Name: 성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 골격근 전구세포를 생성하여 마이오스피어를 만드는 방법을. 이 기법은 고수율의 근육 세포를 제공하며 재생의학 연구에 활용됩니다.

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PLP는 샌포드 어린이 건강 연구 센터의 부교수 탐정이다. R01AR056712, R01AR052779 및 관절염 및 근골격계의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 및 피부 질환 (NIAMS), MDA와 샌포드 어린이 건강 연구 포상에서 P30의 AR061303 :이 작품은 PLP에 다음 교부금에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 프로젝트에서 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 연구 자금 조달에서 도움이되고 FP7 - 건강 - 2009 년 ENDOSTEM 241440 (수리 및 근육 조직의 유지를 위해 혈관 관련 줄기 세포와 근육 줄기 세포의 활성화) SA에 의해 지원되었다. CIRM의 교제.

인간 배아 줄기 세포의 1. 감염 이 프로토콜은 높은 역가 lentiviruses 인코딩 BAF60C 및 MyoD (13)를 필요로한다. 이러한 구조 요청에 따라 사용할 수 있습니다. <ol><li> 시작하기 전에 추천 <ol><li> 공급이없는 상태에서 감염 바이러스 흡수하는 동안 휴대 경쟁을 제거하기 (그림 2A)에 대한 감염, 플레이트 인간 배아 줄기 세포의 고효율을 보장하기 위해. 사실, MEFs는 인간 배아 줄기 세포에 비해 MyoD 매개 전환 능력이로 감염 악명 쉽다. 따라서, hESC의 문화에서 MEFs을 제거하면 감염 속도를 증가시킨다. </li><li> 그것은 감​​염의 높은 효율을 보장하기 위해 높은 역가 lentiviruses을하는 것이 좋습니다. 감염의 효율성을 개선 할 수있는 옵션은 &quot;감염 확인&quot;절에서 설명합니다. </li><li> 물론 각 1 ㎎ / ㎖ 리겔 1 ㎖를 추가하여 리겔 코팅 된 플레이트를 준비하고 최소 1 실온에서 시간 (또는 O를 남겨 / N 4 ° C에서 밀봉전날 준비하는 경우). </li></ol></li><li> 감염 절차 <ol><li> 감염 전날 <ol><li> 1000 X 희석 (2 mM의 최종 농도)에 매체에 HES 세포 복제 및 복구 보충을 추가합니다. </li></ol></li><li> 0 일 - BAF60C와 감염 참고 : 첫 번째 MyoD 감염 다음 BAF60C와 인간 배아 줄기 세포의 감염을 수행합니다. <ol><li> 37 ℃에서 5 분 동안 TrypLE 1 ㎖와 배양하여 단일 세포 현탁액의 식민지 14로 성장 인간 배아 줄기 세포의 6 잘 플레이트의 우물을 떼어 놓다 </li><li> 15 ML 튜브로 전송 서스펜션, 1,200 rpm에서 5 분 동안의 hESC 매체와 원심 분리기 15 ML을 추가합니다. </li><li> 원심 분리하는 동안, 1 mTeSR1의 ML, 폴리 브렌 (6 ㎎ / ㎖) 및 건강의 세포 복제 및 복구 보조 식품 (2 ㎜)에 추가하여 깨끗한 튜브에 감염 믹스를 준비합니다. </li><li> 하나의 C에서 다시 정지 세포 펠렛 (약 5 × 5 -1 X 10 6 세포onfluent 아니라 인간 배아 줄기 세포의) 플라스틱에 부착 세포를 방지하는 6 자 낮은 부착 판, 상 감염 믹스 플레이트 1 ㎖와. </li><li> 10 8 MOI에 BAF60C-IRES-GFP 바이러스를 추가하고 배양기에서 3 시간을 품다 </li><li> 바이러스를 함유하는 세포 현탁액을 수집하고이 마트 리겔 - 코팅 된 웰에 동등하게 나눈다. 그런 다음 각 웰 mTeSR1 + HES 세포 복제 및 복구 부록 2 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 O / N 두십시오. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 조심스럽게 바이러스를 포함하는 매체를 제거하고 mTeSR1and HES 세포 복제 및 복구 보충 2 ㎖로 대체합니다. 