Name: 임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 학습하세요 인간 및 마우스 혈액 샘플에서 순환 종양 세포(CTC)를 검출하고 분석하는 방법을. CellSearch 시스템을 활용한 이 기술은 표적 치료 선택을 위한 중요한 연구 도구입니다.

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이 작품은 암 연구의 온타리오 연구소 (# 08NOV230), 혁신에 대한 캐나다 재단 (# 13199), 전립선 암, 캐나다, 얀센 종양학, 런던 지역 암 프로그램, 존 도나 브리스톨에서 기증자의 지원을 통해에서 교부금에 의해 지원되었다 (ALA에) 런던 건강 과학 재단. LEL은 프레 더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 박사 수상에 의해 지원됩니다. ALA는 CIHR 새로운 탐정 수상 및 연구와 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상에 의해 지원됩니다.

이 논문에 기술 된 모든 인간의 연구는 웨스턴 대학의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 웨스턴 대학교 동물 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 보호에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시되었다. 1. CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거 1. 제조 장비에 대한 인간의 혈액 샘플 수집 및 처리를위한 준비 <ol><li> 표준 무균 정맥 절개 기술을 사용하여, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 독점적 셀룰러 방부제를 포함 (이하 CTC 방부제 튜브 라 칭함) 10 ㎖ CellSave 튜브에 인간 혈액 8.0 ㎖가 최소값을 그린다. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 튜브의 5 배를 반전. 샘플은 즉시 처리 또는 최대 96 시간 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> Remov전자 CSS의 냉장고에서 시약 및이를 사용하기 전에 실온으로 가온하도록 허용한다. </li><li> 일회용 10 ㎖ 피펫 및 자동 피펫을 사용하여, CTC 방부제 튜브에서 혈액의 7.5 ML를 수집하고 천천히 적절하게 레이블이 지정된 준비 악기 처리 튜브에 혈액을 분배. </li><li> 각 샘플에 희석 버퍼의 6.5 ML을 추가합니다. 샘플 5X를 반전시킴으로써 섞는다. &quot;OFF&quot;위치에 브레이크 10 분 800 XG에 샘플을 원심 분리기. 처리를 위해 시스템에 모든 환자의 샘플을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 샘플 준비의 1 시간 이내에 처리해야합니다. </li></ol> 2. 제조 장비에 대한 처리에 대한 제어 준비 <ol><li> 조심스럽게 제어 유리 병 와동 혼합하는 배 반전. </li><li> 조심스럽게 제어 유리 병에서 뚜껑을 제거하고 세척제 유리 병 위에 거꾸로 준비 기계 가공 튜브를 놓습니다. 하나의 빠른 움직임에 반전바이알을 제어하고, 상기 처리 튜브에 내용물을 붓는다. 반전하면서 부드럽게 남아있는 내용을 공개하는 제어 유리 병의 측면을 가볍게. </li><li> 조심스럽게, 처리 관에서 반전 제어 유리 병을 제거 할 때 아무 액체가 손실되지 않도록 보장하고 옆에 놓습니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 병 뚜껑에 남아있는 내용을 수집하고 부드럽게 처리 튜브에 피펫. </li><li> 처리를 위해 시스템에 컨트롤을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. </li></ol> 3. 분석 기기에 대한 샘플 스캔 <ol><li> 시스템에서 모든 샘플을 언로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 느슨하게 각각 자기 장치 카트리지를 모자와 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다. 모든 거품이 제거되고 나면, 단단히 난 카트리지를 모자 평면 자기 장치를 마련하고,상온에서 적어도 20 분 동안 어둠 속에서 ncubate. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다. </li><li> 분석 기기의 전원을 켜고 램프를 초기화합니다. 일단 (~ 15 분)을 따뜻하게, 분석 기기에 시스템 검증 카트리지를로드하고 QC 테스트 탭을 선택합니다. 필요한 품질 관리 측정을 수행하려면 화면의 지시를 따릅니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 환자 테스트 ​​탭을 선택합니다. 준비 기기에서 저장된 모든 정보가 표시됩니다. 샘플 검사를 초기화하려면 시작을 클릭하십시오. 시스템은 자기 소자 카트리지 거친 포커스 및 에지 검출을 수행한다. </li><li> 방향 키를 사용하여 필요에 따라 모든 모서리를 조정합니다. 선택에 동의합니다. 이 시스템은 미세 초점을 수행하고 샘플 검사를 시작합니다. </li><li> 결과를 스캔에 따라 제어가 높은 (CK + DA에서 아군 세포에 대해 정의 된 기준을 사용하여 유효성을 검사해야PI + CD45 - APC +)과 낮은 (CK + DAPI + CD45 - FITC +)의 농도. 결과를 스캔에 따라 환자의 샘플은 정의 CTC 기준 (CK + DAPI + CD45을 -)를 사용하여 캡처 한 CTCs를 검토해야한다. </li></ol> 2. CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC의 특성 1. 사용자 정의 마커 및 기기 초기화의 준비 <ol><li> 작업 농도는 샘플 및 스톡 농도로 첨가 한 후, 항체의 농도는 다음 식을 이용하여 마커 시약 컵에 원하는 농도로 본드 차 항체 희석액을 사용하여 관심의 항체 희석있는 항체의 농도는 시약 컵. 다수의 샘플은 표 1에 기재된 바와 같이 항체 볼륨을 조정한다. 시약 카트리지와 L의 1의 위치에 마커 시약 컵을 놓고CSS에 카트리지 OAD. 주식 농도 = (근무 농도 X 850 μL) / 150 μL </li><li> 혈액 수집 샘플을 준비하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플로부터 기본 CTC 열거 상기에서 설명한대로 제조 기기를로드. 준비 악기 메시지가 표시되면 사용자 지정 마커 추가를 사용하려면 선택 사용자는 분석을 정의. 입력 마커 이름과 저장을 선택합니다. 샘플을 기기에 탑재되면, 운전자는 필요가 없음 예를 선택하거나 선택하여 사용자 지정 표시를 수신해야하는 묻는 메시지가 표시됩니다. </li></ol> 2. 분석 기기에 대한 사용자 정의 마커의 샘플 스캔 <ol><li> , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행 </strong&gt; 프로토콜입니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. FITC 채널을 초기화하려면, 테스트 프로토콜 섹션의 키트 ID로 CellSearch CTC를 선택합니다. 이 메뉴에서 선택 CTC 연구, 편집 버튼을 클릭하고 원하는대로 노출 시간을 설정합니다. 그것은이 CTC 식별에 이용 다른 형광 채널로 비쳐을 높일 수있는 CSS CTC 키트를 사용할 때 1.0 초의 노출 시간을 초과하지 않는 것이 권장된다. </li></ol> 3. 전임상 마우스 모델에서 사용하기위한 표준 CSSProtocol의 적응 * Veridex 마우스 / 쥐 CellCapture 키트에서 적응 (더 이상 상업적으로 가능) 1. 마우스 혈액 수집 및 저장 <ol><li> 종래 채혈에, 0.5 M EDTA 30 ㎕를가 허브 EDTA 소량 남게 앞뒤로 22 G 바늘을 통해 실행 ~. </li><li>이전 동소, 꼬리 정맥, 또는 심장 내 경로를 통해 인간의 종양 세포를 주입 한 생쥐에서 마우스 혈액의 50 μL의 최소 수집합니다. (시리얼 CTC 분석) 복재 정맥이나 (터미널 CTC 분석) 심장 천자하여 혈액을 수집합니다. 바늘을 제거하고 1 ㎖의 EDTA의 microtainer 혈관에 혈액을 분배. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 반전 또는 부드럽게 영화 튜브로 섞는다. 혈액 CytoChex 셀룰러 방부제의 동일 부피의 또 다음 최대 48 시간 동안 즉시 처리 또는 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. CTC 심화 <ol><li> 냉장고에서 CSS 시약을 제거하고 사용하기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. </li><li> 관 세포 계측법 12mm X 75mm의 흐름에 전체 혈액의 50 μL의 등가를 전송합니다. 튜브의 측면에 남아있는 혈액을 세척, 각각의 샘플에 희석 버퍼 500 μl를 추가합니다. 필요한 경우, 짧은 원심 스핀남아있는 혈액을 수집하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 부드럽게 안티 EpCAM의 자성 유체 와동 직접 샘플로 피펫의 팁을 배치하여 각 샘플에 25 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 캡처 향상 시약와 소용돌이의 25 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 자석에 샘플 튜브를 삽입하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다. </li></ol> 3. CTC 염색 <ol><li> 핵산 염료, 염색 시약, 항 마우스 CD45-APC, 안티 - 인간의 HLA-알렉사 플 루어 488, 및 Permeabilization 100 μL의 5.0 μL의 1.5 μL의 50 μL의 50 μL에서 자석에 resuspend에서 샘플 튜브를 제거 시약. 다수의 샘플의 경우, 이러한 시약은 예비 혼합 될 수 있고, 혼합물의 206.5 ㎕를 각 튜브에 첨가 될 수있다. 부드럽게 섞어 소용돌이및 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 자석으로 500 부드럽게 희석 버퍼의 μL, 소용돌이, 장소 샘플 튜브를 추가하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다. 자석에서 샘플 튜브를 제거하고 희석 버퍼 350 μL에 재현 탁. 소용돌이 가볍게 혼합한다. </li></ol> 4. 자석 장치로드 <ol><li> 젤 로딩 팁을 사용하여 조심스럽게 자기 장치에 카트리지에 샘플 튜브에서 전체 볼륨을 전송합니다. 카트리지의 하단에서 시작하고 샘플이 분배된다 천천히 팁을 철회. </li><li> 전체 샘플이 전송되면, 느슨하게 자기 장치 카트리지를 모자와 Sectio에 설명 된대로 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다n은 CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거 형 3.1. </li><li> 베벨 및 카트리지의 가장자리 사이들을 포착하여 멸균 22 G 바늘을 사용하여 기포를 팝. 모든 거품이 제거되고 나면, 확실히, 카트리지 캡 평면 자기 장치를 마련하고, 적어도 10 분 동안 어둠 속에서 부화. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다. </li></ol> 5. 분석 기기에 수동으로 분리 된 샘플의 스캐닝 <ol><li> , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행합니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. 서식 샘플 버튼을 클릭하여 자기 장치 데이터 버튼에 기존 데이터를 지 웁니다. FITC 채널 사용CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC 특성의 2.2 절에 설명 된대로 차 1.0 초에 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 환자 테스트 ​​탭을 클릭하고 입력에 샘플 정보를 편집을 선택합니다. 테스트 프로토콜로 키트 ID로 CellSearch CTC 및 CTC 연구를 선택합니다. 입력은 별표로 표시로 나머지 필요한 정보. 샘플 정보를 저장하고 시작을 클릭합니다. </li></ol>

