깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

다음 실험의 전반적인 목표는 담배 잎 표피 세포에서 GFP 태그 리포터의 일시적 유전자 발현을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 엽록체와 퍼옥시좀에서 발현될 DNA 컨스트럭트를 설계합니다. 이후 PCR 증폭과 Gibson assembly를 이용하여 해당 컨스트럭트를 제작합니다.

다음으로, 진 유건(gene gun)을 사용하여 구축물을 담배 잎 표피 세포에 전달합니다. 최종적으로, 공초점 현미경으로 담배 잎을 이미징하면 엽록체와 퍼옥시좀에서 GFP 발현이 확인됩니다. 기존의 고전적 클로닝과 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 제한 효소가 필요하지 않다는 것이며, 따라서 PCR로 증폭 가능한 모든 서열을 클로닝할 수 있습니다.

유전적 설계의 유연성 덕분에 이러한 기술의 응용 범위는 더 큰 규모로 확장될 수 있습니다. 농업 식물의 유전 공학의 경우, 먼저 식물 세포 내에서 최종 단백질 발현이 일어날 부위를 결정함으로써 이 프로토콜을 시작하십시오. 본 연구의 목표는 엽록체, 퍼옥시좀 및 세포질로 발현 위치를 지정하는 것입니다.

다음으로, 발현 컨스트럭트를 설계합니다. 컨스트럭트는 단일 플라스미드 내에 프로모터, 검출 가능 유전자, 그리고 터미네이터를 포함해야 합니다. 이 경우에는 구성적 프로모터 P end cup two가 GFP의 발현을 유도하며, 그 뒤로 Nolene Synthe 터미네이터 또는 nos t가 이어집니다.

본 실험에서는 엽록체 및 퍼옥시좀 내 발현을 위해 GFP의 C-말단에 발현된 일련의 trit tag(하나, 둘, 셋)를 테스트할 것임을 유의하십시오. Gibson assembly 방법은 미리 제조된 혼합물 내 여러 효소의 작용을 통해 이중 가닥 DNA의 말단을 부분적으로 소화하고, 인접한 DNA 서열의 상보적 염기쌍 어닐링을 촉진하는 원리를 이용합니다. 최종 컨스트럭트는 세 부분으로 구성되며, Gibson assembly 이전에 네 번의 PCR 반응을 통해 증폭되어야 합니다.

첫 번째와 두 번째 반응에서는 GFP NOS T와 cany 저항성 마커를 포함하는 8,000 base pair 크기의 플라스미드 벡터인 PORE를 증폭합니다. 저항성 마커는 이 거대한 DNA를 PCR 증폭이 더 용이한 두 개의 더 작은 템플릿으로 나누기에 적합한 지점입니다. 세 번째 반응에서는 프로모터 P end cup two를 증폭하고, 네 번째 반응에서는 ape design과 같은 in silico 설계 소프트웨어를 사용하여 triag one을 증폭하며, 각 조각 사이에 50 base pair의 중첩 부위가 있도록 base-by-base로 구조물을 설계합니다.

PCR용 프라이머를 주문할 때, 50bp 오버랩 부위를 각 방향으로 25bp씩 프라이머로 사용할 수 있습니다. 각 구성 성분을 증폭시키기 위해 PCR을 수행한 후, PCR 생성물을 각각 정제하고 탈이온 증류수에 희석합니다. PCR 템플릿이 e coli mini prep이었던 경우, 제한 효소 DpnI로 처리하여 오염된 템플릿 DNA를 제거합니다. 다음으로, 각 DNA 조각의 농도를 측정합니다.

조립할 각 컨스트럭트(대조군 포함)의 벡터 농도를 약 150 nanograms per microliter로 조정하고, 냉동고에서 Gibson Assembly mix 15 microliter 분취액을 꺼내 얼음 위에서 해동합니다. 온라인 오픈 소스 도구인 @gibbon.org를 사용하여 각 단편의 등몰량에 해당하는 부피를 결정하십시오.

계산된 부피의 각 단편을 15 µL의 Gibson 믹스에 추가합니다. 또한 벡터 DNA만 포함된 대조군을 준비합니다. 각 반응의 총 부피는 20 µL가 되어야 합니다.

필요한 경우 물을 사용하여 부피를 조절하십시오. 튜브를 50~55 °C에서 30~60분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 튜브를 다시 얼음에 놓으십시오.

200 µL의 상용 calcium chloride competent e coli가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 -80 °C 냉동고에서 꺼내 손으로 약간 가온합니다. 그다지 20 µL의 반응액 전체를 e coli에 첨가합니다. 배양액을 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후, 42 °C 항온수조로 옮겨 60초 동안 열 충격을 줍니다.

전기 천공용로 능력을 가진 세포(electro competent cells)를 사용하지 마십시오. 상대적으로 높은 염 농도와 낮은 DNA 농도로 인해 형질전환 후 세포에 아크(arc) 현상이 발생할 수 있습니다. 형질전환 후 배양액을 2분 동안 얼음에 두었다가, 750 µL의 SOC 또는 LB 배지를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 회복시키십시오.