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 세포 응집이 시작됩니다. </li></ol></li><li> 둘째 날 - MyoD와 감염 <ol><li> 계속 진행하기 전에 감염의 높은 효율을 가지고 있는지 확인하기 위해 형광 현미경으로 세포의 형광 상태를 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 감염 확인 &quot;섹션을 참조하십시오이온 &quot;. </li><li> 세포가 합류점의 적어도 80 %에 도달 한 경우, 다음과 같이 진행; 그렇지 않으면 이전 절차로 추가 날을 기다립니다. </li><li> 매체를 제거하고 세포를 떼어 놓다 TrypLE 시약 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 알을 품다 </li><li> 설명 from1.2.2.2으로 반복 - 1.2.2.6 10 8 MOI에서 MyoD 바이러스를 추가. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> 조심스럽게 바이러스를 포함하는 매체를 제거하고 mTeSR1and HES 세포 복제 및 복구 보충 2 ㎖로 대체합니다. </li><li> 리겔에 플레이트 MEFs는 감염된 세포의 증식을 허용 다음날 2.5 × 10 10 / cm 2에서 판을 입혔다. </li></ol></li><li> 4 일 <ol><li> 매체를 제거하고 세포를 떼어 놓다 TrypLE 시약 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 알을 품다 </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송, 1,200 rpm에서 5 분 동안의 hESC 매체와 원심 분리기 15 ML을 추가합니다. </li><li> Remove 뜨는 hESC의 매체의 6 ㎖에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 각 웰 MEFs가 함유에 3 ㎖를 분배 1:2 분할의 비율로 MEFs 함유 6 - 웰 플레이트와 플레이트의 인간 배아 줄기 세포에서 매체를 제거합니다. 식민지 합류에 도달 할 때 팁, MyoD/BAF60C-infected 세포의 우물 중 일부는 예비 주식으로 액체 질소에 냉동 할 수 있습니다. 냉동 매체는 90 KOSR의 %와 10 %의 DMSO 플러스 2 ㎜ HES 세포 복제 및 복구 보충을 포함한다. 나머지 우물은 분화 프로토콜에 노출 될 수 있습니다 - 자세한 내용은 아래를 참조하십시오. 더 많은 세포가 더 myospheres을 생산하는 데 필요한 경우에는 다음과 같이 감염된 인간 배아 줄기 세포가 추가로 전파 할 수 있습니다 : </li><li> 매체를 제거하고 37 ℃에서 5 분 동안 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV의 1 ㎖로 배양 </li><li> 콜라게나 제 IV를 제거하고 hESC의 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 해부 현미경에서 10 ㎖의 팁 식민지 다 쳤어요. </li><li> coloni의 덩어리를 수집15 ML 튜브에 3 분 동안 침전 할 수 말이지. 그런 비율 1:4를 사용 MEFs 플레이트에 hESC의 매체와 플레이트에 뜨는,에 resuspend를 제거합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 감염 확인 <ol><li> 세포를 전파하는 동안,이 RNA 분석을 위해 수확 (주제 결과 참조), 각 단계에서 올바른 생체 상태를 반영 바이오 마커를 확인하기 위해 면역 형광에 의해 단백질 발현 분석을 수행 할 더 작은 규모로 감염된 세포를 플레이트에 추천. 고역가 lentiviruses 예상 감염된 세포의 백분율은 80 % 이상이어야한다. </li><li> 고성능을 보장하기 위해, 렌티 바이러스 벡터는 형광 선별 마커 및 / 또는 항생제 내성을 도입, 변형 될 수있다. BAF60C을 표현하는 우리의 렌티 바이러스 플라스미드는 GFP의 형광을 수행한다. </li><li> 형광 마커를위한 인간 배아 줄기 세포를 정렬. 감염의 낮은 효율의 경우 형광을 사용하는 것이 좋습니다BAF60C 바이러스를 발현하는 세포에 풍부하고 높은 역가 MyoD 바이러스 세포를 감염 (FACS - 정렬을) 정렬 ctivated 세포. <ol><li> 중간에있는 HES 세포 복제 및 복구 보충 정렬 전날를 추가합니다. </li><li> 정렬의 날 (0 일에서 설명합니다) TrypLE하여 세포를 떼어 놓다 및 FACS 튜브에 KO 교체 혈청 플러스 HES 세포 복제 및 복구 보조 식품의 세포를 재현 탁. </li><li> 정렬의 끝에서, 건강의 세포 복제 및 복구 보충을 추가 MEFs 플레이트에 KO 교체 혈청과 접시에있는 세포를 수집합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB와 같은 유도 및 분화 <ol><li> 유도 및 분화 과정 <ol><li> 0 일 - EB 유도 <ol><li> 잘 (그림 2C)에서 식민지의 높은 숫자를 가지고, BAF60C/Myod-infected 인간 배아 줄기 세포에서 분화를 시작하기 전에, 확인하십시오. </li><li> 각 웰의 연구에 대한emove 매체를, PBS로 세척하고 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV의 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 동안 품어 </li><li> 콜라게나 제를 제거하고 EB 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 해부 현미경으로 신속하게 기계적으로 10 ㎖의 끝으로 긁어 400 ~ 800 세포 집합체에 식민지를 떼어 놓다. </li><li> 15 ML 튜브에 식민지의 덩어리를 수집하고 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 뜨는을 제거, EB 매체의 3 ㎖에 다시 일시 중단하고 6 자 낮은 부착 판 잘 하나에 세포 현탁액을 전송합니다. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 진행하기 전에 콜로니 크기 및 세포 죽음을 확인한다. 큰 덩어리가있는 경우, 5 ML 피펫, 3 ~ 4 회 가볍게 피펫 팅에 의해 아래를 휴식. 세포의 죽음이 매우 높은 경우 (많은 부동 세포와 파편)는 중력에 의해 15 ML 튜브에 집계를 수집하여 매체를 대체하고 신선한 EB 매체의 3 ㎖로 격판 덮개를, 그렇지 않은 경우에는 다음과 같이 진행합니다. </li><li> 추가 1.5우물에 신선한 EB 매체의 ML </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 15 ML 튜브에있는 우물에서 집계를 수집하여 매체를 변경합니다. 그 2 분 동안 정착하자. </li><li> , 뜨는을 제거 신선한 EB 매체의 3 ㎖로 교체하고 같은 우물에 재배포. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> 우물에 신선한 EB 매체의 1.5 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 4 일 <ol><li> &quot;주 2&quot;의 설명에 따라 진행합니다. </li></ol></li><li> 5 일 - EB 같은 클러스터 (그림 2D)의 근원 성 차별. <ol><li> 2.1.3.1에 ​​설명 된대로 집계를 수집하고 PBS의 2 ㎖로 한 번 세척; 집계가 침전 할 수 있습니다. </li><li> PBS를 제거하고 DM 매체의 3 ㎖를 추가; 같은 우물에 접시. </li></ol></li><li> 6 일 - 20 일 <ol><li> D6에서 D20에 3 일마다 신선한 매체와 매체를 교체하십시오. 대표 myospheres는 F에 표시됩니다igure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> 확인 myosphere 차별화 <ol><li> 더 진행하기 전에, 이전 조브 프로토콜 (12)에서 설명한 바와 같이, 10의 화합물에 포함 myospheres의 섹션을 만들어 myospheres 이내에 근육 조직 분화의 효율을 확인하기 위해 추천된다. 같은 myognenin으로 근육 조직 마커 (복제 F5D, DSHB)과 마이 오신 중쇄 (복제 MF20, DSHB) (대표 결과를 참조)에 대한 면역 형광 염색을 수행합니다. 이 5 분 동안 도데 실 황산나트륨 (SDS) 0.5 %로 처리하여 항원 검색을 수행하는 것이 중요하다 EB 섹션 오게 닌에 대한 염색으로 성공하기! 팁. 또한 그것은 F5D 및 MF20 항체를 이용한 이중 염색이 프로토콜을 사용하는 것이 가능하다. </li></ol></li></ol> 3. 미디어 조리법 <ol><li> ESC 매체 DMEM-F12 1 mM의 L-글루타민 20 % 녹아웃 빼앗아음 교체 매체 (KOSR) 0.1 mM의 비 필수 아미노산 (NEAA) 50 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의) 0.1 ㎜ 베타 - 머 캅토 에탄올 8 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) </li><li> EB 매체 DMEM F12 1 mM의 L-글루타민 15 % FBS 5 % 말 혈청 </li><li> DM 매체 DMEF F12 1X 리퀴드 미디어 보충 1X N-2 (부록) </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

