Name: 수술 후 면역 억제의 메커니즘을 탐색 소설 수술 전후 면역 요법을 평가하기 위해 수술 스트레스의 마우스 종양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 탐색하세요 수술 스트레스 마우스 종양 모델에서 수술 후 면역 억제 메커니즘과 면역 요법 효과를 평가하는 방법입니다. 이 기법은 종양 외과학 연구에 활용됩니다.

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저자는 동물 수술에 대한 지원은 김 예이츠, 아일린 프랭클린, 레베카 쳅 크마 (동물 관리 및 수의학, 오타와 대학교) 감사드립니다. 리 - 화 타이는 퐁 드 공들인 상테 퀘벡 원정대에 의해 지원됩니다. 레베카 아우어에게 리더의 기회 부여 -이 작품은 캐나다 암 협회 연구소 혁신 그랜트, 연구 개발 초기 연구원 수상의 온타리오 교육부, 혁신에 대한 캐나다 재단의 운영 교부금에 의해 지원되었다.

1. 체외 4T1 종양 세포를 유지 <ol><li> 완전한 DMEM 문화 수정되지 않은 4T1 종양 세포 (DMEM, 10 % FBS, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신) 10cm 조직 배양 접시에. 37 ° C, 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터에서 배양한다. </li><li> 분할 문화 2 ~ 3 회 / 주. 최적의 생존 세포가 80 % 합류를 초과하지 않아야 유지합니다. 문화&gt;은 1 개월간 시험 관내에서 계대 배양 된 경우이 이전 계대 배양 세포보다 악성 종양과 전이성 잠재력을 감소함에 따라 생체 내 차 종양을 설정하는 세포를 사용하지 마십시오. </li></ol> 2. 주입을위한 수확 4T1 종양 세포 <ol><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 배양 접시에서 대기음 배지. </li><li> 2 ㎖의 EDTA를 포함 1X 멸균 PBS의 10 ML을 추가합니다. PBS 용액을 37 ° C, 5-7 분 동안 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터에서 접시에 품어 보자. </li><li> 플레이트, R에서 수확 PBS 솔루션솔루션 판 2 배를 insing, 15 ML 원뿔 관에 전송할 수 있습니다. </li><li> 벤치 탑 원심 분리기에서 4 ° C에서 500 XG에서 5 분, 원심 분리기 세포. </li><li> 뜨는을 기음과 혈청이없는 DMEM에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 셀 카운터를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. </li><li> 얼음에 주입 및 장소 세포 6 cells/500 μL (1 × 5 cells/50 μl를 (1X10하는 무 혈청 배지로 세포를 희석. </li></ol> 3. 4T1 종양 세포와 쥐를 주입 수행하는 모든 동물 실험은 소성을 주사 또는 종양 이식을받은 모든 동물을위한 오타와 추천 대학의 동물 관리 수의학의 제도적 지침에 따라했다. <ol><li> 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / ㎏) 통증 관리를위한 수술 전 1 시간에 피하 쥐를 치료​​. </li><li> 유도 및 주입에의 기간 동안 2.5 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 사용하여 마취 마우스를 유지기. 반사 응답을 검출하기 위해 마우스 발바닥 핀치. 어느 것도 검출되지 않은 경우, 효과적인 마취 레벨에 도달된다. 메마른 눈 윤활제이어서 각막 건조를 방지하기 위해 적용된다. </li><li> 30 G를로드 ½ 세포 현탁액 정확하게 50 μL와 &quot;매우 좋은&quot;주사기에. 모든 기포가 공기 방울을 제거하기 위해 주사기의 측면을 눌러 주사기 열에서 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 복부 쪽이 위로 (마취) 마우스를 놓습니다. </li><li> 알코올 면봉을 사용하여 주사 부위를 청소하고 4 유방 지방 패드에 수평으로 직접 바늘을 도입, 천천히 주사기 볼륨을 분배. </li><li> 어떤 누출을 청소 면봉을 사용합니다. </li><li> 마우스가 마취에서 회복 할 수 있습니다. </li><li> 프레 놀핀 통증 관리 관리 SC 2 일간 매 8 시간 동안 (0.05 ㎎ / ㎏)을 유지한다. </li></ol> 4. BALB / c 마우스 베어링 4T1 종양의 수술 전후 치료 관리 <ol><li> 십삼일 후 종양 세포 주입에서, 외부 캘리퍼스를 이용하여 종양을 측정 차. 