Name: 지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 배우세요 지질 나노튜브에 결합된 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 구조를 극저온 전자현미경으로 분석하는 방법을. 단일 입자 및 나선형 3D 재구성 알고리즘을 활용하여 막 결합 단백질의 고해상도 구조를 규명할 수 있습니다.

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10SDG3500034 및 UTMB-NCB SSM에 자금을 시작 :이 작품은 미국 심장 협회에서 국가 과학자 개발 교부금에 의해 지원됩니다. 저자는 실리 UTMB에서 구조 생물학 센터 (에 알아내는-EM과 과학 컴퓨팅 시설을 인정 <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> )뿐만 아니라 박사 부부. 2D 및 3D 나선형 재건 알고리즘에 대한 도움말 스티브 Ludtke 에드 Egelman.

1. 샘플 준비 <ol><li> 버퍼 교환 인간 FVIII-BDD (14)과 HBS-CA 버퍼에 돼지 FVIII-BDD 15 (20 mM의 HEPES, 150 mM의 염화나트륨, 5 mM의 염화칼슘, 산도 = 7.4)는 1.2 ㎎ / ㎖에 집중한다. -80 ° C에서 단백질 용액을 유지 </li><li> 1시 4분 W / 클로로포름의 비율 (W)에 갈 락토 (GC) 및 포스파티딜 세린 (PS)을 혼합하여 지질 나노 튜브 (LNT)을 준비합니다. 아르곤 하에서 클로로포름을 증발시키고, 1 ㎎ / ㎖로 HBS 완충액에서 지질을 용해. 4 ℃에서 LNT 솔루션을 유지 </li></ol> FVIII-LNT의 2. 극저온 전자 현미경 <ol><li> cryo 종 샘플 준비 <ol><li> (300)는 50 (W)에 10 초 동안 O 2, H 2 가스의 혼합물에 Quantifoil R2 / 2 구리 그리드 (탄소 사이드)를 메쉬 방전을 글로우 </li><li> 1시 1분 w / w 비율에 HBS-CA 버퍼의 FVIII 및 LNT 솔루션을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 2.5 ㎕의 한 방울을 적용합니다Vitrobot 마크 IV 가습 실 (100 % 습도)에서 친수성 ​​전자 현미경 눈금 FVIII-LNT 샘플. </li><li> 오와 플래시 액체 C 2 H 6 그리드 (3.5 초 동안 한 오점, 얼룩 힘 1) 동결, 비정질 얼음을 얻기 위해 액체 N 2로 냉각. </li><li> 액체 N 2 (LN2)에서 보관 상자에 보관 그리드. </li></ol></li><li> CRYO-EM 데이터 수집 NOTE : JEM2100-LaB6 (2010 년)는 전자 현미경, 진공 시스템, 조명 시스템, HT, 렌즈 전류 등 온 독서 창문 스크린 및이 연결된 컴퓨터 이루어진 TEMCON 운영체제 탑재 패널 : 왼쪽 및 오른쪽 열의 양쪽에 배치. 빔 이동 X, Y 노브 (SHIFT Y, SIFT Y)와 다기능 (DEF / STIG) 노브가 두 패널에 있습니다. 왼쪽 패널의 조명 (BRIGTHNESS) 노브입니다. 오른쪽 창에 다음과 같습니다 배율 (MAG / CAM 길이)와 포커스 (FOCUS) 노브와 세 걸 보면G (MAG1, MAG2, LOWMAG)과 회절 (DIFF) 모드 버튼. 우리는 알파 2에 MAG1에서 우리의 데이터를 수집. 알아내는-EM 데이터 수집에 필요한 최소량의 조명 조건 (MDS) 오른쪽 패널에 F6 버튼, 맨 윗줄을 통해 F1으로 설정됩니다. 이 프로토콜에서 일반 설정이 사용됩니다 : F1 - 인상 / 낮은 화면, F2 - 검색 모드, F3 - 포커스 모드, F4 - 사진 모드, F5 - MDS OFF / ON 및 F6 - BEAM BLANK, 방사선으로부터 시료를 보호하는 데 사용 빔을 편향에 의해 손상 될 수 있습니다. <ol><li> 크라이 역에 크라이 홀더를 놓고 홀더와 LN2와 크라이 역의 듀어를 입력합니다. 온도가 -192 ° C, 홀더의 끝에 열려있는 셔터에 도달하면, 장소 이전에 지정된 장소에 알아내는-EM 그리드를 동결 링 클램프로 고정. </li><li> 전자 현미경으로 극저온 홀더를 삽입합니다. 극저온 홀더 및 LN2와 반대로 contaminator 챔버의 듀어 리필. 홀더는 30 ~ 60 분 동안 안정화 될 때까지 기다립니다. 