<ol><li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> 63 (1), 11-30 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+at+each+follow-up+time+point+during+therapy+of+metastatic+breast+cancer+patients+predict+progression-free+and+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival.</a> Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).</li>
<li>Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+versus+imaging--predicting+overall+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer.</a> Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).</li>
<li>Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cell+%28CTC%29+counts+as+intermediate+end+points+in+castration-resistant+prostate+cancer+%28CRPC%29%3A+a+single-centre+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience.</a> Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).</li>
<li>De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+analysis%3A+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> J. Oncol. 2010, 426218 (2010).</li>
<li>Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+cytometry+analysis+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Image cytometry analysis of circulating tumor cells.</a> Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).</li>
<li>Lianidou, E. S., Markou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+breast+cancer%3A+detection+systems%2C+molecular+characterization%2C+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges.</a> Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).</li>
<li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+liquid+biopsy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer.</a> Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).</li>
<li>Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+the+development+of+circulating+tumor+cell+technology+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use.</a> J. Transl. Med. 10, 138 (2012).</li>
<li>Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((User-defined+protein+marker+assay+development+for+characterization+of+circulating+tumor+cells+using+the+CellSearch+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomet.+A%22%5BJournal%5D)">User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system.</a> Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).</li>
<li>Fehm, T., Müller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+status+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%3A+a+prospective%2C+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial.</a> Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+HER2-positive+metastatic+breast+cancer+patients%3A+a+valuable+prognostic+and+predictive+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker.</a> BMC Cancer. 13, 202 (2013).</li>
<li>Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Marty, M., Cognetti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+phase+II+trial+of+the+efficacy+and+safety+of+trastuzumab+combined+with+docetaxel+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-positive+metastatic+breast+cancer+administered+as+first-line+treatment%3A+the+M77001+study+group%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group.</a> J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).</li>
<li>Slamon, D., Eiermann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+trastuzumab+in+HER2-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer.</a> New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).</li>
<li>Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+considerations+for+studying+cancer+metastasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metast%22%5BJournal%5D)">Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo.</a> Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).</li>
<li>Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+cell+dissemination+patterns+in+preclinical+models+of+cancer+metastasis+using+flow+cytometry+and+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry.</a> Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).</li>
<li>Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+escape+from+EpCAM-based+detection+due+to+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition.</a> BMC Cancer. 12, 178 (2012).</li>
<li>Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+serial+changes+in+circulating+human+breast+cancer+cells+in+murine+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models.</a> Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).</li>
<li>White Pages, V. eridex , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF">http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF</a> (2008).</li>
<li>Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+yield+of+circulating+tumour+cells+facilitates+molecular+characterisation+and+recognition+of+discordant+HER2+amplification+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast.</a> 102 (10), 1495-1502 (2010).</li>
<li>Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+circulating+tumor+cells+in+large+quantities+of+contaminating+leukocytes+by+a+multiplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR.</a> Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).</li>
<li>Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+circulating+tumor+cells+to+tumor+response%2C+progression-free+survival%2C+and+overall+survival+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).</li>
<li>Allard, W. J., Matera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Epithelial-mesenchymal+transition%3A+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li>
<li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer%3A+the+importance+of+being+mesenchymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li>
<li>Königsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li>
<li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li>
<li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer%3A+The+effect+of+neoadjuvant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li>
<li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li>
</ol>

저자 (ALA)는 부모가 회사 존슨 앤 존슨은 또한이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 얀센 진단 LLC를 소유 얀센 종양학가 제공 한 자금을 받았다.

2004 년에 CSS의 도입 이후 많은 새로운 CTC 기술의 발전에도 불구하고,이 기술은 오늘날 시장에서 유일하게 임상 적으로 승인 된 기술이며, 따라서 그것은 CTC 탐지 및 열거 형에 대한 현재 황금 표준으로 간주됩니다. 이 원고는 CSS는 엄격한 품질 관리 기준을 가지고 있지만 그것을 해석 편견의 대상이 될 환자 샘플에서 CTC 식별이 아군 샘플의 식별과 크게 다를 수 있다는 것을 보여 주었다. 일반적으로 모순 된 항목의 6 개의 종류는 CTC의 misclassifications가 발생할 수 확인되었다. 이러한 불일치 항목이 악기에서 처리 각 환자의 샘플에서 여러 검토의 필요성을 강조 표시합니다. 또한, CTCs를 얻은 환자에 비해 아군에서 관찰 된 차이는 두 아군과 환자 샘플에서 유효성을 검사 할 새로운 CTC 기술에 대한 필요성이 있음을 보여줍니다. 또, 이러한 새로운 기술이 ㄱ해야전자 아군 샘플에서 효율적인 CTC 캡처는 반드시 환자의 샘플에서 CTC의 포집 효율을 반영하지 않는 한 두 아군과 환자 샘플의 분할 샘플...