캘리퍼와 최대 길이 직경 (길이) 및 최대 가로 지름 (폭)를 측정한다. 개질 타원면 수식 종양 체적을 계산하는 데 사용된다 (종양 체적 = 1 / 2 (세로 폭이 A-) </li><li> 십삼일 후 종양 세포 주입에, 기본 종양은 약 1cm 3를 측정해야한다. 이 종양 측정이 달성 될 때, 수술 치료 시약을 준비합니다. </li><li> 온 콜리 틱 바이러스는 하나가 수술 전후 기간에 관리 할 수​​있는 하나의 혁신적인 치료입니다. 주사 전에 얼음에 1X 멸균 PBS와 장소에 온 콜리 틱 바이러스 (1 × 9 PFU / 1 ㎖)를 준비합니다. </li><li> 안전하고 장소 마우스정맥 꼬리 정맥 주입에 대한 제한 수단에. </li><li> 부드럽게 측면 꼬리 정맥을 시각화하는 따뜻한 수돗물에 마우스 꼬리를 가열한다. </li><li> 27 G를로드 ½ &quot;인슐린 주사기&quot;에 온 콜리 틱 바이러스 치료 정확히 100 μL로. 모든 기포가 주사기 열에서 제거되었는지 확인합니다. </li><li> 측면 꼬리 정맥 중 하나에 1 × 8 PFU/100 μL / 마우스로 마우스를 주입한다. 바늘이 적절하게 측면 정맥에 삽입되어있는 경우, 주사기를 우울하게 할 때, 아무 저항이 느껴 될 수 없습니다. </li></ol> 5. 차 종양 및 복부 왼쪽 신장 절제술의 완전 절제 <ol><li> 십사일 후 종양 세포 주입에, 오타와 동물 관리 및 수의학 서비스의 대학 프로토콜을 승인 한 다음과 같은 일상적인 수술 치료를 시작합니다. 프레 놀핀 (0.05 ㎎ / ㎏) 통증 관리를위한 수술 전 1 시간에 피하 쥐를 치료​​. 유도하고 수술하는 동안 2.5 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 사용하여 마취를 유지한다. 유개 nder 조건 및 무균 수술 도구를 사용하여 소독, 수술 부위를 면도하고 세정한다. 동물은 수술 전에 피하 유체 및 눈의 윤활유를 관리됩니다. </li><li> 부드럽게 완전히 유방 지방 패드에서 기본 4T1 종양을 제거하기 위해 작은 절개 (길이에서 1-2 cm)를 확인합니다. </li><li> 9월 2일에서 3일까지 밀리 스테이플 절개를 닫습니다. </li><li> 마우스의 복부 정중선을 따라 피부와 피하 층을 절단하여 복부를 노출합니다. </li><li> 마우스 복막에 액세스 할 수 리네아 알바 (3-4 CM)에 절개를합니다. </li><li> 측면을 덮는 장내 이동하여 복부의 좌측 내부 측을 노출. 내장은 생리 식염수 적신 멸균 거즈와 촉촉한 유지하고 있는지 확인하십시오. </li><li> 수술 집게의 무딘 쌍을 사용하여 부드럽게 왼쪽 신장을 파악. </li><li> 루프에 묶여 3-0 왁스 코팅 꼰 실크 봉합사를 사용하여, 왼쪽 신장의 종자의 배꼽을 결찰 3 수술 매듭으로 고정합니다. SURGI과 왼쪽 신장을 제거칼 가위. </li><li> 적절한 지혈이 달성 될 수 있도록 신중하게 봉합 넥타이를 검사합니다. </li><li> 9mm의 스테이플을 사용하여 5-0 꼰 흡수, 다음 주식 피부 층을 사용하여 연속 루프 봉합과 피하 층을 닫습니다. 5.10 5.2 10 분 / 동물을 필요로한다 단계. </li><li> 프레 놀핀 통증 관리 관리 SC 2 일간 매 8 시간 동안 (0.05 ㎎ / ㎏)을 유지한다. </li></ol> 6. 안락사 마우스 및 처리와 폐 종양 부담의 정량화 <ol><li> 4T1 종양 주입 후 이십팔일에서 오타와 대학의 동물 관리 및 수의학 프로토콜에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. </li><li> 흉곽 아래에 가위로 초기 절개를합니다. </li><li> 마우스의 흉강의 복부 정중선을 따라 피부와 피하 층을 절단하여 가슴을 노출합니다. </li><li> 북동 각면이 위로의 피부와 조직을 통해 횡 절개를합니다마우스의 CK. </li><li> 폐 위와 아래의 결합 조직을 멀리 자르는 동안 부드럽게 폐를 잡고 폐를 해부하다. </li><li> 미리 담그기, 10 % 포르말린에 배치 한 다음, 잔여 혈액을 제거하는 차가운 PBS에 폐를 추출. </li><li> 종양의 전이 평가에 대한 각각의 폐 사진. 종양 부담 부량 폐의 무게. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