다음으로, LB 플레이트에 혼합물을 도말하고 캔마이신(cany) 또는 다른 적절한 항생제를 첨가하여 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 10개의 콜로니를 선택하여 시퀀싱으로 스크리닝합니다. 이 방법은 전통적인 라이게이션 기반 클로닝보다 백그라운드가 높고 비표적 재조합 사건의 수가 더 많을 수 있음에 유의하십시오. 진공총을 이용한 담배의 생체 내 형질전환 방법은 이전에 JoVE에서 설명된 바 있습니다.

여기서는 이전 프로토콜과 비교하여 주요 단계 및 차이점을 검토합니다. 컨스트럭트를 증폭하고 분리한 후, Woods와 Zeto의 JoVE 논문에 설명된 대로 유전자 총(gene gun) 불렛을 준비하여 니코티아나 베남미아나(Nicotiana benhamiana) 담배 잎 표피 조직에 형질전환시키기 위해 유전자 총에 장입합니다. 3~5개월 된 식물의 기부 근처에 있는 큰 잎을 선택하십시오.

적절한 안구 및 청력 보호구를 착용한 상태에서, 15 centimeter 페트리 접시의 젖은 종이 타월 위에 잎의 뒷면이 위로 향하도록 조심스럽게 놓습니다. 유전자 총의 헬륨 압력을 200 내지 250 PSI로 설정합니다. 유전자 총을 잎 뒷면의 잎맥 사이에 3 내지 5 centimeter 정도 높이로 조심스럽게 조준합니다. 안전장치를 해제하고 잎에 입자를 주입합니다.

각각의 불렛을 잎의 동일한 위치에 두 번씩 사용하십시오. 잎이 터진 경우, 해당 잎을 폐기하고 새 잎으로 시작하여 다른 위치에서 동일한 과정을 반복하십시오. 연령, 수분 함량 등 생장 조건에 따라 잎의 강도에 어느 정도 차이가 있을 수 있습니다.

모든 주입이 완료된 후, 잎을 덮어 벤치의 낮은 조명 아래에서 2~3일 동안 보관합니다. UV 형광 장치가 장착된 해부 현미경으로 잎을 관찰하여 GFP를 발현하는 개별 세포를 찾습니다. GFP 발현 세포가 발견되면, 해부 가위를 사용하여 잎의 5~10 mm 구역을 조심스럽게 추출합니다.

각 잎 조각을 0.1% Triton X 100 약 200 µL가 들어 있는 딥웰 현미경 슬라이드의 웰에 즉시 담급니다. 세제는 표면에 기포가 생기는 것을 방지하며, 딥웰 현미경 슬라이드를 사용하면 적절한 필터와 40x 수침 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 더 넓은 조직 영역의 세포 이미지를 촬영할 수 있습니다. 본 연구에서는 세 가지 서로 다른 GFP 소기관 표적 컨스트럭트를 태그가 없는 GFP 및 rubisco와 비교하였습니다.

태그가 없는 GFP가 발현된 대조군 실험에서 일시적으로 형질전환된 단일 세포의 GFP 형광을 검출하기 위해 GFP 공초점 현미경을 사용하였습니다. 형광은 핵과 세포질에서만 관찰되며, 엽록체에서는 관찰되지 않습니다. 엽록체는 엽록체 전용 Rubis Oag가 형질전환된 세포의 본 예시에서 보는 바와 같이 엽록소의 붉은 자가형광으로 식별됩니다. GFP 컨스트럭트 GFP는 거대 세포소기관에서 발현되었습니다.

세포는 흰색 실선으로 표시되어 있습니다. 노란색은 구축물(construct)과 엽록소가 공국소화(colocalization)된 영역을 나타내며, 이는 이 triag one 형질전환 세포 이미지에서 보는 바와 같이 구축물이 엽록체로 표적화되었음을 의미합니다. GFP 발현은 엽록체, 주변부, 세포질 및 페록시좀으로 추정되는 작은 점상의 소기관에서 관찰됩니다. 마찬가지로, triag two 형질전환 세포 또한 엽록체, 세포질 및 페록시좀에서 GFP를 발현합니다. 엽록체 서열의 저복잡성 영역(low complexity region) 내에 페록시좀 신호가 삽입된 triag three는 오직 엽록체와 페록시좀에만 국소화되었습니다.

이 세포는 다른 잎 층에 있음에 유의하십시오. 이 그림은 전형적인 담배 잎 표피 세포의 구획에서 관찰된 발현을 요약하여 보여줍니다. 세포 내의 상대적 크기와 위치, 그리고 유전자 총(gene gun) 형질전환 및 공초점 현미경을 통해 관찰된 상대적 발현 수준이 표시되어 있습니다.

태그가 없는 GFP는 세포질과 핵에 위치하며, PIMT 두 GFP 대조군은 엽록체에 위치하고, triag one GFP, triag two GFP 및 Triag 3G FP는 예상대로 엽록체와 퍼옥시좀에 위치함에 유의하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 Gibson assembly를 통해 플라스미드를 구축하고, 이를 담배 잎에 탄환형으로 전달하며, 3일 이내에 GFP 발현을 관찰하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, Gibson assembly에는 150 ng/µL의 벡터 DNA를 사용하고, 유전자 총(gene gun) 탄환을 제작하기 위해서는 최종 DNA 구축물의 농도를 1500 ng/µL로 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 일시적 발현이 아닌 안정적인 유전자 발현을 얻기 위해 아그로박테리움 형질전환과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.