보도 자료에 F6과필라멘트 전원을 켭니다. 격자를 볼 수있는 홀더에 필라멘트가 포화, F6 키를 눌러 끄고 셔터 열기. </li><li> 보도 자료 저배율 / 알파 1 (200X의 잡지에서 설정) 및 그리드에 얇은 얼음으로 영역을 찾습니다. </li><li> 최소 용량 (MDS) 모드를 설정하고 표본을 손상시키지 않고, 낮은 전자 복용에 cryo 종 데이터를 수집하기 위해 MAG의 1/alpha 2로 전환합니다. <ol><li> F2 키를 눌러 검색 모드를 설정합니다. 40,000 X에 배율을 설정합니다. / 2 ·의 - 최소한의 전자 량에 BRIGTNESS 노브 ~ 0.04 전자와 빔을 확대합니다. 보도 자료 DIFF 회절 모드로 전환합니다. MAG / CAM의 길이 노브 120 cm에 카메라 길이를 설정합니다. 탄소막의 구멍의 지질 나노 튜브가 LOWMAG에서 미리 선택된 구역 내의 격자 영역을 찾아. </li><li> F4 키를 눌러 40,000 배 확대 한 사진 모드를 설정하고 16-25 E의 복용시 밝기 노브로 조명을 설정 - / 2 ·의. Z-높이를 조정하는 초점 조건을 설정하기 위해 눌러 기본 포커스 버튼Z UP / DOWN 버튼 (오른쪽 컨트롤 패널)와 시편의. -1.5와 -2.5 μm의 사이에 설정 디 포커스. </li><li> 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역에 해당하는 검색 모드에서 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 사각형 그리기로 검색하여 사진 모드를 맞 춥니 다. </li><li> F3 키를 눌러 100,000 X 배율에서 초점 모드를 설정합니다. 사진 모드에서 이미지에 표시 할 영역을 조사하지 않도록 - (5 ㎝ 반경 ~ 4) 및 축 오프 CCD 칩을 충당하기 위해 조명을 초점을 맞 춥니 다. FOCUS 노브 및 DEF / STIG 노브와 이미지의 난시에 대한 올바른와 ~ -1.5과 -2.5 μm의 디 포커스를 조정합니다. </li></ol></li><li> 디지털 카메라 모니터에 라이브 뷰 창에서 라이브 영상을 획득하여 검색 모드에서 이미지에 표시 할 FVIII-LNT를 선택합니다. 라이브 뷰 창에 그려진 사각형 FVIII-LNT를 중앙에 배치합니다. </li><li> 사진 모드로 전환하고 ACQUIR을 클릭하여 52,000 X 효과 배율 0.5 초 노출에 CCD 카메라의 디지털 이미지를 기록디지털 현미경 카메라 모니터에서 E 버튼을 누릅니다. 화상 획득 조건은 그러한 화상 PHOTO 모드에서 획득 된 경우에만 개방 빔 블랭크 (셔터)로서 설정된다. </li><li> 고속 푸리에 변환 (FFT)을 구하는 CTRL-F를 눌러 취득 된 화상의 품질 및 디 포커스를 확인한다. </li></ol></li></ol> 3. 3D 재구성 참고 : 2D 및 3D 분석에 사용 된 이미지 분석 소프트웨어 : EMAN2 및 IHRSR 자유롭게 사용할 수 있습니다. EMAN2는 http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install에서 다운로드 할 수 있습니다. egelman@virginia.edu : IHRSR 소프트웨어는 교수 Egelman에서 얻을 수 있습니다. 최종 IHRSR 세목이 텍사스에서 실행하는 센터 클러스터 컴퓨팅 고급 : http://www.tacc.utexas.edu/을 텍사스 대학 오스틴에서. 그림 1에 표시된 3 차원 복원 알고리즘은 두 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다 : 첫 번째 차원 참조 무료 alignme 나선 세그먼트 (입자)의 균일 한 세트를 선택NT (RFA) 알고리즘은 제 IHRSR에 통합 헬리컬 파라미터 및 확대 투영 알고리즘을 기반 3D 재구성을 달성 EMAN이 구현. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 : 첫 번째 단계는 단일 입자 SPA EMAN2이 특별히 개발 및 배포되고있는 (알고리즘)과 3D 재건을 위해 균일 한 입자의 집합을 선택하기 위해 개발 된 프로그램을 사용합니다. 이 단계는 극저온-EM 데이터에 적응되었다. 두 번째 단계는 특히 재조합 인자 VIII 형태로 수득 헬리컬 어셈블리의 분류를 위해 설계 IHRSR 알고리즘으로 이루어진다. 