수술 적 절제가 지역화 된 고체 악성 종양 환자에 대한 치료의 의지입니다. 심지어 완전 절제로, 많은 환자는 전이성 재발을 개발하고, 궁극적으로 자신의 질병으로 사망. 수술 직후 수술 후 NK 세포의 억제에 의해 많은 부분에서 변조 암 전이의 형성, 이상적인 환경을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 그것은 대부분 무시되어 치료 창에 남아있다. 수술 후 전이를 방지하기위한 표준 수술 전후 항암 치료는 현재 없습니다. 현재 도전하여 미세 전이 질병의 설립을 방지 수술 전후 기간에 NK 세포를 활성화한다 안전하고 유망한 치료를 식별하는 것입니다. 이러한 치료는 엄격하게 전임상 동물 모델에서 안전성과 효능에 대한 특징으로하고 신중하게 설계된 임상 실험로 번역해야합니다. 기본 비율수술 스트레스의 마우스 종양 모델을 개발 nale은 수술 후 면역 억제 및 전이성 확산의 메커니즘을 탐구하고 기본 종양을 제거하는 수술을받은 암 환자에서 나중에 사용하기 위해 잠재력을 가진 혁신적인 면역 요법을 평가하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해, 수술 스트레스와 결합 뮤린 4T1 유방 암종 모델이 개발되었다. 4T1 세포주는 뮤린 &quot;유방 암종&quot;이지만,이 세포주를 사용하는 이유는 우리가 현실적인 암 모델에서 외과 적 스트레스의 효과를 평가할 수 자발적 전이 재현성이다. 이러한 맥락에서, 악성 종양의 실제 기원은 전이성 잠재력과 종양 생물학보다 중요합니다. 우리의 모델의 두번째 중요한 구성 요소는 밀접 인간 암 수술을 닮은 동물 수술의 개발이다. 이 1cm 3에 도달 한 후이 동물 수술 스트레스 모델에서 일차 4T1 유방 종양이 적출된다. 때문에인간의 환자에서 암 수술은 중요한 면역 억제, &quot;수술 스트레스&quot;치료 그룹에서 오픈 복부 절제술을 포함을 추가로 수행됩니다. 그것은 인간에 더 전통적인 종양 절제술과 비교으로, 전체 왼쪽 신장 절제술의 침략적인 성격은 대장 암, 난소 암, 신장 암, 췌장암, 폐 및 식도 수술 등의 고체 악성 종양에 대한 수술 치료의 다양한 종류, 매우 비교할 수 암. 또한, 우리는 개복술 + 절제술에 의한 perioperatively 발생하는 심각한 생리적 변화가 적절하게 대부분의 고체 악성 종양에 대한 침습 수술 후 발생하는 압도적 인 생리적 변화를 재현한다고 주장한다. 과도한 스트레스와 수술 사망률, 마취 지속 시간 및 수술이 발생하고 수술하는 동안 체온을 유지 할 수 있습니다 수술 전후의 요인을 제어하는​​ 것은 정확하게 정의된다. 이러한 모든 매개 변수가 정확하게 실행됩니다D는 인간의 암 환자의 일상적인 수술 치료를 미러링하기 위해 수술 프로토콜에 정의되어 있습니다. 수술 치료의시기는 수술 전후의 구조 모델에 추가로 중요한 구성 요소입니다. 4T1 종양 베어링 마우스는 이전에 인플루엔자 백신의 3식이 요법으로 치료되었습니다 항암 (수술 전에 5 일 부여), 수술 (수술 같은 날에 주어진)과 수술 당일에 주어 수술 + 다회는 (, 2 다음 추가 복용) 오일 따로 없습니다. 현저하게, 백신 치료의 3 가지 모드가 크게 폐 전이 22 감소. 그러나, 인플루엔자 백신을 가장 효과적으로 단일 용량 감소 전이로 perioperatively 관리. 공동으로, 이들 실험은 전이성 프로세스에 개입하는 좁은 치료 윈도우로서 직접 수술 전후 기간의 중요성을 강조. 같은 oncoly 혁신적인 면역 요법의 수술 전후 사용틱 바이러스와 백신은 독점적으로 우리의 연구 그룹에 한정되어 있습니다. 우리는 새로운 종양 용해 ORF와 우두 바이러스의 수술 전후 관리는 동물 모델 1에서 수술 후 NK 세포의 억제를 반전 할 수있는 처음으로 보여 주었다. 더 중요한 것은, 면역 기능이 구조는 전이의 수술 후 형성의 감소와 상관 관계. 인간의 연구에서 수술 후 암 수술 환자는 NK 세포의 세포 독성을 감소했고 수술 OV는 현저하게 암 환자의 1에 NK 세포 활동을 증가시킨다. 상업적으로 이용 가능한 예방 백신을 사용하여, 우리는 수술 전후의 인플루엔자 백신 관리는 크게 종양의 전이를 감소 임상 종양 모델에서 NK 세포의 세포 독성을 향상 것을 보여 주었다. 인간 연구에서, 인플루엔자 백신은 상당히 건강한 인간 기증자와 암 수술 환자 (22)에 NK 세포 활성을 향상. 많은 접근법 canc을 줄이기 위해 사용된다화학 요법, 방사선 있지만, 이러한 치료를 포함하여 어 재발은 보통 (항암) 전이나 (보조) 수술 후 개월에 주 관리됩니다. 이 분야의 연구는 수술 직후 장기 종양의 재발 비율을 결정하는데 중요하다는 것을 보여줍니다. 따라서,이 중요한 기간 동안 면역 요법의 형태로 임상 개입은 상당한 장기 이득이있을 수 있습니다. 자연 폐 전이 및 수술 스트레스의 마우스 모델을 사용하여 우리의 연구는 새로운 치료법을 탐구하고 암 수술 환자의 수술 전후의 면역을 방지함으로써 또한 암 재발률을 줄이기 위해 자신의 잠재력을 결정하는 독특한 기회를 제공합니다.

