뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 : 전의 VIVO 접근

이 절차의 전반적인 목표는 신경 세포 표면 단백질의 급성 변화를 정량화하는 것입니다. 생체 외 뇌 절편 준비에서 이는 먼저 생존 가능한 급성 뇌 절편을 준비함으로써 이루어집니다. 다음으로, 조각은 관심 약물로 처리됩니다.

그런 다음 세포 표면 단백질을 막 임페리안 토네이션 시약을 사용하여 표지합니다. 마지막으로, 표면 비오틴화 단백질은 연쇄상구균 avid 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 분리됩니다. 궁극적으로, 면역 플로팅(immuno plotting)은 약물 처리 후 단백질 표면 발현의 변화를 정량화하는 데 사용됩니다.

세포 기반 배양법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이종 발현 시스템이나 1차 신경 세포 배양이 아닌 현장에서 신경 단백질 이동을 검사한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 실행 가능한 브랜드 슬라이스를 준비하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 그래. 뇌 절편을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 따라 신선한 1 x 인공 뇌척수액 또는 A CSF 및 자당을 만들어 A CSF 또는 S-A-C-S-F를 보충하는 것으로 시작합니다.

ICE의 S-A-C-S-F는 95%의 산소와 5%의 이산화탄소를 사용하여 얼음 위에서 20분 동안 거품을 일으켜 완충액을 산소로 포화시킵니다. P 30-38 쥐를 경추 탈구와 참수로 희생시키고 뇌를 빠르게 제거한 후 진동하는 마이크로톰을 사용하여 미리 냉각된 산소가 공급된 S-A-C-S-F에 넣습니다. 관심 영역에 300미크론의 뇌 절편을 만들고 원하는 경우 오른쪽 반구와 왼쪽 반구를 분리하여 각각 대조군 및 실험 절편으로 사용합니다.

화염 광택 페이스트 피펫을 사용하여 산소가 함유된 CSF가 포함된 메쉬 바닥 홀딩 챔버로 슬라이스를 옮깁니다. 슬라이스가 섭씨 31도에서 40분 동안 지속적이고 부드러운 거품과 함께 회복되도록 합니다. 배양 후 슬라이스를 개별 메쉬 챔버로 옮깁니다.

24 개의 우물에 담아 일정한 거품을 일으키면서 예열 산소 A CSF에서 슬라이스를 세 번 씻습니다. 화합물을 테스트하는 경우 10 x 농축 약물 부피의 10분의 1을 추가하고 원하는 온도의 수조에서 플레이트를 부드럽게 흔든 후 부드럽게 뒤집어서 혼합합니다. 얼음처럼 차가운 A CSF를 사용하여 슬라이스를 세 번 세척하여 빠르게 식히고 에이트 표면 단백질을 구입합니다.

설파 밀리리터당 1.0mg의 신선한 N-H-S-S-S 비오틴을 차가운 얼음 A CSF에 넣고 슬라이스에 용액 0.75ml를 넣고 얼음에서 45분 동안 배양합니다. 얼음처럼 차가운 A CSF를 사용하여 슬라이스를 세 번 빠르게 씻은 후, 얼음 위에 얼음처럼 차가운 A CSF에서 10 분 동안 배양 한 다음 얼음 차가운 슬라이스 담금질 버퍼를 사용하여 슬라이스를 세 번 씻고 0.75 밀리리터의 슬라이스로 배양하고, 얼음에서 각각 25 분 동안 버퍼를 두 번 담금질하여 무료 suo N-H-S-S-S 비오틴을 담금질하여 조직 용해물을 준비합니다. 얼음처럼 차가운 CSF로 슬라이스를 세 번 씻은 후 불에 광택을 낸 파스티 피펫을 사용하여 각 슬라이스를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

200GS에서 1분 동안 원심 주입으로 슬라이스를 부드럽게 펠릿화하고 나머지 A CSF를 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 400마이크로리터의 얼음을 차갑게 넣고 파이를 찢고 P 200 파이펫을 사용하여 위아래로 한 번 파이펫팅하여 조직을 분해하여 용해를 완료합니다. 해리된 조직을 새로운 관으로 옮기고 18, 4°C에서 15분 동안 000Gs에서 회전 원심분리기로 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

세포 파편을 펠렛화하기 위해 비오틴화된 단백질을 분리하고 면역 블롯으로 분석합니다. 텍스트 프로토콜에 따르면, 신경 세포 도파민 수송체는 세포주에서 PKC 활성화에 반응하여 내재화됩니다. 다양한 세포주 및 발현 시스템에서 PKC 유도 도파민, 활성 수송체 또는 부채 표면 손실을 입증하는 많은 보고에도 불구하고 배양된 도파민 뉴런에서 이러한 발견을 확인하는 것은 어려웠으며, 마우스 stri AAL 슬라이스를 사용하여 성체 도파민 뉴런에서 PKC 활성화에 대한 반응으로 dat가 내재화하는지 여부를 직접 테스트했습니다.

여기에서 우리는 세포 표면 PKC 활성화에서 총 부채의 81.4 플러스 또는 마이너스 5.8%로 바질 또는 차량 처리 조건에서 마우스 선조체에서 강력한 DA 표면 발현을 감지했습니다. Myra State 13 acetate는 dat 표면 발현을 총 부채의 60.8 플러스 마이너스 5.2%로 현저히 감소시켰으며, 이는 원형질막에서 부채의 약 30% 손실에 해당합니다. 대조적으로, 총 티로신 하이드록실라제의 1.6 플러스 마이너스 0.4%만이 세포 내 국소화와 일치하게 비오틴화되었으며 토네이션 시약이 도파민 뉴런의 세포 내부에서 배제되었음을 확인했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 온전한 신경 세포 말단에서 플러스 막 단백질 발현의 변화를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.