이 알고리즘은 과학 문학 (12)를 통해 광범위하게 설명되어 있습니다. <ol><li> 균일 한 입자 나선형 재건 (나선형 세그먼트) 세트를 선택 http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 : EMAN2 과학 이미지 프로세싱 제품군과 2D 이미지 분석을 수행합니다. <ol><li> 똑 바른과 극저온-EM의 현미경 사진을 선택HT 디지털 카메라 소프트웨어 및 시각화 도구를 나선형 튜브를 잘 조직. </li><li> 반전, 정상화하고 e2workflow.py GUI에서 X-선 픽셀, 단일 입자의 재구성 (SPR) 옵션을 필터링 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> e2helixboxer.py의 GUI에서, 역 정규화 및 X-선 픽셀이 필터링 된 이미지를 가져옵니다. 사용하여 90 % 정도 겹쳐 256 X 256 픽셀 (2.9 A / PIX)에 FVIII-LNT의 나선형 튜브와 세그먼트를 선택 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> 원래의 현미경 사진에서 디 포커스를 평가하고 e2workflow.py에 통합 e2ctf.py 옵션과 같은 현미경에서 나선형 세그먼트에 대비 전송 기능 (CTF) 보정 (만 위상 보정)를 적용 http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> 초기 입자 (나선형 세그먼트)를 생성 e2workflow.py GUI에서 설정 - SPR 옵션 : http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> ITER = 8 - &#39;e2refine2d.py : e2refine2d.py 알고리즘 스크립트 다음과 같은 직경의 LNT와 나선형의 주문도 (그림 2)와 균일 한 데이터 세트를 선택하는 기준 무료 K-평균 등급을 적용하기로 2D 수준의 평균을 계산 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - 경로 = r2d_001 - 입력 = INPUT.hdf - ncls = 51 - simcmp = 도트 - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = 도트 - classraligncmp = 상 - classiter = 2 - classkeep = 0.8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = 평균 - normproj-classkeepsig &#39;, 그에 따라 ncls 값을 변경. <ol><li> 클래스 평균 80 % 이하의 유사성 입자가 주어진 클래스에서 제외되는 것을 의미한다 &#39;classkeep = 0.8&#39;8 반복을 통해 150 클래스 &#39;= 151 ncls&#39;에서 설정 한 초기 데이터를 분류. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> 클래스의 평균에서 입자를 병합중간 데이터 세트를 생성하는 e2display.py의 발음 나선 회절. </li><li> 순서의 동일한 직경과 정도 클래스를 구분하기 위해 50 클래스 &#39;= 51 ncls&#39;에서 설정 한 중간 데이터를 분류. </li><li> http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector : 입체 재건에 대한 최종 데이터 세트를 생성하는 e2display.py 주문의 동일한 직경과 정도 클래스에서 입자를 병합합니다. </li></ol></li></ol></li><li> Egelman (17, 18)에 설명 된대로 반복 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 알고리즘으로 나선형 재건을 수행합니다. <ol><li> 상승을 추정 결합 푸리에에서 FVIII-LNT 나선 ΔZ (A)는 최종 데이터 세트에서 입자의 변형. </li><li> 5에서 ΔΦ 증가, 일정한 ΔZ와 병렬 IHRSR 세목을 실행하여 방위각 ΔΦ (º)를 정의76; 5 ° 씩 60 °에. </li><li> 초기 볼륨으로 특색이없는 실린더와 3.2.1에 정의 된 초기 나선 매개 변수 ΔZ 및 ΔΦ로 설정 한 각 최종 데이터 100 연속 IHRSR주기를 실행합니다. 