Name: Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 배우세요 중추신경계 조직에서 폴리리보솜 분별을 이용한 번역체 연구 방법을 마우스 뇌와 척수 조직을 활용하여 번역 중인 mRNA를 분석하고 신경계 번역 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (BMBF), (시스템 생물학에 헬름홀츠 얼라이언스) 암의 시그널링의 시스템 생물학 및 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 DKFZ 기관의 지침에 따라 수행 하였다. 주의 : 샘플의 RNAse가 오염을 방지의 RNase 오염 방지를위한 기본적인 예방 조치 및 DEPC 처리 된 물을 모든 버퍼를 준비하기 위해. 자당 그라디언트의 1. 준비 <ol><li> (표 1 참조) 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 및 50 % 자당 솔루션을 준비합니다. 천천히 polyallomer의 초 원심 분리기 튜브의 바닥에 50 % 자당 용액 2 ㎖를 첨가하여 그래디언트를 준비를 시작. -80 ° C에서 20 분 동안 튜브를 배치하여 레이어를 동결 </li><li> 17.5 %의 자당에 끝나는 사이에 냉동 단계 자당 비율을 감소에서 다음 레이어를 추가합니다. 기본 층의 해동을 방지하기 위해 자당 솔루션을 추가하는 동안 얼음에 구배를 유지합니다. </li><li> 갓 일일 사용하기 전에 자당 기울기를 준비하고 4 ℃에서 보관 AlternativelY는 실험 전날 밤 4 ° C에서 -80 ° C와 해동에서 사전에 상점을 그라디언트를 준비합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 (척수 및 / 또는 뇌) <ol><li> 염화나트륨의 자일 라진과 Ketamin의 과다 복용으로 마우스를 마취하고 transcardially 관련된 성적 증명서에 변이를 고정화 200 ㎍ / ㎖의의 CHX를 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 20 ㎖로 perfuse. 발가락 핀치에 비 대응하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 빠른 속도로 조직을 추출합니다. 두개골 등쪽을 열고 뇌를 추출합니다. 전체 흉추 및 요추 척추의 후궁 절제술을 수행하고 척수의 압축을 풉니 다. 각각 뇌 전체 (~ 400 mg)을 척수 (~ 90 밀리그램)의 4cm 조각을 사용합니다. </li><li> 차가운 얼음 균질화 버퍼에 조직을 전송합니다 (표 1 참조) (: 1 ㎖, 뇌 : 척수 4 ㎖)과 사이클로 헥시 미드의 섭취 증가를 허용하는 깨끗한 메스 작은 조각으로 주사위. PerfoRM 얼음에 모든 추가 단계. </li><li> 15 분 동안 배양한다 기계적 다운스 균질화기를 사용하여 조직을 균질화한다. 조심스럽게 제어 균질화는 핵이 그대로 유지되도록 할 필요가있다. 모든 샘플에게 비교를 보장하는 것과 같은 방식으로 처리합니다. 참고 : 뇌 조직을 위해 : 꽉 조이는와 유 봉, 5 스트로크에 의해 조직을 방해. 척수 조직의 경우 : 꽉 조이는 유 봉 5 더 선 다음에 느슨하게 피팅와 유 봉, 5 스트로크에 의해 방해. </li><li> 분취 (뇌와 척수 200 μL 400 μL), 총 RNA 격리를위한 -80 ° C에서 플래시 동결 및 저장을. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에서 원심 분리하여 핵 및 파쇄되지 않은 세포와 조직의 조각을 제거 저속 원심 분리 리보솜의 손실을 방지 할 수 있습니다. </li><li> NP-40을 첨가하고 나트륨 데 옥시 콜레이트 세제 (1 %의 최종 농도로 각각)로 30 분 동안 핵 상등액 소재를 Lyse 막 단편. </li></ol><ol><li> 이 단계는 달리 polyribosome 프로필에 신호를 마스크합니다 샘플에서 지방 성분을 제거합니다. 