수술은 고형 종양의 치료 암 치료의 중요한 구성 요소이지만, 완전 절제에도 불구하고, 많은 환자는 전이성 재발을 개발하고, 궁극적으로 자신의 질병으로 사망. 점점, 수술후 기간은 혈액 응고, 성장 인자의 방출 및 면역 억제를 비롯한 수술 생리적 스트레스 반응의 결과로서, 전이의 개발을위한 중요한 시간으로 인식된다. 우리 그룹의 1, 2 등 3-5 즉시 수술 후 기간이 전이의 형성을위한 고유 취약 시간입니다 것으로 나타났습니다. 수술의 prometastatic 효과를 담당하는 핵심 메커니즘 중 하나는 자연 킬러 (NK) 세포를 1-3 수술 후 장애입니다. NK 세포는 종양의 성장과 전이 (6)의 제어에 관련된 선천성 면역 체계의 세포 독성 림프구이다. 수술 후 NK 세포 기능 장애는 나에게 설명되어 있습니다N 인간의 환자 1,7-9 및 동물 모델 1,10,11 모두. 인간의 연구에서 수술 전후 기간 동안 낮은 NK 활성이 암 재발과 사망률 (15, 16)의 높은 속도와 연결되어있는 동안 수술 후 NK 세포 억제, 자연과 이식 전이 1,11-14의 동물 모델에서 증가 된 전이와 상관. 그럼에도 불구하고, 구체적으로 즉시 암 수술에 따라 발생하는 prometastatic 변경 어드레싱 암 치료는 현재 없습니다. 수술 기간은 전이 과정에 개입 할 수있는 기회의 치료 창을 나타냅니다. 이러한 세포 독성 화학 요법과 같은 기존의 암 치료는, 큰 수술 17에서 회복 환자에게 투여하기에 너무 독성으로 간주하고 있지만, 면역 요법은 수술 전후 관리를위한 최적의 후보입니다. 재조합 IL-2와 IFN-I ³의 수술 전후의 사용은 나에게 탐구 한N 초기 단계 수술 후 NK 세포의 억제를 방지하고 무 진행 생존 기간 18 ~ 21을 개선하기 위해 자신의 잠재력을 보여주는 임상 시험. 불행하게도, 추가 개발은 큰 수술 (17)와 결합이 특이 사이토 카인 요법의 내약성에 의해 방해되었다. 바이러스는 또한 NK 세포의 유력한 비특이적 활성제이다. 우리의 연구는 이전에 같은 새로운 항암 조양 세포 붕괴 성 바이러스 (OV) 및 인플루엔자 백신으로 바이러스 백신, nonreplicating으로 복제하는 바이러스의 수술 전 투여가 수술에 의한 NK 세포 기능 장애를 억제하고 전이성 질환 1,22를 감쇠 할 수 있다는 점을 입증했습니다. 이 문서에 설명 된 수술 모델은 수술 후 종양 세포의 확산과 성장에 관여하는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 촉진하고 우리가 수술 전후 기간에 관리 할 수​​ 있습니다 새로운 표적으로 한 치료를 탐험 할 수있다. 이 목표를 달성하기 위해 동물개발 된 수술 스트레스와 자발적인 전이 뭉치의 모델. 자발적으로 폐 특히 여러 먼 사이트에 기본 유선에서 전이 할 수 있습니다 -이 모델은 마우스 유방암 종양 (4T1 BALB / C)를 사용합니다. 0 일에서 유방암 세포를 마우스의 유방 지방 패드에 이식된다. 14 일 후 종양 주입에서 기본 유방 종양의 완전 절제는 모든 동물에서 수행된다. 동물의 일부는 복부 절제술의 형태로 추가 수술 스트레스를받습니다. 하루에 28에서 폐 종양의 결절은 수술 스트레스에 비해 더 수술 컨트롤 마우스는 고립되지 정량된다. 암 수술의이 동물 모델에서 암의 전이에 대한 수술의 효과가 연구되고 있으며, 바이러스 성 기반의 면역 자극제를 복제 nonreplicating 등의 혁신적인 면역 요법의 수술 전후 관리의 효과는 처음으로 시험한다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cell-Gro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>불활성화 소 태아 혈청(FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Chiron, Guelph</td><td></td><td></td>RXN309968</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Corp</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>1/2 초미세 주사기</td><td>Terumo</td><td>30 G, SS05M3009</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 스테이플</td><td>Braintree</td><td>ACS BX</td><td></td></tr><tr><td>5-0 꼰 흡수성 봉합사</td><td>Covidien</td><td>UL-202</td><td></td></tr><tr><td>3-0 왁스 꼰 실크 봉합사</td><td>Covidien</td><td>S-194</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td></td></tr><tr><td>4T1 종양 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>Charles Rivers Labs</td><td>스트레인 코드:028</td><td></td></tr></tbody></table>