3.2.2. </li><li> 클래스 최종 데이터 세트의 2 차원 분류에서 평균과 최종 IHRSR 재건의 돌기 사이의 나선형 매개 변수와 대응의 융합의 최종 볼륨을 검사합니다. </li><li> 최종 비대칭 3D 볼륨에서 관찰 된 비대칭 단위 분포에 해당하는 최종 3 차원 복원에 대칭을 부과 : 인간 FVIII-LNT 4 배와 돼지 FVIII-LNT에 대한 5 배. 최종 대칭 된 3D 재구성을 생성하는 또 다른 100 정제 사이클을 실행합니다. </li><li> &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;outfil : 첫 번째 홀수 및 짝수에 해당 데이터 셋을 분리하여 두 볼륨에 대한 푸리에 쉘의 상관 관계 곡선을 계산전자&gt; - 분할 = 2 &#39;. 3.2.3에 설명 된대로 100 IHRSR 연속 분류 실행합니다. 홀수 및 짝수 데이터 세트에서 생성 된 3D 볼륨의 FSC를 계산 &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> UCSF 키메라의 FVIII-LNT 볼륨을 시각화하고 세그먼트. </li><li><ol><li> 단계 3.2.5에서 최종 볼륨을 엽니 다. UCSF 키메라와 도구&gt; 볼륨 데이터&gt; VOLUME 뷰어 옵션에서 0.005로 윤곽 레벨을 설정합니다. </li><li> 툴&gt; VOLUME 자료&gt; 세그먼트 MAP, 세그먼트 MAP 탭을 선택 볼륨 및 세그먼트 볼륨에 세그먼트를 클릭합니다. </li><li> 그룹 세그먼트는 CTRL +의 SHIFT 및 클릭기로 선택하여 하나의 단위 셀에 대응. </li><li> 단위 세포에 의해 세그먼트를 색상과 구조적 특징을 강조하기 위해 작업&gt; COLOR 옵션으로 나선. </li></ol></li></ol> 4. 전자 단층 촬영 <ol><li> 부정적인 스테인드 FVIII-LNT 샘플 준비 <ol> &lt;리&gt; cryo 종의 실험으로 FVIII-LNT 샘플을 준비합니다. </li><li> cryo 종의 실험로에서 서쪽으로 50에서 O 2, 10 초 동안 H 2 가스의 혼합물에 탄소 코팅 300 메쉬 구리 그리드 (탄소 사이드)를 배출 노을. </li><li> 그리드 6 나노 콜로이드 금 나노 입자와 2.5 ㎕의 FVIII-LNT 서스펜션의 드롭을 적용, 초과 액체를 얼룩 부정적인 2 분 5 ㎕의 1 % 우라 닐 아세테이트 용액을 적용하여 얼룩. 그리드를 건조 과잉 액체와 공기를 더 럽히. </li></ol></li><li> 전자 단층 촬영 데이터 수집 <ol><li> 하나의 경사 홀더에 격자를 전송합니다. </li><li> 전자 현미경에 홀더를 전송합니다. </li><li> 52,000 X 효과적인 배율 CCD 카메라와 +60 ° 및 이미지 촬영시 -60 °의 각도 범위에서 2 ° 씩의 SerialEM 소프트웨어 (19) 자동 기울기 시리즈를 수집, -6 -10 μm의 디 포커스 (150)의 전자 량에 - 170 ELEctrons / 2 ·의 단층 당. </li></ol></li><li> FVIII-LNT의 전자 단층 촬영 재건 참고 : 4.2에서 획득 한 pFVIII-LNT와 hFVIII-LNT 경 시리즈를 재구성. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html : 튜토리얼 다음 IMOD 소프트웨어의 ETomo 옵션 <ol><li> 터미널 창을 사용하여, 3DMOD의 단층 촬영을 엽니 다. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> 빈은 IMOD BINVOL 4에 의한 단층은 단층의 크기를 감소시키는 명령. </li><li> IMOD ROTATEVOL 명령을 사용 비닝 단층에서 Y 축을 따라 지질 나노 튜브를 회전 시키도록 적절한 각도를 선택한다. </li><li> IMOD ROTATEVOL 명령을 사용하여 전체 단층 촬영을 돌립니다. </li><li> IMOD CLIP 크기 변경 명령​​을 사용하여 Y 축을 따라 중심 선택한 지질 나노 튜브를 자릅니다. </li><li> 3DMOD로 자른 하위 단층 촬영을 엽니 다. </li><li> 따라서 인자 VIII 분자의 배열을 시각화하기 위해 단층 촬영을 클릭Z-축 및 부 단층 체적 Y-축을 따라 분할. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다 그들이이 원고에 발표 된 절차에 대해 직접 연락 할 수 있다는 것을 선언합니다.