여기에서 제안 된 프로토콜은 직접 인간 배아 줄기 세포에서 수축 근섬유 (myospheres)의 3 차원 클러스터를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 제안 된 전략은 심사 분석 및 개발 연구 모두를위한 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;으로 적합 할 수있다 서스펜션 미니 근육을 생성하는 전례가없는 뛰어난 잠재력을 가지고 있습니다. 게다가 인간 배아 줄기 세포로부터 myospheres를 생성하는 방법은 간단하고 일반적으로 복구 세포의 수율에 부정적인 영향을 감별 도중 어떤 FACS 소팅 공정을 필요로하지 않는다. 이 단일 세포로 EB의 해리를 의미 이후 게다가, 분화 동안에 정렬 절차는 응집을 방해한다. 제안 된 방법은 다 능성 배아 줄기 세포에서 발현되지 않는 특정 요인, MyoD 및 BaAF60C와 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 reprograming을 기반으로합니다. MyoD 및 BAF60C는 &quot;핵심&quot;단백질 복잡한 일에게 제공자국에서 전사가 골격 근육 조직 프로그램을 활성화하기 위해 진행되는 게놈 유전자 좌. 두 요소는 렌티 바이러스 감염에 의해 세포에 전달하고 모든 세포에서 두 요인의 감염의 고효율을 얻을 수 있으므로 중요된다. 이것은 높은 역가의 바이러스 또는 선택 마커 부여 바이러스를 사용하여 달성 될 수있다. 배양 조건은 근육 조직의 분화의 정도를 최적화하는 중요한 역할을한다. 골격 myotubes에 근육 조직 전구체의 변환을 달성하기 위해 - 우리는 혈청 정의 된 배지에서 배양 (ITS 인슐린 트랜스페린을 포함) 다음에, 근원 전구체의 클러스터로 인간 배아 줄기 세포를 표현 MyoD/BAF60C의 분화에 대한 혈청 기반의 차별화 프로토콜을 제안한다. 그러나, 정의 된 다른 매체와 동일하거나 더 나은 근원 성 분화를 달성 할 수있는 것이 가능하다. 프로토콜의 하나의 전류 제한은, 게다가 함유 태아 혈청의 사용에 의존한다는 것이다많은 동물성 단백질과 물질을 보내고, 로트의 변화를 보여줍니다. 이 myospheres 내 근육 조직 전환의 낮은 효율성 또는 이질의 원인이 될 수 있습니다. 참고로, BAF60/MyoD-expressing 인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 모든 EB 같은 구조는 myospheres 것은 아닙니다; 즉, 일부는 완전히 근섬유로 구성 EB 같은 집계입니다. (결과 참조) 프로토콜의 끝에서 수행 EB 섹션에 의해 추정 된 면역 염색으로 정상적으로 BAF60C 및 MyoD 발현을 인간 배아 줄기 세포 유래의 myospheres 수가 30-60% 변할 수있다. 만 myospheres의 배양 접시를 풍부하게하는 잠재적 인 방법은 근육 조직 기자를 사용하는 것입니다. 이는 부분적으로 또는 분화하지 EB 같은 클러스터를 폐기하고 오직 myospheres를 선택하는 것이 용이. 마지막으로, 도입 된 요소의 시간적 요건을 기본 메커니즘을 더 잘 이해가 전달 방법을 개선하는 것이 유용 할 것이다. 예를 들어, BAF60C 및 MyoD는 SH 필요오트 시간은 올바른 방향 &quot;킥&quot;세포에, 수정 된 mRNA의 납품에 근거를 둔 방법을 적용 할 수 있습니다. 인자가 세포가 내인성 단백질을 이용하기 전에 장시간이 필요한 경우에 대조적으로, 에피 솜 접근법은 가변성 및 게놈 통합 때문에 제어되지 않은 효과를 제거하기 위해 추천된다. 마지막으로, 우리는 이전 골격근에 hESC의 전환을 달성하기 위해에 또는 MyoD (결코 이후)과 동시에 BAF60C을 표현하는 필수되어 있습니다. BAF60C의 사전 식에 대한 요구 사항은 아마도 게놈 6,15 통해 적절한 MyoD 염색질 배포를위한 성적인 풍경을 미리 설정하는 역할에 의존합니다. 따라서, 미래의 프로토콜은 화합물 또는 인간 배아 줄기 세포에서 BAF60C 발현을 촉진 다른 조작에 의해 개선 될 수 있습니다.