수술 후 면역 억제의 메커니즘을 탐색 소설 수술 전후 면역 요법을 평가하기 위해 수술 스트레스의 마우스 종양 모델

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

외과 적 절제는 대부분의 암 환자에 대한 치료에 필수적이지만, 수술은 면역 시스템에 장애를 유발하고 이는 동물 모델에서 암 환자에서 전이성 질환의 발전에 연결되었다. 우리 그룹과 다른 사람들의 전임상 연구는 선천성 면역 기능, 수술 후 기간에 특히 NK 세포의 깊은 억제를 보여 주었다 이것은 수술 후 전이의 향상 발전에 중요한 역할을한다. 상대적으로 적은 수의 동물 연구와 임상 시험의 특성과 암 수술의 해로운 효과를 반대에 초점을 맞추고있다. 자발적 종양을 전이 및 수술 스트레스 엄격한 동물 모델을 사용하여, 폐 전이의 발달에 암 수술의 향상을 입증 하였다. 이 모델에서, 4T1 유방암 세포는 마우스 유방 지방 패드에 주입된다. 14 일 후 종양 주입에서 기본 유방 종양의 완전 절제가 performe입니다모든 동물에서 개발. 동물의 일부는 복부 절제술의 형태로 추가 수술 스트레스를받습니다. 하루에 28에서 폐 종양 결절은 정량화. 면역 요법이 즉시 수술 주어진 경우, 수술 후 전이의 개발을 방지 면역 세포의 깊은 활성화가 감지되었습니다. 4T1 유방 종양 수술 모델은 종양의 전이에 복부 수술 스트레스의 효과를 시뮬레이션 할 수 있지만, 다른 종양 유형에의 적용 가능성을 테스트 할 필요가있다. 현재의 과제는 전임상 마우스 모델에서 안전하고 유망한 면역 요법을 확인하고 전이성 질환의 재발을 방지하기 위해 암 수술 환자에게 주어질 가능한 수술 치료로 그들을 번역하는 것입니다.

폐 전이의 극적인 향상을 초래 수술 응력의 재현성 마우스 모델이 개발되었다. 하루 28 게시물 4​​T1 종양 접종 (14 일 종양 절제술 + / 포스트 - 복부 신장 절제술), 폐 수확 및 전이에 대한 시각화했다. 수술은 명확하게 폐 사진 (그림 1A), 폐 결절의 열거 (그림 1B) 및 폐 무게 (그림 1C)에 의해 입증으로 치료 생쥐에 비해 폐 전이의 양을 증가시킨다. 온 콜리 틱 바이러스 불활 화 인플루엔자 백신을 복제의 수술 전 관리는 크게 암 수술의 prometastatic 효과 (그림 1A-C)를 구출. NK 세포는 전이에게 사후 백신 처리를 방지하는 중개 역할을하는지 여부를 결정하기 위해 NK 세포는 약리 종양 전이 모델에서 항-아시 알로-GM-1을 사용하여 소진 하였다. NK의 부재시세포를 제외한 수술 면역 요법의 치료 효과의 파기 (도 2a 및도 2b)를 관찰했다. 이 데이터는 우리의 외과 스트레스 모델에서 종양의 전이 제거는 주로 NK 세포의 종양 용해 바이러스와 인플루엔자 백신의 활성화와 이후의 NK 매개 종양 용해를 매개하는 것이 좋습니다. 상기 콜리 틱 바이러스 및 인플루엔자 백신 투여 후 수술 NK 세포의 기능을 특성화하기 위해, 생체 NK 세포 사멸을 평가 하였다. 간단히, 풀링 및 DX5 정렬 + NK 세포의 비장 세포에서 수술 스트레스를 제어 마우스를 분리 하였다. 그들은 감마 카운터 뜨는 크롬 출시 측정한다 비율을 대상으로 한 다른 이펙터에, 크롬 표시 YAC-1 표적 세포 4 시간 동안 동시 배양 하였다. 온 콜리 틱 바이러스와 infl의 수술 투여 NK 살인의 중요한 회복과 함께 NK 세포의 세포 독성에 중요한 수술에 의한 결함uenza 백신 혼자 수술에 비해 (그림 2C와 2D)이 관찰되었다. 이와 함께, 이러한 결과는 수술 전후의 NK 세포의 억제는 성공적으로 치료 될 수 있으며, 전이성 질환이 새로운 면역 요법으로 감소 시켰다는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> 그림 1. 폐 전이 대표적인 폐의 (A) 사진, (B) 폐 종양의 열거로 표시 치료 그룹의 28 일째에 4T1 폐 종양의 전이. 평가의 수술에 의한 개선에 대한 수술 치료로 새로운 안티 - 암 종양 용해 바이러스와 인플루엔자 백신 결절 (C) 폐의 무게. 데이터는 3 유사한 실험을 대표하는 N = 5-10/group (*, P = 0.01; **, P &lt;0.0001;<html> NS) 중요하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> 그림 2. 수술 스트레스는 NK 세포를 손상에 의해 폐 종양의 전이를 증가시킨다. (A, B)의 폐 종양 전이의 정량 수술 소설 수술 요법으로 치료 쥐를 강조했다. (C, D) 수술에서 정제 DX5 + NK 세포의 기능을 강조하고 종양 세포를 죽일 수있는 치료를 제어합니다. T 비율 : 지정된 E에 대한 세중의 우물에서 크롬 출시 - (SD + /)의 데이터는 평균의 백분율로 표시됩니다. . 데이터는 3 유사한 실험 N = 4-5/group (**, P &lt;0.005; NS, 중요하지 *, P = 0.01)의 대표/ www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

수술 스트레스의 마우스 종양 모델은 수술 후 면역 억제는 전이성 질환을 촉진하는 방법을 탐구하고 면역 수술 요법을 평가하는 데 사용됩니다.