첫째, 사전 오한 초 원심 분리기의 버킷 4 ° C에서 회 전자와 2 M, 1.1 M을 준비하고 0.9 M 자당 솔루션 (표 1 참조). </li><li> 2 M의 자당 용액의 1.22 볼륨과 해물을 섞어 폴리에틸렌 초원 심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 1.1 M 자당 용액 10 ㎖의 동일한 볼륨으로 모든 튜브를 채워, 그 후 0.9 M 자당 용액을 조심스럽게 오버레이. </li><li> 미리 냉장 초 원심 분리기의 버킷으로 초원 심 분리기 튜브를 놓습니다. 4 ℃에서 10 만 XG에 3 시간 동안 원심 분리기 지방산 성분이 플로트와 상청액에 남아있는 반면,이 과정에서 펠릿으로 증착 될 리보솜. </li></ol> 4. 자당 기울기 분별 <ol><li> 상층 액을 제거하고 균질화 버퍼 B에 펠렛을 용해 (표 1 참조 </st룽&gt;). Nanodrop 또는 동등한 장치를 이용하여 각 시료에 대한 260 nm에서 흡광도를 측정 해 흡광도 값에 따라로드 양을 정상화. </li><li> 사전 냉장 초 원심 분리기의 버킷으로 (준비는 이전 절에서 설명) 자당의 그라디언트를 놓습니다. 그라데이션의 상단에 신중 층 샘플. 기술 제어와 같은 하나의 빈 자당 기울기를 추가합니다. </li><li> 균질화 버퍼 각 버킷의 무게를 조정합니다. 4 ° C에서 285,000 XG에 1.5 시간 동안 원심 분리기 샘플 </li><li> 원심의 끝 전에 이스 코 분별 30 분 준비를 시작. 분별 기의 또 다른 모델이 사용되는 경우에, 제조자의 프로토콜을 따른다. <ol><li> UV 램프에 대한 적절한 감도를 (뇌 또는 척수 0.05 AUFS 0.2 AUFS) 설정하고 워​​밍업을 위해 전원을 켭니다. 이 튜브의 침을 통해 60 % 자당 용액에 회전 펌프를 통해 연결, 튜브 침을 조립합니다. </li><li> 자당 (흐름 쥐를 펌핑하여 설치를 테스트E : 1 ㎖ / 분), 특히 그라데이션으로 거품을 소개합니다 호스에 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 수동 UV 검출기로 구배 완충액 펌핑 및 기준선 보정 바이 빈 배경 흡수. </li></ol></li><li> 조심스럽게 회에서 침전 샘플 자당 그라디언트를 포함하는 초 원심 분리기의 버킷을 제거하고 얼음에 배치합니다. 해상도의 손실을 방지하기 위해 그라디언트의 범핑을 피하십시오. </li><li> 분별에 실행 그라디언트. 첫 번째 배경 흡수를 평가하고 적절한 기술 설정을 확인하려면 빈 그라데이션을 실행합니다. <ol><li> UV 검출기에 그라데이션을 연결하고 튜브 침과 튜브의 바닥을 관통. 위쪽으로 UV 검출기를 통해 드롭 디스펜서에 침전 샘플 그라데이션을 보이게 할 것인지 60 % 자당의 펌핑을 시작합니다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 sedimenta을 나타내는 피크와, 샘플의 흡수 프로파일을 생성하는 문서화리보솜 소단위, monosomes 및 리보솜의 후속 증가와 연관의 mRNA의 기. </li></ol></li><li> (2 ㎖ 튜브에 600 ㎕의 각) 드롭 디스펜서를 통해 20 분수에 샘플을 수집합니다. </li></ol> 개별 분수에서 5. RNA 격리 <ol><li> 각각의 분획에 1 %의 최종 농도로 10 % SDS를 추가하고 단백질을 전개하고 리보솜을 해리하기 위해 잘 섞는다. 이 시점에서 시료는 -80 ℃에서 냉동 할 수 있습니다 해결되어야 할 질문에 따라 분획 흡광도 프로파일에 따라 풀링 될 수있다. </li><li> 또한 DNA의 오염 성분을 제거 산성 페놀 / 클로로포름 추출과 RNA를 분리합니다. <ol><li> 각각의 샘플 (RT에 데워진) 산성 페놀 / 클로로포름 중 하나 볼륨을 추가, 10 ~ 65 ° C에서 분, 그 후 흄 후드에서 방출 압력 열. </li><li> RT에서 17,000 XG에 20 분 동안 원심 분리기 샘플. 