2013 년에 그것은 580,350 개인이 암으로 사망 할 것으로 추정되고,이 질병의 1,660,290 새로운 사건이 혼자 1 미국에서 진단을 것입니다. 이 죽음의 대다수는 전이성 질환이 개발 이후 발생한다. 전이 및 전이성 폭포의 제한된 이해를 치료에 효과적인 치료의 현재 부족은 질병의이 단계가 매우 치명적 있습니다. 혈액 내 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재는 전이성 질환 3와 상관 관계가 입증되었다. 이 세포는 매우 희귀하고 자신의 검출은 전이성 유방암 4, 전립선 암 5 년 생존율을 나타내는이며, 대장 암 6. 적은 수를 가진 환자 또는 샘 없음 감지 CTCs를 비교할 때 이러한 환자에서의 존재는 ≥ 5 (유방암과 전립선) 또는 혈액의 7.5 ML에서 ≥ 3 (대장)의 CTCs는 가난한 예후를 나타낸다전자 혈액량. 또한, 치료 적 개입 동안이나 후에 CTC 번호의 변화는 종종 빨리 현재 활용 기술보다 7-10, 치료 반응의 예측으로 유용한 것으로 입증되었다. 그것은 전이성 암 환자에서의 CTCs 10 5 -10 7 혈액 단핵 세포 당 약 1 CTC의 주파수에서 발생하고 지역화 된 질병을 가진 환자에서,이 주파수 (1 ~ 8 10 ~) 더 낮은있을 수 있습니다 것으로 추정하고있다. 이러한 세포의 희귀 한 자연 어려운 정확하고 신뢰성의 CTCs (11)를 감지하고 분석 할 수 있습니다. 여러 가지 방법 (이전에 12 ~ 14 리뷰) 혈액 성분을 주변에서 그들을 차별화하는 특성을 이용하여이 세포를 풍부하게하고 감지하기 위해 사용되었다. 일반적으로, CTC 열거 형은 농축 단계와 탐지 단계를 모두 필요로하는 과정은 두 단계로 이루어집니다. 전통적으로 농축 단계 인 phys의 차이에 의존의 CTCs (셀 크기, 밀도, 변형성) 또는 단백질 마커의 발현에 (즉, 상피 세포 접착 분자 [EpCAM] 아세포 [CK])의 iCal의 속성. 농축 후, CTC 검출 핵산 기반 분석 및 / 또는 유세포 접근법 가장 일반적인있는 다른 방법은, 다수로 수행 될 수있다. 이러한 전략은 각각 별개의 장점과 단점을 가지고, 그러나 그들은 모두 표준화 부족, 독특하고 임상에 입학 필요. CellSearch 시스템 (CSS)을 따라서, 형광 현미경 및 항체 기반 기술 4-6을 사용하여 인간의 혈액에있는 드문의 CTCs의 탐지 및 열거하기위한 표준화 된 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 이 플랫폼은 현재 CTC 열거 형의 황금 표준으로 간주하고 병원 15에 사용하기 위해 미국 식품 의약청 (FDA)에 의해 승인 된 유일한 기술입니다. CSS는 두 가지 구성 요소 플랫폼 consistin입니다의 g, 사람의 혈액 샘플을 준비하고, 이들을 검사 (이하, 분석 기기 라 함) (2) CellTracks 분석기 II를, 자동화 (이하, 제조 기기 라 함) (1) CellTracks AutoPrep 시스템 준비 다음 샘플. 백혈구에게 준비 기기를 오염의 CTCs를 구별하려면 매개 항체, 자성 유체 기반의 자기 분리 방법 및 차등 형광 염색 사용합니다. 처음에, 시스템은 철 나노 입자에 접합 된 항-EpCAM 항체를 사용의 CTCs 라벨. 시료를 자계에서 배양하고, 모든 비 표지 세포를 흡인한다. 선택된 종양 세포의 형광 표지 된 항체 및 핵 염색 시약을 구성된 차동 형광 염색에 재현 탁하고 인큐베이션. 마지막으로, 시료를 자기 카트리지로 전송 (이하, 자기 장치로 지칭) MagNest 부르고, SC된다분석 기기를 사용 anned. 분석 기기는 10X 대물 렌즈를 이용하여, 서로 다른 형광 필터, 적합한 형광 입자에 최적화 된 각을 이용하여 준비된 시료를 검사하는 데 사용된다. 의 CTCs는 반대로 EpCAM, 안티 팬 CK-피코 에리 트린 (PE)에 의해 결합되어 세포 (CK8, 18, 19), 핵 얼룩 4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)로 식별됩니다. 반대로, 오염 백혈구는 항 CD45-알로 피코 (APC) 및 DAPI에 구속되는 세포로 식별됩니다. 주사 후, 컴퓨터에 정의 전위 종양 세포가 사용자에게 제시된다. 이러한 이미지로부터, 사용자는 이벤트의 CTCs 있다고 판단하는 상술 정의 파라미터 및 차동 염색법을 사용하여 정성 분석을 채택한다. CTC 열거를위한 표준화 된 방법을 제공하는 것 외에도, CSS는 그 단백질 마커에 기초의 CTCs 분자 특성화를 허용한다. 이 심문 C이 CTC 식별 16에 필요하지 형광 염료 (FITC) 형광 채널을 이용해 단일 셀 레벨에서 수행 될 수있다. 이 플랫폼은 분자 특성의 용량을 제공하지만, 프로토콜 개발 및 최적화의 자세한 과정은 잘 정의되어 있지 않습니다. 세 시판 마커는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 및 인슐린 - 유사 성장 인자 -1 수용체 (IGF-1R) 등 CSS와 함께 사용하기 위해 제조자에 의해 개발되었다. HER2 분석은 CSS와 함께, 임상 의사 결정을 알리기 위하여 기존 및 잠재적 치료 지침을 변경할 CTC 특성화 가능성을 설명하기 위해 여러 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, Fehm 등. (17)는 HER2-기본 종양 유방암 환자의 약 삼분의이 HER2 +의 CTCs이 있었다는 것을 보여 주었다. 또한, 리우 등.(18)는 최근 그녀의 + 전이성 유방암 환자의 50 %가 HER2 +의 CTCs을하지 않았다고 보도했다. 허셉틴, 크게 그 종양 HER2 충분한 수준의 표현, HER2 + 기본 종양 19-21 환자에 대한 일반적으로 사용 치료 환자에게 이익을 보여 단일 클론 항체를 방해 HER2 수용체. 그러나 이러한 연구는 허셉틴이 하위 최적 활용과 CTC의 특성은 치료 반응을 예측하는데 도움이 될 수 있다는 것을 할 수 있다는 것을 권 해드립니다. 궁극적으로, CTC 특성화 개인화 치료를 개선하기위한 가능성을 가지고있다. 그것은 주로 침대 - 투 - 벤치 탑 접근 방식을 활용하고있다 점에서 CTC의 연구는 고유합니다. 이 방법은 종종 환자 치료에 영향을 줄 수 년이 걸릴 수있는 벤치 탑 - 투 - 머리맡의 연구와는 달리, 임상에의 ​​CTCs 빠른 입력을 허용했다. 그러나, 의사는 환자의 치료 결정 MAK에서 CTC 분석 결과를 사용하기 꺼려인해 기본 생물학에 대한 이해의 부족으로 보내고. 따라서 전이 보완 CTC 분석 기술의 적절한 전임상 마우스 모델이 뛰어난 질문을 조사하기 위해 사용되어야합니다. 