킵니다.

다음 플레이트, 캐니 또는 기타 적절한 항생제와 함께 LB 플레이트의 혼합물을 섭씨 37도에서 밤새 배양하고 염기서열분석을 통해 10개의 콜로니를 스크리닝합니다. 이 방법은 기존의 결찰 기반 클로닝보다 더 높은 배경과 더 많은 수의 비표적 재조합 이벤트를 초래할 수 있습니다. 유전자 총을 사용한 담배의 생체 형질주입은 이전에 JoVE에 기술되어 있습니다.

여기에서는 이전 프로토콜과의 주요 단계 및 차이점을 검토합니다. 구조체를 증폭하고 분리한 후, woods와 zeto의 JoVE 기사에 설명된 대로 유전자 총 총알을 준비하고 Nico Tania Benham Miana 담배 잎 표피 조직의 형질 주입을 위해 유전자 총에 로드합니다. 3-5개월 된 식물의 기부에 가까운 큰 잎을 선택하십시오.

적절한 눈과 귀 보호구를 착용하고 15cm 페트리 접시에 젖은 종이 타월 위에 바닥이 위로 향하게 조심스럽게 놓습니다. 유전자 총의 헬륨 압력을 200에서 250 PS로 설정합니다. 나는 잎의 아래쪽에 있는 갈비뼈 사이, 약 3-5cm 위에 있는 갈비뼈 사이에 유전자 총을 조심스럽게 조준한다. 안전을 풀고 입자를 잎에 전달합니다.

나뭇잎의 같은 위치에 각 총알을 두 번씩 사용합니다. 다른 위치로 이동하여 잎이 폭발하면 프로세스를 반복하고 버리고 새 잎을 시작합니다. 잎의 단단함에는 나이, 수분 등과 같은 성장 조건으로 인해 약간의 차이가 있습니다.

모든 샷이 전달된 후 잎을 덮고 벤치의 어두운 조명에서 2-3일 동안 보관하십시오. UV 형광이 장착된 해부 현미경으로 잎을 검사하고 GFP를 발현하는 개별 세포를 검색합니다. GFP를 발현하는 세포가 발견되면 해부 가위를 사용하여 잎의 5-10mm 부분을 조심스럽게 추출합니다.

각 잎 조각을 약 200마이크로리터의 0.1%Triton X 100이 들어 있는 깊은 우물 현미경 슬라이드의 우물에 즉시 담그십시오. 세제는 표면에 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 도움이 되며, 딥 웰 현미경 슬라이드는 적절한 필터와 40배 침수 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 더 큰 조직 이미징 영역 이미지 셀을 허용합니다. 이 연구에서는 세 가지 다른 GFP 소기관 표적 구조를 untag GFP 및 루비와 비교했습니다. 코그.

GFP 컨포칼 현미경 검사법은 태그가 지정되지 않은 GFP가 발현된 대조 실험에서 일시적으로 형질전환된 단일 세포에서 GFP 형광을 검출하는 데 사용되었습니다. 형광은 핵과 세포질에서만 관찰되지만 엽록체에서는 관찰되지 않으며, 엽록체는 엽록체만 Rubis Oag로 형질주입된 세포의 예에서 볼 수 있듯이 엽록소의 적색 자가형광으로 식별됩니다. GFP 구조체 GFP는 대형 소기관에서 발현되었습니다.

셀은 흰색 윤곽선으로 표시됩니다. 노란색은 엽록소와 함께 작제물의 공동 국소화 영역을 나타내며, 이는 작제물이 엽록체를 표적으로 한다는 것을 나타내며, 엽록소, 주변부, 세포질 및 과산화소체로 여겨지는 작은 반점 세포 소기관에서 볼 수 있는 triag one transfected cell GFP 발현의 이미지에서 볼 수 있습니다. 마찬가지로, triag two transfection된 세포는 엽록체 세포질에서 GFP를 발현하고 과산화소체 triag three는 엽록체 염기서열의 낮은 복잡성 영역 내에 내장된 과산화소체 신호로 구성되며 엽록체와 과산화소체에만 국한됩니다.

이 셀은 다른 리프 레이어에 있습니다. 이 그림은 전형적인 담배 잎 표피 세포의 구획에서 관찰된 발현을 요약한 것입니다. 세포 내의 상대적인 크기와 위치를 보여주고 유전자 총 형질주입 및 컨포칼 현미경을 통해 관찰된 상대적 발현 수준을 보여줍니다.

untag GFP는 세포질과 핵에 국한되고, PIMT 2개의 GFP 제어는 엽록체 및 triag 1 GFP, triag 2 GFP에 국한되며, Triag 3G FP는 예상대로 엽록체 및 과산화소체에 국한되며, 이 비디오를 시청한 후에는 Gibson 어셈블리로 플라즈마를 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 담배 잎에 그것을 지저분하게 배달하고, 3 일 안에 GFP 표정을 관찰하십시오. 이 절차를 시도하는 동안 Gibson 어셈블리에 벡터 DNA 마이크로리터당 150나노그램을 사용하고 최종 DNA 구조를 마이크로리터당 1500나노그램을 사용하여 유전자 총 총알을 만드는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라 아그로박테리움 트랜스펙션(agrobacterium transfection)과 같은 다른 방법을 수행하여 일시적이 아닌 안정적인 유전자 발현을 얻을 수 있습니다.