이 연구에서 방법론은 매우 상동 단백질의 두 개의 막 결합 조직을 구별하기 위해 제시된다 : 인간과 돼지 FVIII 자기 조립 인체에서 발생하는 조건에서 지질 나노 튜브. 설명 과정에서, 인간과 돼지 FVIII 성공적으로 가장 중요한 단계로, 지질 나노 튜브에 나선형으로 구성되어 있습니다. 다음 중요한 단계는 주변의 액체 N 2 온도에서 플래시 냉동으로 얇은 비정질 얼음 샘플을 보존하는 것입니다. 비정질 얼음과 LN2 온도에서 샘플을 보존하는 것은 수화 나선 튜브 및 단백질 지질 거대 어셈블리 생리 활성 유지합니다. 마지막 중요 단계는 근처 LN2 온도에서 고해상도 3D 구조에 충분한 양 및 품질의 극저온-EM 데이터를 취득한다. 근처 액화 질소 온도에서 데이터를 수집하는 것은 더 높은 V에서 샘플의 탈수를 방지전자빔으로부터 현미경 및 방사선 손상의 최고 진공. <p class="jove_conten...

혈액 응고 인자 VIII (FVIII)는 여섯 도메인이 구성 2,332 아미노산의 많은 당 단백질이다 : A1-A2-B-A3-C1-C2 3. 트롬빈 활성화 FVIII는 막 결합 Tenase 단지 내 팩터 IXA에 보조 인자 역할을시. 막 따라 방식으로 FIXa에 활성화 FVIII (FVIIIa)의 바인딩 FIXa의 단백질 분해 효율에게 효율적인 혈액 응고 4 중요한 10 개 이상의 5 시간을, 강화한다. FVIII이 응고 Tenase 복합체 형성에서 수행하는 중요한 역할에도 불구하고, 기능 막 결합 FVIII 구조를 해결하기 위해 아직있다. 이 문제를 해결하기 위해 높은 친화력 8,9 FVIII과 결합하고 활성화 된 혈소판 표면 닮은 할 세린 (PS)에서 부유 단일 지질 이중층 나노 튜브 (LNT)을 10 개발되었다. LNT에 바인딩 FVIII의 연속 나선 조직은 effecti로 입증되었습니다극저온-EM (5)에 의해 FVIII 막 바인딩 된 상태의 구조 결정에 대한했습니다. 기능화 LNT는 cryo 종 (11, 12)에 의해 단백질 - 단백질 및 나선형으로 조직 막 관련 단백질의 단백질 막 상호 작용을 연구 할 수있는 이상적인 시스템입니다. 시편의 생리적 환경 (버퍼, 막, 산도)에 가장 가까운에서 보존으로 알아내는-EM은 첨가제 및 동위 원소없이, 이러한 X-선 결정학 및 NMR 등 기존의 구조 방법에 비해 장점이 있습니다. LNT의 크기, 형상 및 조성 Tenase 복합체가 생체 내에서 조립 활성화 된 혈소판의 pseudopodia에 의해 방불로 FVIII의 경우,이 기술을 막 결합 구조를 공부하는 것은, 더 많은 생리 학적으로 관련이 있습니다. 결함 및 FVIII 원인 혈우병 A, 인구 4, 6의 1 5,000 명의 남성에 영향을 미치는 심각한 출혈 장애의 결핍. 대부분의 전자혈우병에 대한 ffective 치료는 재조합 인간 FVIII (hFVIII)의 평생 관리입니다. 재조합 FVIII 혈우병 치료의 중요한 합병증은 혈우병 환자 (13)의 약 30 %에 영향을 미치는 인간의 모습을 억제 항체의 개발이다. 이 경우, 돼지 FVIII (pFVIII) 농축 인간 FVIII과 인간 FIXa 7 형태의 기능성 복합체에 대한 억제 항체 돼지 FVIII 표시 낮은 교차 반응으로 사용된다. 돼지와 인간 FVIII 양식 모두의 막 결합 조직을 설정하면 FVIII 공동 인자의 기능 및 혈액 지혈에 대한 의미의 구조적 기초를 이해하는 것이 중요합니다. 이 연구에서, 우리는 지질 나노 기술, 극저온-EM, 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 조직을 해결하기 위해 설계 구조 분석의 조합을 설명합니다. 나선형으로 조직 porci의 제공을 알아내는-EM 데이터와 3 차원 구조음으로 대전 된 LNT에 북동 인간 FVIII는 FVIII의 구조 결정 및 막 결합 응고 요인과 생리적 막 환경에서 단지 기초로 제안 된 나노 기술의 잠재력을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>LaB6</td><td>JEOL Ltd</td>.와 JEM2100<td>JEM-2100</td><td></td></tr>은 <tr><td>TEMCON 소프트웨어</td><td>JEOL Ltd</td>.로 200kV에서 작동했습니다.<td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 극저온 홀더</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>는 -175 &deg로 냉각되었습니다. </td></tr><tr><td>C 온도 조절 장치</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가탄 4K x 4K CCD 카메라</td><td>주식회사 가탄</td><td>US4000</td><td>4,096 x 4,096 픽셀(15 &mu); m/pixel 물리적 해상도</td></tr><tr><td>Solarus Model 950 플라즈마 클리너</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄소 코팅 300-메시 3mm 구리 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td> 플라즈마는 고출력 Quantifoil R2/2 300 메시 전자 현미경 과학 Q225-CR2에서 <td>10초 동안 플라즈마 청소</td></tr>를 <tr><td></td><td></td><td></td><td>했습니다. 2mm 직경의 구멍이 있는 탄소 코팅 300-메시 Cu 그리드&nbsp;</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트 이수화물</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>1% 용액, 여과</td></tr>된 <tr><td>갈락토실 세라마이드</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>디올레오일-sn-글리세로-인산-L-세린</td><td>, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>840035 EM 소프트웨어 Digital Micrograph</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM 소프트웨어 EMAN</td><td>무료 다운로드</td><td></td><td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM 소프트웨어 스파이더</td><td>무료 다운로드</td><td></td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td></tr><tr><td>EM 소프트웨어 IHRSR</td><td>무료 다운로드</td><td></td><td>Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/</td></tr> <tr><td>EM 소프트웨어(IMOD)</td><td>에서</td> 사용 가능한 프로그램 무료 다운로드 <td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM 소프트웨어 (SerialEM)</td><td>무료 다운로드</td><td></td><td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>무료 다운로드</td><td></td><td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 viii의 나선형 조직