능성을 유지하면서 때문에 그들의 독특한 능력의 자기 갱신, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학의 귀중한 자원으로 간주됩니다. 체외 질병 모델링을위한 골격 근육의 병에 걸린 근육과 hESC의 또는 유도 만능 줄기 세포의 세포 매개 다시 채우기 줄기 (IPSC)에서 파생 된 세대는 치료를 식별하고 많은 신경 근육 질환의 발병 기전을 해명하기위한 연구의 주요 목표입니다. 그러나 이러한 연구는 골격근 세포로 변환하는 인간 배아 줄기 세포의 저항과 골격 근육 생성을 향해 hESC의 - 약속의 분자 규제에 관한 정보의 소수에 의해 도전을 받고있다. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 이전의 시도는 배아 바디 (EB)에서 유래 된 자손 또는 중간 엽 세포는 전사 활성제의 자궁외 식 (다음 골격 근육 생성을 활성화 할 능력이 있다는 것을 밝혀 예PAX3 또는 Myf5) 1-3 또는 특정 배양 조건 4-5에 노출. 우리는 이전에 (SMARCD3에 의해 암호화) SWI / SNF 구성 요소, BAF60C는, 근육의 특정 유전자좌 6 MyoD 매개 활성화를 허용하는 전사 기계의 필수 구성 요소입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 BAF60C의 선택 부재는 인간 배아 줄기 세포에, 그렇지 않으면 체세포 8-10을 표현 BAF60C에서 관찰 골격 근육 생성 7 MyoD 매개 활성화에 대한 저항성을 부여하는 것을 발견했다, 과정은 일반적으로 근육 조직 전환 함. BAF60C의 강제 식 직접 BAF60C 및 근육 조직 계보 7으로 인간 배아 줄기 세포를 저지른 성적인 서명을 부과 MyoD으로, 특정 배양 조건에 따라, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 생성을 활성화 MyoD 수 있습니다. 참고로, 이전의 단백체 분석 BAF6의 선택이 없음을 밝혀0C는 SWI / SNF의 구성 요소 중, 줄이고 ESCs 11. 우리는 3 차원 수축을 형성하기 위해 통합 할 수있는 골격 근육 아세포의 균질 인구의 세대로 이어지는, 근육 조직 계보에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력을 부과하는이 기술을 사용 구조 (myospheres) 그 기능을 모방 소형 골격 근육 7. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 우리의 방법은 휴대 등의 세포 분화 신호에 노출 될 때까지 표현형 잠재적 인 근육 조직 혈통에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력에 의존 차별화 매체의 집계와 문화 (특정 프로토콜 참조). 이 전략은 성적으로 골격 근육 계통에 최선을 다하고 조직 학적과 골격의 기능적 특성을 요점을 되풀이 입체 수축 myospheres의 형성에 적합한 인간 배아 줄기 세포의 균일 한 인구의 확장을 허용근육. myospheres 근육 질환의 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;에 대한 악용 소형화 근육의 첫 번째 증거를 제공합니다. 환자 유래 유도 만능에서 발생하는 경우,이 myospheres은 치료 화합물의 높은 처리량 검사를위한 도구로 엄청난 잠재력을 제공 할뿐 아니라, 오랜 개발 질문을 명료하게 할 수있는 잠재력 및 희귀 질환의 발병 기전이있다. 우리는 또한 고메스 등. (12)에 의해 조브 프로토콜에 설명 된대로 myosphere 분석 한 즉시 판독이 부분에 대한 면역 조직 화학 염색에 의해 제공 될 수 있습니다