일반적으로, 전이성 캐스케이드의 모든 단계의 연구를 허용 전이성 캐스케이드를 연구하는 데 전임상 모델의 두 종류 (1) 자발적 전이 모델이있다과는 허용 (2) 실험 전이 모델 이러한 혈관 외 유출 및 보조 종양 형성 (22)과 전이 과정에서 이후 단계의 연구. 자발적 전이 모델은, 적절한 동 소성 명소 (전립선 암 연구 전립선에 전립선 암 세포의 예 주입)으로 종양 세포 주입을 수반한다. 세포는 다음 주 종양을 형성하고 자발적으로 이러한 뼈, 폐, 림프절 등의 보조 사이트에 전이 시간이 주어집니다. 에반면, 실험 전이 모델 (특정 위치에 셀을 대상으로 꼬리 정맥 또는 심장 내 주사 등을 통해) 혈류로 종양 세포의 직접 주입을 포함하기 때문에 보조 기관 (22)에 intravasation 보급의 초기 단계를 건너 뜁니다. 지금까지 생체 내 모델 시스템에서 CTC 분석의 대부분은 세포 계측법 기반 (23) 또는 적응 인간 기반 CTC 기법 (예 AdnaTest) (24)를 사용하여 수행되었다. 유용하지만, 이러한 기술 중 어느 것도 적절 골드 표준 CSS를 사용하여 CTC 열거 형을 반영하지 않습니다. 결과 것과 비교 될 것이라고 임상 승인 표준화 활동 및 CSS의 광범위한 사용에 따라, 상응하는 샘플 준비, 가공을 이용하는 생체 모델링 CTC 포획 및 검출 기술, 및 식별 기준의 개발이 유익 할 것이다 환자 샘플에서 얻은. 그러나, 볼륨 REQ 행제조 장비의 uirements는이 자동화 플랫폼을 사용하여 혈액의 작은 볼륨을 처리 할 수​​ 없다. .로 마우스 편평 상피 세포의 오 분류로 이어질 수 있습니다 - 또한, Eliane 등 (25)에 의해 이전 작업 (또한 표준 CTC 정의 [EpCAM + CK + DAPI + CD45]을 만족) 마우스 상피 세포 샘플의 오염이 있음을 보여 주었다 의 CTCs. 이러한 문제에게 수동 격리 절차와 결합 된 CSS CTC 키트 시약의 활용이 개발 한 수있는 적응 기술을 해결합니다. 상기 분석으로 FITC 표지 된 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체의 첨가는 인간 종양 세포는 마우스 편평 상피 세포로부터 구별 될 수있다. 이 원고는 discrepan 포함하여 발생할 수있는 환자의 혈액 샘플 및 일반적인 함정을 처리하기위한 상업적으로 개발 표준 및 CSS 최적화 된 프로토콜을 설명합니다CTC의 오 분류 오류가 발생할 수 있습니다 t 항목. 또한, 촬영의 CTCs과 전이의 전임상 마우스 모델에서 혈액의 작은 볼륨에서의 CTCs 농축 및 탐지를 허용하는 비교 적응 CSS 기술의 사용자 정의 단백질의 특성을 검토하는 CSS 분석의 정의가 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD44-FITC</td><td>BD 파미젠</td><td>555478</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD44-PE</td><td>BD 파미젠</td><td>555479</td><td></td></tr><tr><td>안티-휴먼 HLA-알렉사 플루어 488</td><td>바이오레전</td><td>드 311415</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스 CD45-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>본드 1차 항체 희석제</td><td>라이카</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>CellSave 방부제 튜브</td><td>Veridex</td><td>952820 (20 팩) 79100005 (100 팩)</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC 제어 키트</td><td>Veridex</td><td>7900003</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CTC 키트</td><td>Veridex</td><td>7900001</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC 제어 키트</td><td>Veridex</td><td>7900018RUO</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch CXC 키트</td><td>Veridex</td><td>7900017RUO</td><td></td></tr><tr><td>기기 버퍼</td><td>Veridex</td><td>7901003</td><td></td></tr><tr><td>Streck 세포 방부제 (일명 CytoChex)</td> <td>Streck</td><td>213350</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 혈청 학적 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro; l 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro; l 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 플로우 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &마이크로; l 젤 로딩 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 in 일회용 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 혈청 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>모세관 채혈관 (EDTA)</td> <td>BD 마이크로 테이너</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>CellSearch 분석기 II</td><td>Veridex</td><td>9555</td><td>매그네스트 및 검증 카트리지</td></tr><tr><td>포함 CellSearch AutoPrep 시스템</td><td>Veridex</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagCellect 자석&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAG997</td><td></td></tr><tr><td>소형 라텍스 전구</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (ctc) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