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> 극저온 전자 현미경 (cryo 종) (1)는 수화 상태와 막 환경 2 단백질과 복합체의 기능 구조를 조사 할 수있는 강력한 방법입니다. 응고 인자 VIII (FVIII)은 세 다중 도메인 혈장 당 단백질이다. 심각한 출혈 장애 - 결함 또는 FVIII의 결핍은 혈우병 A 형의 원인이다. 단백질 분해 활성화되면, FVIII 정상적인 혈액 응고 4 중요한 부정 청구 혈소판 막에 세린 프로테아제 팩터 IXA에 바인딩합니다. FVIII이 응고에서 수행하는 중추적 인 역할에도 불구하고, 그것의 막 결합 상태에 대한 구조 정보가 불완전 5입니다. 재조합 FVIII 농축 혈우병 타입에 대해 가장 효과적인 약물이며 시판 FVIII는 인간이나 돼지, 인간 팩터 IXA 6,7 모두와 복합체 형성 기능과 같이 표현 될 수있다. &quot;&gt;이 연구에서 우리는 극저온 전자 현미경 (cryo 종)의 조합을 제시, 지질 나노 구조 분석은 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 :. 인간과 돼지의 연구실에서 개발 된 방법론 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 것이 설명되어 있습니다. 대표적인 결과는 우리의 접근 방식은 순서에 매우 상동 두 (86 % 서열 동일성 사이의 나선형 조직의 차이를 정의 할 수있을만큼 충분히 민감하다는 것을 보여 ) 단백질. 헬리컬 조직, 극저온-EM 및 전자 단층 촬영 (ET) 데이터 수집에 대한 상세한 프로토콜. 이차원 (2D 관련) 및 3 차원 (3D) 구조 분석은 인간 및 돼지의 3D 재구성을 구하는인가 FVIII-LNT가 논의된다.되게 인간 및 돼지 FVIII-LNT 구조가 제안 된 방법론의 전위 계산기 계산기하도록 보여높은 해상도에서 혈액 응고 인자 VIII의 전자 기능, 막 결합 조직.