<table><tbody><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6웰 낮은 부착 플레이트</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (Arrested)14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-글루타민 (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>펜/스트렙 (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레렌</td><td>밀리포어</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS 액체 미디어 보충제</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-보충제;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES 세포 클로닝 & 회복 보충제</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myogenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 myospheres의 생성

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 골격 근육 세포의 균일하고 풍부한 인구의 생성은 세포 기반 치료를위한 인간 신경 근육 질환의 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;에 대한 요구 사항입니다. 이러한 낮은 풍부하고 또한 인구뿐만 아니라, 입체적인 수축성 구조체의 형성을위한 프로토콜의 부족의 불균일 등 주요 장애물은, 신경 근육 질환에 대한 줄기 세포의 응용을 제한했다. 우리는 인간 배아 줄기 세포에 정의 된 요소의 자궁외 도입하여 이러한 한계를 극복하는 프로토콜을 디자인 한 - 근육의 결정 인자 MyoD 및 SWI / SNF 염색질 복잡한 구성 요소 BAF60C 리모델링 - 골격 근육 세포로 인간 배아 줄기 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기서 우리는 프로토콜의 hESC 파생 된 근원 세포를 생성하고 삼차원 적 소형화 구조 (myospheres)에 자신의 클러스터링을 촉진하기 위해 설립 설명하는 기능적 모방 소형 골격 근육 7 </sup&gt;.

도 1a는 프로토콜의 개략이 인간 배아 줄기 세포로부터 myospheres를 생성하는 것이 제안 나타낸다. (화살표로 표시)을 제어하는​​ 중요한 단계는 인간 배아 줄기 세포의 감염 효율 및 myospheres 내의 근육 조직의 변환이다. 우리의 실험에서 우리는 GFP의 형광을 전달하는 렌티 바이러스 벡터 인코딩 BAF60C 활용합니다. 우리는 일반적으로 BAF60C을 표현 인구 풍부하게 감염 후 BAF60C 및 FACS - 정렬 72 시간에 세포를 감염. 세포가 합류의 70 ~ 80 %에 도달 할 때, 우리는 MyoD의 렌티 바이러스에 감염. 처음 감염 후 일반적으로 그 합류에 도달하는 셀에 대한 2,​​ 3 일이 소요된다. 그림 1B는 감염되지 않은 인간 배아 줄기 세포에 배 유도 상대적으로 외래 유전자의 발현 수준을 보여줍니다. 그림 1C 도입 요인의 단백질 수준에서의 발현 및 분포를 보여줍니다. BAF60C<html> MyoD식이 MyoD 항체와 면역에 의해 감지되는 동안 식, GFP의 형광으로 표시됩니다. 우리는 우리가 EB 같은 집계에 감염된 인간 배아 줄기 세포의 분화를 시작하고 하루 일 0을 고려하십시오. DM 매체의 15 일 후, myospheres의 일부 (보통 전체가 아니라이)의 OCT 화합물 (12)에 내장과 근육 조직 변환 효율을 확인하기 위해 근육 조직 마커에 대한 면역을 수행하는 단면된다. 그림 1D는 오게 닌과 마이 오신 중쇄에 대한 대표적인 염색을 보여줍니다 최적의 근원 성 차별. Myospheres 아마도 작은 myospheres 함께 융합의 결과로, 또는 다른 특이한 형상을 가질 수있다. 10 일부터 시작, 그것은 (동영상 1, 2 참조) myospheres에 산발적 수축을 관찰 할 수있다. 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1.) 인간 배아 줄기 세포. B에서 myospheres) BAF60C 및 MyoD (H9-BM) QRT-PCR에 의해 모니터링 및 배 유도로 표현에 감염된 인간 배아 줄기 세포에 외래 유전자의 mRNA 수준의 생성에 사용되는 프로토콜의 회로도 등 감염된 인간 배아 줄기 세포를 조롱에 비해 때문. D) 면역 형광이 오게 닌 스테인드 myosphere 섹션에서 수행 된 벡터의 IRES-GFP 요소 (MYOG에 MyoD 염색 (빨강) 및 BAF60C 형광 (녹색)를 표시 (H9-CTR). C) 면역 형광 이미지 ), 마이 오신 헤비 체인 (My​​HC) 및 DAPI에 대한 대조 (면역 형광 세부 정보를 볼 수 있습니다). 스케일 바는 100 μm의입니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> 그림 2.의 다른 단계에서 세포 모양의 대표 사진분화 (2 부)에 감염 (파트 I)에서 프로토콜. 스케일 바는 100 μm의입니다. EB와 같은 구조 반면, D1에서 D5로 모양 (D)에 주로 원형이며, 그림 1A의 계획이 예상치 못한 형태를 제시하고 문화에 이질적인 따라 15 일 이상 성장 myospheres; E와 F의 두 가지 예를 참조하십시오.

