성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 myos 구를 생성하는 것입니다. EB는 인간 배아 줄기 세포의 골격근 세포로 구성된 구조와 같습니다. 이것은 Baf 60 C의 렌티바이러스 감염에 의해 세포를 재프로그래밍함으로써 달성되며, 절차의 두 번째 단계는 동일한 세포를 두 번째 바이러스인 myo D 렌티바이러스로 감염시키는 것입니다.

그런 다음 감염된 세포는 혈청 기반 배양 배지에서 5일 동안 EB와 같은 응집체를 형성하도록 유도됩니다. 그런 다음 EB 배지를 무혈청 분화 배지로 교환하고 응집체를 2주 더 성장시켜 마이오스 구체(myos sphere)로 만듭니다. 궁극적으로 면역형광은 OCT 포매된 응집체의 단면을 시각화하는 데 사용됩니다.

이 기술의 주요 장점은 중간엽 또는 중배엽 전구 세포에서 유래 한 골격근 세포의 높은 수율 퇴행이며, 이는 사실 분류를 필요로하지 않으므로 3 차원 배양 시스템과 호환됩니다 6 개의 웰 플레이트에서 인간 배아 줄기 세포에 감염되기 전날, 인간 배아 줄기 세포 복제 및 회수 보충제를 1000 x에서 배지에 추가하여 다음 2 마이크로 몰의 최종 농도를 제공합니다 일 인간 배아 줄기 세포를 High titer bath 60 CGFP 렌티 바이러스로 감염시킵니다. 먼저 1ml의 tripe를 첨가하고 플레이트를 5분 동안 배양하여 세포 웰을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 그런 다음 현탁액을 모아 15mm 튜브로 옮깁니다.

준비된 배지 9ml를 추가하고 1 밀리리터의 SIR까지 기다리는 동안 5 분 동안 1, 200 RPM으로 셀을 회전시킵니다. 폴리 브레인을 밀리리터당 6마이크로그램의 최종 농도로 첨가하고 인간 배아 줄기 세포 회수 보충제를 2마이크로몰로 첨가합니다.

그런 다음 이 용액에 세포를 재현탁시키고 6개의 웰 낮은 부착 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 이제 1 억 명의 감염 횟수로 농축 된 수조 60 C 바이러스를 추가하십시오. 플레이트를 바이러스와 함께 3시간 동안 배양합니다.

그런 다음 세포를 모아 두 개의 마트리겔 코팅된 플레이트 웰로 나눕니다. 각 플레이트에 2ml의 mt, SIR을 넣고 2개의 마이크로몰 보충제를 추가한 다음 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날 미디어를 새 미디어로 교체합니다.

세포는 감염이 시작된 지 48시간이 지나면 이미 뭉친 것으로 보입니다. 감염 효율을 평가하기 위해 형광을 확인합니다. 세포가 80% Confluence가 될 때까지 매일 배지 변화를 계속한 다음 동일한 프로토콜을 사용하여 세포와 myo D 바이러스를 세포로 해리합니다.

감염된 세포가 이 성장 지점 전날 80% 합류점에 도달할 때까지 매일 중간 변화를 유지합니다. 감염된 세포를 ME'S 플레이트로 통과시키기 위해 제곱센티미터당 1000개의 세포로 마트리겔 코팅된 플레이트에 MES를 플레이트합니다. 다음 날.

트립 ALI를 사용하여 세포를 해리하고 세포를 15ml 튜브로 세포로 이동합니다. 9ml의 인간 배아 줄기 세포 배지를 넣고 원심분리합니다. 5분 동안 1, 200RPM을 추가합니다.

Resus, 펠릿화된 세포를 6밀리리터의 신선한 인간 배아 줄기 세포 배지에 현탁시킵니다. 이제 두 개의 mes 플레이트에서 배지를 제거하고 감염된 세포를 추가합니다. 며칠 동안 세포를 배양합니다.