암 관련 사망의 대다수는 전이성 질환의 발달 이후 발생한다. 이 높은 치명적인 질병 단계는 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재와 연결되어 있습니다. 이 희귀 한 세포는 전이성 유방암, 전립선 암, 대장 암의 임상 적 의미의 것으로 입증되었다. 임상 CTC 탐지 및 열거 형의 현재 금 표준은 FDA의 허가 CellSearch 시스템 (CSS)입니다. 이 원고는 표준이 플랫폼에 의해 사용 프로토콜 등을 설명 표준을 사용하여, 환자의 CTCs 단백질 특성 분석을위한 사용자 정의 마커 최적화 및 혈액의 매우 낮은 볼륨에서 CTC 캡처를위한 동급 프로토콜의 자세한 과정을 설명하는 두 개의 추가 적응 프로토콜 CSS 시약, 전이의 생체 내 전임상 마우스 모델에서 공부하십시오. 또한, 건강한 기증자의 혈액 사이의 CTC 품질의 차이는 환자의 혈액 SAMP 대 조직 배양에서의 세포와 스파이크레는 강조 표시됩니다. 마지막으로, CTC의 오 분류 오류가 발생할 수있는 몇 가지 일반적으로 불일치 항목이 설명되어 있습니다. 이와 함께,이 프로토콜은 전이와의 CTCs에 관한 전임상 및 임상 연구에 관심이 플랫폼의 사용자를위한 유용한 리소스를 제공 할 것입니다.