재조합 인간과 돼지 FVIII은 성공적으로 부정적으로 활성화 된 혈소판 표면을 닮은, 단일 이중층 LNT 청구 나선형으로 조직되었다. 인간과 돼지 FVIII-LNT의 나선형 조직 (그림 2) 수집 된 디지털 현미경을 통해 일치했다. 제어 LNT와 인간과 돼지 FVIII-LNT 나선형 튜브를 선택 e2helixboxer.py의 GUI 및 e2workflow.py의 GUI, 단일 입자 옵션 (표 1)로 만든 초기 데이터 세트로 분할되었다. 막 - 결합 인간 및 돼지 FVIII-LNT의 헬리컬 순서 e2display.py GUI (EMAN2) (도 3)와 클래스 평균의 푸리에 변환에서 평가 하였다. 유용한 제어 LNT 2D 클래스 평균의 지질 이중층은 잘 정의된다. 내부 및 외부 전단지와 막 소수성 코어의 낮은 밀도 (명확하게 볼 수 있습니다 <strong&gt...

인간과 돼지 : 우리는 두 개의 매우 상동 FVIII 형태의 막 결합 구조를 해결하기 위해 적용 극저온 전자 현미경, 지질 나노 기술 및 구조 분석의 조합을 제시한다. 나선형으로 마이너스로 충전 된 지질 나노 튜브 (LNT)에있는 두 개의 기능 재조합 FVIII의 형태를 구성하는 우리의 실험실에서 개발 된 방법론을 설명한다.