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 종양 및 수술 스트레스 마우스 모델에서 수술 전후기에 투여된 면역 요법이 전이 감소에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 유방 지방 패드에 4T1 종양 세포를 주입하여 원발성 종양을 형성합니다. 암 수술 전날인 13일 차에 면역 요법을 투여하며, 이는 종양 세포 이식 후 14일 차의 수술 후 전이성 질환을 완화할 것이라는 가설을 바탕으로 합니다.일차 종양을 절제한 후, 일부 마우스 그룹을 대상으로 복강 내 신장 절제술을 시행하여 추가적인 외과적 스트레스를 유도합니다. 마지막 단계로 모든 마우스를 희생시켜 폐 전이성 종양 결절의 수를 정량화합니다. 궁극적으로, 자발적 전이와 외과적 스트레스를 이용한 이 마우스 모델은 수술 전후 면역 요법의 유익한 효과를 입증하는 데 사용됩니다.이 방법은 주요 수술이 면역 체계에 어떠한 영향을 미치며, 결과적으로 수술 후 기간 동안 전이성 질환의 형성에 어떻게 작용하는지, 그리고 이러한 효과를 완화하기 위해 면역 요법을 어떻게 사용할 수 있는지와 같이 외과 종양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 Rebecca s 박사 연구실의 연구 기술자인 Christiano 10 dusa가 시연할 것입니다. 종양 세포 배양을 설정하려면, 먼저 수정되지 않은 41 종양 세포를 완전 DMEM이 담긴 10 centimeter 조직 배양 플레이트에 넣고, 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 배양하십시오.세포의 합쳐짐 정도(confluence)가 80%를 초과하지 않도록 필요에 따라 일주일에 2~3회 배양액을 분할하십시오. 세포 배양을 설정한 후 한 달 이내에, 조직 배양 플레이트에서 배양액을 흡입하여 종양 세포 수확을 시작하십시오. 2 mL의 EDTA가 포함된 1X 멸균 PBS 10 mL를 추가하고, 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5~7분 동안 배양하십시오.그 다음 플레이트에서 PBS 용액을 제거한 후, PBS로 플레이트를 2~3회 헹구고 세포를 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 이어서 벤치탑 원심분리기를 사용하여 500 Gs, 4 °C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 세포 펠릿을 무혈청 DMEM에 재현탁합니다.다음으로, 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정하고 무혈청 배지를 이용해 세포를 500 µL당 1×10⁶ cells로 희석한 후, 수술 1시간 전에 세포를 얼음에 보관합니다. 통증 관리를 위해 마우스의 피하에 buprenorphine 0.05 mg/kg을 주입합니다. 2.5% isoflurane으로 마우스를 마취시킨 후, 발바닥 패드를 집어 마취 수준이 적절한지 확인합니다.그런 다음 30게이지 1/2인치 초미세 주사기에 종양 세포 현탁액 50 µL를 정확하게 채웁니다. 주사기 옆면을 가볍게 두드려 기포를 제거합니다. 이소플루란 마취를 유지하며, 마우스의 배면이 위로 향하게 하여 수술대 위에 놓습니다.이제 바늘을 수평으로 네 번째 memory fat pad에 직접 삽입하고 주사기 용량을 천천히 주입합니다. 주입을 완료하는 데 약 1분이 소요됩니다. 주입 후 누출된 액체는 면봉을 사용하여 닦아냅니다.마우스를 케이지로 옮기기 전 마취에서 회복될 때까지 기다립니다. 세포 주입 13일 후부터 이틀 동안 8시간마다 0.05 mg/kg의 buprenorphine을 피하 투여하여 통증 관리를 지속합니다. 외부 캘리퍼를 사용하여 일차 종양의 크기를 측정합니다.캘리퍼를 사용하여 최대 종단 직경(길이)과 최대 횡단 직경(너비)을 측정합니다. 종양 부피를 계산하기 위해 길이 곱하기 너비의 제곱의 2분의 1로 계산하는 수정 타원체 공식을 사용합니다. 이때, 원발성 종양의 크기가 약 1 cm³라고 가정하고, 본 실험의 선택적 수술 전후 치료 시약인 1x 멸균 PBS 내의 용해성 바이러스를 준비하였습니다.27게이지 0.5인치 인슐린 주사기에 항암 바이러스 치료제 100 µL를 정확하게 충전합니다. 주사기 내의 모든 공기 방울을 제거합니다. 다음으로, 꼬리가 밖으로 나오도록 마우스를 보정기에 넣습니다.따뜻한 수돗물을 사용하여 꼬리를 부드럽게 가열합니다. 외측 꼬리 정맥을 시각화한 후, 외측 꼬리 정맥을 선택하여 항암 바이러스를 주입합니다. 바늘이 외측 정맥에 적절하게 삽입되었다면, 주사기를 누를 때 저항이 느껴지지 않아야 합니다.작업이 끝나면, Postum 세포 주입 후 14일째에 마우스를 케이지로 돌려보내 하룻밤 동안 유지합니다. 통증 관리를 위해 수술 1시간 전에 buprenorphine 0.05 mg/kg을 피하 투여하고, 2.5% ISO fluorine을 사용하여 마취를 유도 및 유지합니다. 1~2 cm 길이로 피부를 절개한 후, 유선 지방 패드(mammary fat pad)에서 primary 4T1 종양 전체를 조심스럽게 제거하며, 이때 종양과 부착된 모든 잔해물이 한 덩어리로 제거되어야 합니다.나중의 면역조직화학 분석을 위해 종양을 Formin에 보관하십시오. 