표준 CTC 열거 분석 CSS의 민감도와 특이도는 물론 문헌에 기록되어있다. 그러나 동등한 CTC 복구의 유효성을 검사, 스파이크 (1,000 된 LNCaP 인간의 전립선 암 세포) 및 건강한 자원 봉사 기증자로부터 unspiked 인간의 혈액 샘플은 표준 CSSCTC 프로토콜을 사용하여 CSS에서 처리되었다. 예상했던대로, unspiked 샘플은 0.00 ± 0.00 %의 CTCs 무료 있었고, CTC 복구는 아군 샘플 (그림 1A)에 86.9 ± 4.71 %로 증명되었다. 아군 샘플에서 얻은 CSS 갤러리 이미지를 최적의 품질 있었다 CTCs를 비 CTCs를 구별하기 쉽게했다. 암 환자로부터 얻은 샘플을 처리 할 때 그러나,의 CTCs 식별이 많은 세포의 크기가 작은 나타나는 덜 쉽게 구별 비의 CTCs (그림 1B)로부터되는, 조금 더 도전입니다. 또한, 환자의 시료 이벤트 6 카테고리를 검토 할 때이있는 식별했다검...

순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

본 실험의 목적은 인간 및 마우스 이종이식 혈액 샘플로부터 순환 종양 세포를 민감하게 검출, 계수 및 특성화하는 것입니다. 먼저, 인간 또는 암 마우스 모델로부터 혈액 샘플을 수집하고, epca 양성 세포에 대한 양성 선택을 사용하여 오염된 백혈구 배경에서 CTC를 농축합니다. 그 후, CTC와 백혈구를 차등 염색하여 CTC를 식별하고 그 수를 계수합니다.실험실에서 이러한 희귀 순환 종양 세포에 대해 원하는 분자적 특성 분석을 수행함으로써, 임상에서 암 환자를 위한 표적 치료제 선택을 도울 수 있습니다. CellSearch 시스템을 사용하여 얻은 결과는 CTC 분석이 인간 및 마우스 제노그라프트 혈액 샘플 모두에서 효과적으로 수행될 수 있음을 보여줍니다. CellSearch 시스템에서 사용자 정의 CTC 특성 분석 프로토콜을 추가로 개발하면 궁극적으로 환자를 위한 표적 치료제 선택에 도움이 될 수 있습니다.또한, 마우스 이종이식 모델에 적용 가능하도록 조정된 유사한 CTC 분석법은 이러한 세포의 기초 생물학적 특성에 대한 이해를 높여줄 것입니다. CTC 보존 튜브에서 혈액 샘플 7.5 milliliters를 채취하여 처리 튜브에 천천히 분주합니다. 각 혈액 샘플에 희석 버퍼 6.5 milliliters를 추가합니다.다섯 번 뒤집어 혼합한 후 800 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 대조군 준비 시에는 브레이크를 끈 상태에서 바이알을 5초 동안 가볍게 볼텍싱하고 다섯 번 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 거꾸로 세운 처리 튜브로 캡 상단을 제거하고, 한 번의 빠른 동작으로 샘플을 옮깁니다.샘플이 최대한 옮겨지도록 대조군 바이알의 측면을 가볍게 튕겨줍니다. 액체가 손실되지 않도록 주의하며 뒤집혀 있는 대조군 바이알을 조심스럽게 제거합니다. 바이알과 뚜껑에 남아 있는 내용물을 모두 수집하여 처리 튜브에 천천히 넣습니다.전처리 장비의 화면 지침에 따라 모든 대조군 및 환자 검체를 시스템에 로드하여 처리하십시오. 전처리 장비의 화면 지침에 따라 모든 검체를 시스템에서 언로드하십시오. 이제 각 자성 장치 카트리지의 캡을 느슨하게 닫고, 가볍게 두드려 가장자리의 기포를 제거하십시오.그런 다음 카트리지 캡을 단단히 닫고, 자성 장치를 평평하게 놓은 뒤 암소에서 최소 20분 동안 배양합니다. 분석 기기의 전원을 켜고 램프를 초기화합니다. 시스템 검증 카트리지를 분석 기기에 장착합니다.QC 테스트 탭을 선택하고 화면의 지침에 따라 필요한 품질 관리 조치를 수행하십시오. 다음으로, 분석 기기에 샘플을 로드하고 환자 테스트 탭을 선택하십시오. 시작을 클릭하여 샘플 스캐닝을 초기화하십시오.방향 키를 사용하여 모든 가장자리를 필요에 따라 조정하십시오. 그런 다음 '수락'을 선택하십시오. 사용자 정의 마커를 준비하려면, 관심 항체를 bond 1차 항체 희석액으로 희석하십시오. 마커 시약 컵을 시약 카트리지의 1번 위치에 배치하고, 카트리지를 cell search 시스템에 로드하여 사용자 정의 마커 추가를 활성화하십시오.준비 장비에서 요청 시 사용자 정의 분석(user-defined assay)을 선택하십시오. 마커 이름을 입력하고 저장을 선택하십시오. 샘플 처리가 완료되면 분석 장비에 샘플을 적재하고 설정 탭을 선택하십시오.ZI 채널을 초기화하려면, 테스트 프로토콜 섹션의 키트 ID에서 cell search CTC를 선택하십시오. 이 메뉴에서 CTC research를 선택하십시오. 편집 버튼을 클릭하고 원하는 대로 노출 시간을 설정하십시오.마우스 혈액 최소 50 µL를 1 mL EDTA 미세혈관 채혈관에 수집하고, 응고를 방지하기 위해 도립 혼합합니다. CTC 농축을 위해, 전혈 50 µL에 해당하는 양을 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 500 µL의 희석 버퍼를 추가합니다.