조심스럽게 새로운 1.5 ml로 수상을 전송관. 수성 단계는 원심 분리 한 후 바닥에있을 수 있습니다 밀도 자당 분수, 위상 반전에주의. </li><li> RNA를 침전시키기 위해 한 이소프로판올의 양, 1 / 9 양의 아세트산 나트륨 (pH를 5.2)와 각 샘플 1 μL의 GlycoBlue 추가. -80 ° C에서 샘플을 1 시간 이상 유지 </li><li> 17,000 XG, 4 ℃에서 30 분 동안 원심 분리 GlycoBlue는 펠릿의 시각화를 제공합니다. 뜨는을 제거, 얼음 차가운 80 % 에탄올과 공기 건조 펠릿 한 번 펠렛을 씻으십시오. RNAse가없는 물에 펠렛을 용해. </li></ol></li><li> Nanodrop에 의해 RNA의 양을 정량화하고 Bioanalyzer 칩에 의해 RNA 무결성을 분석 할 수 있습니다. 제시된 프로토콜에 의해 얻어진 RNA는 마이크로 어레이와 깊은 시퀀싱을 포함하여 예술 높은 처리량 분석의 모든 상태에 적합합니다. </li></ol>

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<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

polyribosome 분별이 새로운 기술은 아니지만, 그것은 특히 도전 하나가 남아있다. 입력 재료에 기초하는, 상당한 최적화가 필요할 수있다. 특히 재료의 양이 종종 조직 성분 변환의 mRNA의 분리를 방해 한정 및 지방산이며 생체 CNS 샘플에 대한 경우이다. 대부분의 출판 분별 프로토콜은 효모 또는 포유류 세포 라인을 처리하고, 뇌 12,13,14에 대한 설립 프로토콜이 있습니다. 대조적으로, 척수 분획을 설명하는 모든 출판물 간신히있어, 기존 프로토콜 (15)을 풀링하는 동물의 다수의 척수를 필요로한다. 이러한 이유로, 여러 가지 변형이 필수적인 하나의 마우스 척수 포함한 CNS 조직에 대해 분별 프로토콜을 적응되었다. 사이클로 헥시 미드와 리보솜 고정화는 운영 시간에만 리보솜의 분리를 방지하기 위해 동물 관류하는 동안 수행조직 추출 g의 긴 과정. 그 후, polysom​​al RNA를가 polyribosome 수율을 최대화하기 위해 특정 방식으로 추출된다. 첫째, d​​ouncing하여 조직의 균질화를 제어 그대로 핵을 유지하고 DNA 오염을 방지 할 수 있습니다. 핵은 다음 원심 분리하여 확실하게 제거된다. 세제 NP-40 및 나트륨 데 옥시 콜레이트의 조합은 소포체 막과 연관된 리보솜 동의서의 용해를 보장한다. 또한, 지질이 풍부한 미엘린 내의 UV-흡수 성분은 polyribosome 프로파일을 불명료. 이러한 폴리 리보솜과 같은 조밀 한 화합물 펠렛 등 수초 플로트와 같은 가벼운 화합물 (16)을 제거하는 곳 수초 부상은 필요가있다. 폴리 리보솜은 다음 17.5 % ~ 50 %의 자당 기울기에 침전된다. 대신 수동 각 자당 층 레이어링 및 동결 그라디언트는 그라데이션 혼합기를 사용하여 제조 될 수있다. 산성 페놀 / 클로로포름을 사용하여 분수에서 RNA의 추출 할 수 있습니다 DNA는 최소한의 RNA의 손실을 제거 할 수 있습니다. 그러나, 위상 반전 (일부 16 위) 밀도 자당 분수에서 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 번역의 수준을 해결 기존의 다른 방법에 비해 장점을 제공한다. 예를 들어, 인산화 S6 (눈에 띄는 번역 마커)의 측정뿐만 아니라 방사성 동위 원소와 초기 체인의 라벨 모두 글로벌 번역 수준에 대한 정보를 제공하지만, 구체적으로 번역 된 내용에 조금 알 수있다. Polyribosome 분획 화는 반면에, 평가 해외 번역뿐만 아니라, 변환의 mRNA와 관련된 규제 단백질의 정체성 허용한다. 정량 실시간 PCR은 선택의 mRNA 중 빠른 읽기 격리 된 RNA를 수행 할 수 있으며, 마이크로 어레이 및 차세대 RNA 염기 서열은 게놈 넓은 연구를 수행 할 수 있습니다. 