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

본 절차의 전반적인 목적은 인간 배아줄기세포 유래 골격근 세포로 구성된 EB 유사 구조체인 myos spheres를 생성하는 것입니다. 이는 Baf 60 C의 렌티바이러스 감염을 통해 세포를 재프로그래밍함으로써 달성됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 동일한 세포에 두 번째 바이러스인 myo D 렌티바이러스를 감염시키는 것입니다.그 다음, 감염된 세포들을 혈청 기반 배양 배지에서 5일 동안 유도하여 EB 유사 응집체를 형성시킵니다. 이후 EB 배지를 무혈청 분화 배지로 교체하고, 응집체를 2주 더 배양하여 근구(myospheres)로 성장시킵니다. 최종적으로, OCT에 매립된 응집체의 절편을 시각화하기 위해 면역형광법을 사용합니다.이 기술의 주요 장점은 골격근 세포의 높은 분화 효율이며, 중간엽 또는 중배엽 전구세포로부터의 분화와 마찬가지로 세포 분류 과정이 필요하지 않아 3차원 배양 시스템에 적합하다는 점입니다. 6-웰 플레이트에 배양된 인간 배아 줄기세포를 감염시키기 전날, 배지에 인간 배아 줄기세포 클로닝 및 회복 보충제(cloning and recovery supplement)를 1000x 농도로 첨가하여 최종 농도가 2 µM이 되게 합니다. 다음 날, 고역가의 bath 60 CGFP 렌티바이러스를 사용하여 인간 배아 줄기세포를 감염시킵니다. 먼저, 웰에 1 mL의 TrypLE을 첨가하고 플레이트를 5분 동안 배양하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 그다음, 현탁액을 수집하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.준비된 배지 9 mL를 추가하고, mt. SIR, one 1 mL를 기다리는 동안 1,200 RPM에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. 최종 농도가 6 µg/mL가 되도록 poly brain을 추가하고, 2 µM의 인간 배아 줄기세포 회복 보충제(human embryonic stem cell recovery supplement)를 추가합니다.그런 다음 세포를 이 용액에 재현탁하여 저부착 6-웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 이제 감염 다중도(MOI) 100 million으로 농축된 60 C 바이러스를 첨가합니다. 바이러스와 함께 플레이트를 3시간 동안 배양합니다.그런 다음 세포를 수집하여 Matrigel이 코팅된 플레이트 웰 두 개에 나누어 담습니다. 각 플레이트에 2 µM 보충제가 포함된 mt, SIR 배지 2 mL를 각각 첨가한 후, 37 °C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 배지를 신선한 배지로 교체합니다.감염 시작 후 48시간이 지나면 세포들이 이미 응집된 것처럼 보일 것입니다. 형광을 확인하여 감염 효율을 평가하십시오. 세포의 밀도가 80% Confluence에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하고, 그 후 세포를 해리시킨 다음 동일한 프로토콜을 사용하여 myo D 바이러스를 세포에 처리하십시오.감염된 세포가 성장 지점 전날까지 80% 밀도(confluence)에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하며 배양합니다. 감염된 세포를 ME'S 플레이트로 계대 배양하기 위해, matrigel이 코팅된 플레이트에 MES를 cm²당 1000개의 세포 밀도로 분주합니다. 다음 날.trip ALI를 사용하여 세포를 분리한 후, 15 mL 튜브로 세포를 옮깁니다. 인간 배아줄기세포 배지 9 mL를 넣고 원심분리합니다. 1,200 RPM에서 5분 동안 처리합니다.펠렛 형태의 세포를 신선한 human embryonic stem cell medium 6 mL에 현탁합니다. 이제 mes 플레이트 2개에서 배지를 제거하고, 감염된 세포를 해당 플레이트에 접종합니다. 세포를 수일 동안 배양합니다.세포 밀도가 80%confluence에 도달하면, 모든 배지를 제거하고 collagenase four 1mL를 첨가합니다. 37°C에서 collagenase로 5분간 처리한 후, 1mg/mL를 첨가합니다.콜라게나제(collagenase)를 1 mL의 인간 배아 줄기 세포 배지로 교체합니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 10 mL 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 모은 뒤, 15 mL 튜브로 옮겨 가라앉힙니다. 