튜브 벽면에 묻은 혈액을 씻어낸 후, anti chem thorough fluid를 가볍게 볼텍싱하고 각 샘플에 25 µL씩 첨가합니다. 또한, capture enhancement reagent 25 µL를 첨가합니다. 샘플을 가볍게 볼텍싱하고 상온에서 15분 동안 배양합니다.다음으로, 샘플 튜브를 자석에 10분 동안 둡니다. 자석 옆의 튜브 벽에 닿지 않도록 주의하며 잔여 액체를 흡입하여 제거한 후, 샘플 튜브를 자석에서 분리하고 핵산 염색약 50 µL를 추가합니다. 염색 시약 50 µL, anti-US CD 45 APC 1.5 µL, anti-human HLA LOR 4 88 5.0 µL 및 투과 시약 100 µL를 넣고 가볍게 볼텍싱한 후 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다.실온에서 진행합니다. 이제 희석 버퍼 500 µL를 추가하고 볼텍싱합니다. 샘플 튜브를 자석 위에 조심스럽게 올려두고 10분 동안 방치합니다.잔여 액체를 조심스럽게 흡입하여 폐기하십시오. 그런 다음 펠릿을 350 µL의 희석 버퍼에 재현탁하고 볼텍스로 부드럽게 섞어줍니다. 겔 로딩 팁으로 샘플을 흡입한 후, 카트리지 바닥부터 시작하여 샘플을 분주하면서 팁을 천천히 끌어올려 자기 장치로 옮깁니다.멸균된 22 gauge 바늘을 사용하여 기포를 제거한 후, 카트리지 캡을 단단히 닫고 자기 장치를 평평하게 놓은 다음 암소에서 최소 10분 동안 배양합니다. 분석 기기에 샘플을 로드하고 설정 탭을 선택합니다. 기존 데이터를 삭제하려면 샘플 포맷 버튼을 클릭하십시오.kit ID로 cell search CTC를, 테스트 프로토콜로 CTC research를 선택하십시오. 이 메뉴에서 적절한 노출 시간이 선택되었는지 확인하십시오. 환자 테스트 탭을 선택하고 편집을 선택하십시오.시료 정보를 입력하려면 지침에 따라 나머지 필요한 정보를 입력하십시오. 그런 다음 시료 정보를 저장하고 시작을 클릭하여 검증하십시오. 순환 종양 세포 회수, 스파이킹된 인간 전립선암 세포 및 스파이킹되지 않은 건강한 자원 봉사 기증자의 인간 혈액 시료를 표준 CellSearch CTC 프로토콜을 사용하여 CellSearch 시스템에서 처리하였습니다.예상대로, CTC를 첨가하지 않은 샘플에서는 순환 종양 세포가 검출되지 않았습니다. 첨가 샘플의 CTC 회수율은 86.9%였습니다. 첨가 샘플에서 얻은 이 세포 검색 갤러리 이미지들은 최적의 품질을 보이며, CTC를 비 CTC와 쉽게 구별할 수 있습니다. 암 환자의 샘플에서 CTC를 식별하는 것은 다소 더 어려운데, 이는 많은 세포의 크기가 더 작게 나타나며 비 CTC와 쉽게 구별되지 않기 때문입니다.또한, 환자 샘플을 검토할 때 6가지 범주의 이벤트에서 검토자 간의 불일치 항목이 흔히 발생했습니다. 여기에는 작은 이벤트, ZI 양성 이벤트, 희미한 cytokeratin 또는 반점 모양의 염색, 픽셀화된 이미지, cytokeratin bleed-through, 그리고 크거나 겹치지 않는 dpi가 포함됩니다. 암 줄기세포 마커인 CD 44에 대해 98 4%의 양성률을 보이는 것으로 알려진 세포주를 사용하여 사용자 정의 마커를 개발할 때는 CTC 키트 선택을 고려해야 합니다.FCI 기반 CTC 키트에서는 CTC의 69.3%만이 CD 44 양성으로 분류되었습니다. 반면, PE 기반 CX C 키트를 사용했을 때는 CTC의 98.8%가 CD 44 양성으로 분류되었습니다. 사용자 정의 마커의 적절한 최적화를 위해서는 해당 마커에 대해 항원 밀도가 높은 세포주, 항원 밀도가 낮은 세포주 및 음성 세포주를 사용하여 검증함으로써 분석의 민감도와 특이도를 확보해야 합니다. 본 실험에서는 최적화된 마우스 세포 탐색 프로토콜의 민감도와 특이도를 평가합니다.예상대로, 두 가지 분석법과 CTC 회수율 확인 결과 모두에서 Un-spiked 샘플에는 CTC가 없었습니다. 개조된 마우스 키트 사용 결과와 표준 자동화 시스템 사용 결과는 유사했으며, 수동 마우스 개조 프로토콜을 통해 얻은 이미지는 표준 자동화 기법을 통해 관찰된 이미지와 차이가 없었습니다.본 분석법에 HLA fits E를 추가하면 인간 종양 세포를 마우스 편평 상피 세포와 쉽게 구별할 수 있으며, 스파이킹된 마우스 혈액 샘플의 연속 희석과 예상 세포 수 대비 회수된 세포 수의 상관관계를 확인할 수 있습니다. 이 기술이 소수의 CTC를 분리하는 표준 CSS 프로토콜만큼 민감한지 확인하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 인간 및 마우스 제노그라프트 혈액 샘플 모두에서 자동 및 수동 CTC 농축을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한, 세포 탐색 시스템과 결합하여 사용할 CTC 특성 분석 프로토콜을 설계하고 최적화하는 데 필요한 단계들에 대해 더 깊은 이해를 갖추어야 합니다.