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

이 절차의 전반적인 목표는 초저온 전자 현미경을 통해 지질 나노튜브에 조직된 VIII 인자 나선의 구조를 정의하는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 지질 나노튜브에서 나선형 정제 인자 VIII를 구성하고 액체 질소 온도 및 낮은 전자 선량에서 초저온 전자 현미경 데이터를 수집하여 수행됩니다. 다음으로, factor VIII 멤브레인 결합 구조는 단일 입자와 나선형 3D 재구성 알고리즘을 결합하여 계산됩니다.그런 다음 전자 단층 촬영 데이터를 수집하고 3D 재구성을 생성합니다. 궁극적으로 계산된 인자 VIII 지질 나노튜브 구조는 3D 부피를 분할하고 이를 단층 촬영 재구성과 비교하여 검증됩니다. 입증된 방법은 인자 VIII의 막 결합 조직이 무엇이며 응고에서 그 기능과 어떤 관련이 있는지와 같은 구조 생물학 및 혈액 응고 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.GM 2100 lab six에는 전자 현미경에 연결된 컴퓨터로 구성된 TE con 운영 체제가 장착되어 있습니다. 진공 시스템, 조명 시스템, HT 렌즈 전류를 읽는 창과 컬럼 양쪽에 배치된 좌우 2개의 패널, 빔 시프트, XY 노브 및 다기능 또는 청각 스틱 노브가 두 패널에 있는 스크린. 왼쪽 패널에는 조명 또는 밝기 노브가 있습니다.오른쪽 패널에는 배율 및 초점 노브와 Mag One, Mag 2 및 Low Mag 이미징을 위한 3개의 버튼, 그리고 회절 모드를 위한 1개의 버튼이 있습니다. 이 프로토콜의 경우 일반 설정을 사용하여 알파 2에서 mag 1의 데이터를 획득합니다. 오른쪽 패널의 맨 윗줄에 있는 F1에서 F까지 6개의 버튼을 사용하여 cryo EM 데이터 수집에 필요한 최소 선량 조명 조건 또는 MDS를 설정합니다.F1을 사용하여 화면을 올리거나 내리고, F를 사용하여 2를 사용하여 검색 모드를 선택하고 F를 3을 사용하여 초점을 맞춥니다. 사진 모드로 F 4를 선택하고, MDS를 끄거나 켜려면 F 5를 선택하고, 빔을 편향시켜 방사선 손상으로부터 표본을 보호하는 데 사용되는 빔 블랭크로 F 6을 선택합니다. cryo EM 샘플을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 cryo holder를 cryo station에 넣고 액체 질소로 홀더와 cryo station의 doer를 채웁니다.온도가 섭씨 영하 192도에 도달하면 홀더 팁의 셔터를 열고 이전에 동결된 cryo EM 그리드를 지정된 위치에 놓고 링 클램프를 사용하여 고정

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 연구는 이전에보고되지 않은 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 FV 응고 활동을 측정하는 새로운 microplate 분석에 대해 설명합니다. 방법은 지속적으로 인간의 플라즈마에 섬유소 응고 형성하는 동안 405nm에서 흡광도의 변화를 측정 할 수있는 운동 microplate 리더를 사용합니다.

Microplate 응고 분석을 사용하여 인간의 플라즈마에 반영 V 활동의 측정

이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.

직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

이 문서에서 설명 하는 내 피 폰 Willebrand 평가 하는 방법 요소 릴리스 및 다음 혈소판 유체 전단 응력은 생체 외에서 흐름 챔버 시스템을 사용 하 여 염증 성 자극에 대 한 응답에서에서 캡처.

조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

우리는 환자 유래 내피와 전혈 상호 작용을 조사하기 위하여 체외 혈관 질병 모형을 제시합니다. 이 시스템은 다양한 상황에서 1 차적인 내피 세포의 혈전 생성 특성의 연구를 허용합니다. 이 방법은 응고의 상이한 단계 도중 시혈전증 및 항응고 요법에서 평가하기위하여 특히 적합합니다.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

이 연구는 전단 응력을 이용해 혈전 형성을 유도하고, 여러 차원의 판독을 통해 혈전을 특성화하는 마이크로유체 분석법을 설명합니다. 이 검사법은 혈액 샘플의 혈전형성 경향을 측정할 수 있어 질병 진단, 신약 개발, 혈전증과 관련된 기전적 연구에도 유용합니다.

혈전 프로파일링 분석법: 생체역학적 혈전 생성을 포괄적으로 특성화하기 위한 마이크로플루이딕스 기반 플랫폼

배우세요 지질 나노튜브에 결합된 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 구조를 극저온 전자현미경으로 분석하는 방법을. 단일 입자 및 나선형 3D 재구성 알고리즘을 활용하여 막 결합 단백질의 고해상도 구조를 규명할 수 있습니다.

지질 나노 튜브에 혈액 응고 인자 VIII의 나선형 조직

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