3분 후 상층액을 제거하고 세포를 인간 배아 줄기 세포 배지에 다시 현탁합니다.그 다음, 세포를 meth 플레이트에 1:4 비율로 플레이팅합니다. 이 절차를 위해서는 감염된 세포의 수가 충분해야 하며 양질의 콜로니가 형성되어 있어야 합니다. 각 웰에서 배지를 제거하고 collagenase.Four 1 mL를 첨가합니다.이전과 같이 1 mg/mL 농도로 첨가하고, 5분 후 EB 배지로 교체하여 collagenase 반응을 중단시킵니다. 그런 다음 현미경을 사용하여 신속하게 콜로니를 긁어냅니다. 10 mL 피펫 팁을 사용하면 세포를 작은 세포 덩어리로 분리할 수 있습니다.이 응집체들을 15 milliliter 튜브에 수집하고, 약 3분 동안 가라앉힌 후 상층액을 제거합니다. 세포를 3 milliliter의 EB medium에 재현탁하여 6-well low attachment 플레이트의 단일 웰로 모두 옮깁니다. 이 플레이트를 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 거대 콜로니 덩어리가 형성되었는지 확인합니다.응집체가 발견되면, 5 mL 피펫을 통해 몇 번 옮겨 담아 분리하십시오. 부유하는 단일 세포가 많은 경우, 침전법으로 응집체만 수집한 후 신선한 EB 배지로 교체하십시오.배양 5일 후부터는 이틀마다 배지를 교체하십시오. 세포 응집체를 수집하고 2 mL의 PBS로 한 번 세척하며, 세포가 자연 중력에 의해 가라앉도록 둡니다. 그 다음 PBS를 3 mL의 DM 배지로 교체하고, 이후 15일간의 배양 기간 동안 세포를 동일한 플레이트 웰에 다시 넣으십시오.3일마다 배지를 교체하십시오. 이 기간 동안 중배엽구가 형성됩니다. 인간 배아 줄기세포에 GFP 형광이 포함된 bath 60 C를 감염시켰습니다.72시간 후, 세포를 FACS로 분리하였습니다. BAF 60 C를 발현하는 세포를 약 75% 합류도까지 배양한 후, myo D 렌티바이러스를 감염시켰습니다. 감염된 세포에서 외래 유전자 발현을 정량적 실시간 PCR로 검출하였습니다.단백질 수준에서의 발현과 분포를 조사하였습니다. GFP는 baf 60 C 발현에 해당하며, myo D 발현을 확인하기 위해 myo D 항체를 사용하였습니다. 이는 인간 배아줄기세포가 EB 유사 응집체를 형성하기 시작한 지 15일 후의 결과입니다.myos sphere의 일부를 OCT 화합물에 매립하여 절편을 제작하였으며, 해당 절편에서 근원성 및 myosin heavy chain 마커에 대해 양성 반응이 나타난 것을 확인하였다. 10일째부터 myos sphere에서 산발적인 수축이 관찰되었다. 일부 myos sphere는 myos sphere 간의 융합으로 인해 서로 다르거나 특이한 형태를 띠었다.다양한 근육 질환 환자의 역분화 줄기세포로부터 마이오스피어(myo spheres)를 생성할 수 있으므로, 이 기술은 질병 모델링 및 치료 분야의 연구를 발전시킬 것입니다. 이러한 이유로 마이오스피어는 약물 스크리닝 및 질병 발병 기전 연구에 적합한 질환 모델을 제공합니다.

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이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

여기에 설명된 프로토콜은 최소 전사 인자 세트의 과발현을 통해 마우스 배아 섬유아세포에서 혈액 프로그램의 유도를 자세히 설명합니다. 이 기술은 조혈, 혈액 질환 및 조혈 줄기 세포 이식에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 인간 시스템으로 변환될 수 있습니다.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

이 동영상은 마우스 배아 fibroblast (MEF) 피더 세포에 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)를 성장하는 방법을 보여줍니다. 3 부 1.

MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를

배우세요 인간 배아 줄기 세포에서 골격근 전구세포를 생성하여 마이오스피어를 만드는 방법을. 이 기법은 고수율의 근육 세포를 제공하며 재생의학 연구에 활용됩니다.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

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