종양을 절제한 후, 9 mm 스테이플러 2~3개를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 다음 단계는 마우스 일부 그룹에 대해 주요 수술을 수행하는 것입니다.피부와 피하층을 통해 복부 정중선 절개를 시작합니다. 그런 다음, 복막에 접근하기 위해 선상 팔꿈치 부위에서 3~4 cm 절개를 가합니다. 이제 상단의 장을 한쪽으로 밀어 복부의 왼쪽 내부 측면을 노출시킵니다.식염수에 적신 멸균 거즈로 장을 촉촉하게 유지합니다. 다음으로, 뭉툭한 외과용 포셉을 사용하여 왼쪽 신장을 부드럽게 잡습니다. 그런 다음 루프 형태로 묶은 3.0 왁스 코팅 편조 실크 봉합사를 사용하여 왼쪽 신장의 신문(hilum)을 결찰합니다.세 번의 외과적 매듭으로 봉합사를 고정합니다. 이제 외과용 가위로 왼쪽 신장을 제거합니다. 봉합 매듭을 주의 깊게 살펴 충분한 지혈이 이루어졌는지 확인합니다.다음으로, 5-0 꼬임 흡수성 봉합사를 사용하여 연속 루프 봉합으로 피하층을 닫습니다. 그 후 9mm 스테이플러를 사용하여 피부층을 스테이플링합니다. 신장 절제술은 동물당 10분이 소요됩니다.회복되면 동물을 케이지로 돌려보내고, 8시간마다 kg당 0.05 mg의 buprenorphine을 피하 투여하여 2일 동안 통증 관리를 계속합니다. 4개의 T one 종양 주입 후 28일째에 마우스를 안락사시키고 70% ethanol을 분무합니다. 가슴뼈 바로 아래에 가위로 첫 절개를 넣어 폐 제거를 시작합니다. 흉강의 복측 정중선을 따라 피부와 피하층을 절개하여 흉부를 노출시킵니다.그 다음, 양측의 피부와 조직을 목 방향으로 측면 절개합니다. 이제 폐를 조심스럽게 잡고 결합 조직을 잘라내어 폐가 완전히 분리되도록 합니다. 좌우 엽을 연결하고 있는 기관 분지 윗부분의 기관을 절단합니다.다음으로, 추출한 폐를 차가운 PBS에 담가 잔여 혈액을 제거하고 10% Buffered formalin에 넣습니다. 마지막으로 폐를 촬영하여 종양 전이를 평가하고 무게를 측정하여 종양 부담을 정량화합니다. T1 종양 절제 14일 후 폐를 적출하여 전이 여부를 시각화하였으며, 여기에는 복부 신절제술을 받지 않은 마우스의 폐가 나타나 있습니다. 일부 전이된 종양이 관찰됩니다.대조적으로, 종양 절제술 직후에 실시한 외과적 신장 절제술은 폐 전이 수의 가시적인 증가를 초래했습니다. 이 사진은 종양 절제술 및 신장 절제술 후 항암 바이러스를 투여한 마우스의 폐를 보여주며, 여기에 표시된 것은 종양 절제술 및 신장 절제술 후 인플루엔자 백신을 투여한 마우스의 폐입니다. 각 범주에서 폐 종양 결절 수를 계산한 결과, 수술을 받지 않은 군 또는 수술 전 치료적 개입을 받은 군과 비교하여 신장 절제술을 받은 마우스에서 폐 전이 수가 명확하게 증가했음을 보여줍니다. 수술 전 치료 없이 신장 절제술만 받은 마우스의 폐 무게는 다른 테스트 범주보다 유의하게 더 무겁습니다.따라서, 종양 절제술 후 진행되는 대수술에 따른 전이 촉진 효과는 복제성 항암 바이러스와 불활화 인플루엔자 백신의 수술 전 투여를 통해 유의미하게 억제되었습니다. 이 그래프들은 NK 세포 수가 정상적으로 유지된 마우스와 anasi ALO GM one을 사용하여 약리학적으로 NK 세포를 제거한 마우스의 폐종양 수를 보여줍니다. NK 세포가 제거된 마우스에서는 수술 전후의 항암 바이러스 또는 인플루엔자 백신 면역 요법의 치료 효과가 감소했습니다.이는 백신 치료 후 전이를 예방하는 데 NK 세포가 매개 역할을 한다는 것을 시사합니다. NK 세포의 기능을 더욱 구체적으로 규명하기 위해, 외과적 스트레스를 받은 군과 처리되지 않은 대조군에서 분리한 DX five 양성 세포를 yak one 표적 세포와 함께 배양하여 ex vivo NK 세포 살상 능력을 평가하였습니다. 검은색 실선은 처리되지 않은 마우스의 NK 세포 살상 능력을 나타내며, 검은색 점선은 외과적 스트레스를 받은 마우스의 NK 세포 살상 능력을 보여줍니다.검은색 실선에서 검은색 점선으로 하향 이동하며 나타나는 세포독성 백분율의 감소는 수술 후 마우스의 NK 세포 세포독성 기능 결함을 보여줍니다. 회색 실선은 수술을 받지 않고 항암 바이러스 또는 인플루엔자 백신 중 하나로 면역 요법을 받은 마우스의 NK 세포 살상 능력을 나타냅니다. 회색 점선은 수술과 수술 전후 면역 요법을 모두 받은 마우스의 NK 세포 살상 능력을 나타냅니다.회색 실선에서 회색 점선으로 하향 이동하며 나타나는 세포 독성 비율의 감소는, 수술 전후 면역 요법을 받았음에도 불구하고 수술 후 마우스의 NK 세포 세포 독성 기능에 결함이 있음을 보여줍니다. 가장 중요한 점은 회색 점선이 여전히 검은색 점선보다 훨씬 높다는 것입니다. 이는 수술 전후 면역 요법을 통해 수술로 유발된 NK 세포 세포 독성 기능 장애를 회복시키는 것이 가능할 수 있음을 시사합니다.이 영상을 시청하고 나면, 원발성 종양을 형성하여 자발적 전이 및 수술적 스트레스의 동물 모델을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 원발성 종양을 절제하고 신장 절제술을 통해 추가적인 수술적 스트레스를 유도하며, 최종 시점에서 폐 전이 종양 결절을 평가하는 과정이 포함됩니다. 또한, 이 모델을 활용하여 수술이 선천성 면역 체계에 미치는 억제 효과와 이러한 효과를 역전시키는 면역 요법의 능력을 연구하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