adaptation-semiautomated-circulating-tumor-cell-ctc-assays-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

순환 종양 세포는 세포 손상을 보면서 겁에 질리게하지 않고 암 환자의 혈액으로부터 격리됩니다. 종양 세포의 분리는 상피 마커에 대한 항체 이외에 E-selectin의 bimolecular 표면을 사용하여 수행됩니다. 나노튜브 코팅은 특별히 높은 캡처 purities 결과 암 세포 접착을 촉진합니다.

환자의 혈액 샘플에서 가능한 순환 종양 세포의 신속한 분리

이 동영상은 비소세포폐암 환자 샘플에서 순환 종양 세포의 바이오마커를 특성화하는 기술인 순환 종양 세포(CTC) 면역형광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 종양의 동적 변화와 면역 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있으며, 이는 화학 요법, 방사선 요법 및 가능한 면역 요법 치료에 대한 반응을 반영할 수 있습니다.

CTC Immunofluorescence Assay : 순환 종양 세포를 특성화하는 기술

순환 종양 세포(CTC)는 종양 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 간세포 암종(HCC) 전이의 syngeneic mouse tumor model의 전혈에서 CTC를 분리 및 증식하는 방법을 설명합니다.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

프로토콜은 폴리 (N -iso - 프로필 아크릴) 효과적인 캡처 및 가능한 순환 종양 세포 (CTC)의 thermoresponsive 릴리스 (PIPAAm) 코팅 된 마이크로 제시를 활용합니다. 이 방법은 분석 및 특성, 하류 오프 - 칩 문화에 대한 환자의 혈액과 가능한 CTC의 후속 릴리스에서 CTC를 캡처 할 수 있습니다.

캡처 및 혈액에서 실행 가능한 순환 종양 세포의 릴리스

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

순환 종양 세포의 특성 (CTC)는 번역 연구에서 인기있는 주제입니다. 이 프로토콜은 비소세포 폐암(NSCLC) 환자 샘플에서 CTC의 PD-L1 특성화 및 열거에 대한 반자동 면역형광(IF) 분석방법을 기술한다.

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

CtC를 배양하면 특정 마커 발현을 속이고 약물 내성과 다른 가능성 중 간을 식민지화하는 능력을 평가함으로써 암의 더 깊은 기능적 특성을 허용합니다. 전반적으로 CTC 문화는 환자 결과를 개선하기 위해 개인화 된 의학을위한 유망한 임상 도구가 될 수 있습니다.

순환 종양 세포 주: 근본적이고 번역적인 연구를 위한 혁신적인 도구

임상 미세유체 칩은 임상 환자 혈액 샘플 전처리를 단순화하고 순환 종양 세포(CTC)를 칩에 면역 형광으로 염색하여 단일 CTC를 신속하게 검출하고 식별할 수 있는 중요한 생물 의학 분석 기술입니다.

다용도 순환 종양 세포의 분리를 위한 임상 미세유체 칩 플랫폼

순환 종양 세포(CTC)는 암 진행 및 전이 연구에 매우 중요합니다. 이 기사에서는 CTC 농축 및 단일 CTC 시퀀싱을 위한 고처리량 통합 프로토콜을 제시하여 포획 효율성과 CTC 순도를 개선하는 동시에 오염 및 시퀀싱 비용을 줄여 정밀 종양학 연구 및 임상 응용을 발전시킵니다.

미세유체공학 기반 고처리량 순환 종양 세포 분류 및 단일 세포 시퀀싱 기술

학습하세요 인간 및 마우스 혈액 샘플에서 순환 종양 세포(CTC)를 검출하고 분석하는 방법을. CellSearch 시스템을 활용한 이 기술은 표적 치료 선택을 위한 중요한 연구 도구입니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

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