한 번, 80% 합류점을 추가합니다. 모든 매체를 제거하고 콜라겐 분해 효소 4 밀리리터를 추가합니다. 5분 후 섭씨 37도의 콜라겐 분해 효소에 밀리리터당 1mg을 첨가합니다.

콜라겐분해효소를 1밀리리터의 인간 배아 줄기세포 배지로 교체합니다. 그런 다음 해부 현미경으로 10ml 피펫 팁을 사용하여 집락을 긁어내고 집락을 15ml 튜브로 옮기고 침전시킵니다. 3분 후, 상층액을 제거하고 인간 배아 줄기 세포 배지에 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 필로폰 플레이트에 1-4개의 비율로 세포를 플레이트합니다. 감염된 세포는 수가 많아야 하며 이 절차를 위해 양질의 군체를 형성해야 합니다. 각 웰에서 배지를 제거하고 콜라겐 분해 효소 1ml를 추가합니다. 4.

이전과 같이 밀리리터 농도당 1mg을 첨가하고 EB 배지로 대체하여 5분 후 콜라겐분해효소 반응을 일으킵니다. 그런 다음 재빨리 현미경을 사용하여 군체를 긁어냅니다. 10 밀리리터 피펫 팁을 사용하여 세포를 작은 세포 덩어리로 해리할 수 있습니다.

이러한 응집체를 15ml 튜브에 모으고 약 3분 동안 침전된 후 상층액을 제거하고 3ml의 EB 배지에 세포를 재현탁시킨 다음 모든 것을 6웰 낮은 부착 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 다음날 이 플레이트를 하룻밤 동안 배양하십시오. 큰 식민지 덩어리가 있는지 확인하십시오.

발견된 경우. 5mm 피펫에 몇 번 통과시켜 분해합니다. 부유 단일 세포가 많은 경우 침전을 통해 응집체를 수집하고 새로운 EB 배지로 교체하십시오.

배양 5일 후 격일로 배지를 교체하십시오. 세포 응집체를 모아 2ml의 PBS로 한 번 세척하여 세포가 정상 중력 하에서 침전되도록 합니다. 그런 다음 PBS를 3ml의 DM 배지로 교체하고 다음 15일 동안 배양 동안 세포를 동일한 플레이트 웰로 되돌립니다.

3일마다 배지를 교체하십시오. 이 시간 동안 중간권이 형성됩니다. 인간 배아 줄기 세포는 GFP 형광을 운반하는 bath 60 C에 감염되었습니다.

72시간 후, 세포는 사실로 분류되었습니다. BAF 60 C를 발현하는 세포를 약 75%co fluency로 성장시킨 후 myo D 렌티바이러스에 감염시켰습니다. 감염된 세포에서 외인성 유전자 발현은 정량적 real-time PCR에 의해 검출되었습니다.

단백질 수준에서의 발현 및 분포를 조사했습니다. 다음으로 GFP는 baf 60 C 발현에 해당하며, myo D 항체를 사용하여 myo D 발현을 확인했습니다. 인간 배아 줄기 세포가 응집체와 같은 EB를 형성하기 시작한 지 15일 후.

myos spheres의 일부는 OCT compound에 삽입되었으며 myogenic 및 myosin heavy chain markers에 대해 양성으로 염색된 단면을 절단했습니다. 10일째부터 myos spheres에서 산발적인 수축을 관찰할 수 있었습니다. 일부 myos 구체는 아마도 myos 구체 간의 융합으로 인해 다르거나 특이한 모양을 취했습니다.

이 기술은 다양한 근육 질환의 영향을 받는 환자의 만능 줄기 세포에서 근육 구체를 생성할 수 있기 때문에 질병 모델링 및 치료 분야의 연구를 발전시킬 것입니다. 이러한 이유로 myo spheres는 약물 세척 및 질병 발병에 적합한 disease in edition 모델을 제공합니다.