이 비디오는 불완전하게 절제된 피하 종양이 있는 마우스 모델에서 보조 요법 또는 추가 요법을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 부분적으로 종양이 절제된 마우스는 T 조절 세포의 항세포독성 단백질을 표적으로 하는 항체로 치료되어 잠재적으로 종양 재성장을 줄이고 효과적인 보조 요법을 제안합니다.

불완전하게 절제된 피하 종양이 있는 마우스 모델의 보조 요법

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

난소 암의 복막 보급의 다단계 과정을 명확히하기 위해, 본 연구는 이러한 종양 세포와 동 소성 접종을 통해 원래의 종양 개발 및 복막 전이의 쥐 실험 모델을 제시한다.

원래 종양 개발의 쥐 실험 모델 및 복막 전이<em&gt;를 통해</em난소 암 세포에&gt; 동소 이식 접종

이 프로토콜의 정형 외과 수술 후 neuroinflammation 및 행동 변화, 그리고 노화 중 조직 재생 연구 parabiosis와 결합 메커니즘을 연구 하는 데 사용 되었습니다 마우스 모델을 설명 합니다.

정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델

이 프로토콜에서, 우리는 테스트 (네오) 보조 요법을위한 연조직 육종의 불완전한 수술 절제술의 마우스 모델을 설명합니다.

시험을 위해 불완전하게 절제술된 연조직 육종의 마우스 모델(Neo) 보조 요법

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

이 원고의 목표는 키트V558Δ/+ 마우스 모델 및 마우스 표본의 성공적인 해부 및 처리를 위한 기술을 설명하는 것입니다.

위장 기질 종양의 유전자 조작 마우스 모델의 분자 및 면역 학적 기술

구강 내에 형성된 구강 편평세포암 종양을 외과적으로 절제하는 독특한 방법을 여기에서 소개합니다.

구강 편평세포암의 마우스 전임상 모델을 위한 번역 관련 종양 절제 모델

여기서는 난소암의 암 진행, 전이 및 치료 반응을 연구하기 위한 복강내 및 점액내 종양 모델을 구축하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 또한, 이 모델들에서 루시퍼레이스 기반 비침습적 생체 내 영상을 사용하여 마우스의 종양 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

전이성 난소암과 마우스의 치료 반응 연구를 위한 임상적으로 적합한 이식 종양 모델

탐색하세요 수술 스트레스 마우스 종양 모델에서 수술 후 면역 억제 메커니즘과 면역 요법 효과를 평가하는 방법입니다. 이 기법은 종양 외과학 연구에 활용됩니다.

수술 후 면역 억제의 메커니즘을 탐색 소설 수술 전후 면역 요법을 평가하기 위해 수술 스트레스의 마우스 종양 모델

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