여기에 제시된 최적화 따라서 점감 기술은 CNS 조직의 최소량으로 사용될 수 있도록필요한 동물의 수를 보내고 조직 처리 시간을 감소시킴으로써 전체적인 실험적인 품질을 개선시킨다. 한편,이 기술은 번역하는 것과 실속 리보솜을 구별 할 수 없다. 실속 리보솜을 들고 성적 증명서는 무거운 분수에 침전하고, 데이터를 해석 할 때이 염두에 보관해야합니다. 리보솜은 세포 유형 특정 방식으로 각각 에피토프 태그 또는 기자로 표지 및 면역 (17, 18)에 의해 고립 된 mRNA가 연관되어있는 최근의보고 된 기술, 즉 RiboTaq 함정이있다. 이 기술은 특정 세포 집단에 대한 판독은 고해상도를 제공하는 분획을 polyribosome에 연결될 수있다. 리보솜 발 인쇄가 리보솜에 의해 보호됩니다의 mRNA의 또 다른 소설 작은 조각을 생성하는 핵산 분해 효소의 소화 관련 기술, 또는 &quot;발자국&quot;입니다. 라이브러리는 다음이 발자국의 생성 순서가됩니다. 이 방법의 prov에환산 코돈 고유 전체 게놈 분석 IDES과 실속 리보솜을 식별 할 수있는, 비 8월 코돈과 polyribosome 분획 (19)에 의해 달성 될 수없는 작은 상류 오픈 리딩 프레임을 시작한다. 그러나 polyribosome 분별 따라서 높은 샘플 순도이 종종 요구되는 라이브러리의 제조에 필요한 분자 종 풍요롭게 단일 리보솜을 포함하는 소화 단편의 분리를 위해 리보솜 프로파일에 연결될 수있다. 종합적 polyribosome 분획은 지속 유의성있는 유연한 방법 및 차세대 게놈 시퀀싱 같은 다양한 분석법 등 여러가지 어플리케이션 하류에 연결될 수있다.

유전자 발현은 번역이 가장 주된 효과 1 베어링과, 전사, 번역 및 mRNA와 단백질의 안정성의 결합 작용에 의해 결정된다. 이들 각 단계는 규제가 심한 것이 이제 분명하다. 마이크로 RNA를, RNA 과립, 대체 세포질 폴리아 데 닐화의 형성은 유전자 발현 2,3의 전사 후 조절의 몇 가지 예입니다. 이러한 메커니즘은 각각의 번역에서 전사를 분리됩니다 관심의 생물학적 시스템의 프로테옴에 영향을 미친다. 따라서, 당연히, 홀로 mRNA 수준은 단백질 수준 4의 불완전한 판독한다. 정량 프로테오믹스 그러나 최근의 진보에도 불구하고, 감도 및 단백질 서열 해결에 상당한 제한이 여전히있다, 유전자 발현의 가장 직접적인 평가를 제공합니다. 따라서 translatome 주소, 번역의 mRNA의 레퍼토리는, 공부를 잘 절충을 제공하는사체와 단백체. 그것은 최종 유전자 발현을 평가 transcriptomics보다 더 정확하고, 더 높은 범위와 프로테오믹스보다 시퀀스 해상도를 모두 제공합니다. 포유 동물 시스템에서, 번역 사건의 대다수는 캡 - 의존적 개시를 통해 시작된다. 함께 40S 작은 리보솜 소단위와 진핵 개시 인자의 그룹의 mRNA의 5 &#39;캡에 조립합니다. 단지는 다음의 mRNA를 스캔하고 8월 코돈 시작에 도달하면, 완전한 80S 리보솜 형성하기 위해 60 년대 큰 리보솜 소단위를 모집합니다. 연신 단계는 리보솜 연신율 요인 초기 펩티드 쇄에로드 된 tRNA에서 아미노산의 혼입을 지원하여, mRNA를 따라 이동으로 진행한다. 다중 리보솜 동시에 하나의 mRNA를 따라 진행하고 연관된 리보솜 수가 단백질 합성 5,6의 속도와 상관 관계를 보였다. 이 리보솜 로딩 트란에 대한 신뢰할 수있는 표시를한다slation 적극적으로 침강 속도에 따라 mRNA가 번역을 분리 할 수​​ 있습니다. mRNA를 번역의 정량화 이외에, 시퀀스 정보는 번역 조절에 관여 모티프를 식별하기 위해 얻어 질 수있다. 또한 결합 단백질 및 기타 번역 요인이 관련 규제 단백질의 연구와 발견을 촉진, 다른 분수에서 고립 될 수 RNA. 신경계에서 번역 컨트롤은 mRNA의 저장, 운송 및 지방 단백질 합성 등의 프로세스에 연결되어 있습니다. 성장 콘 축삭 7의 나머지 별개의 mRNA의 특정 지역화 풀 항구 보여왔다. 또, 축삭 단백질 로컬보기 8,9을 합성하는 기능을 갖는다. 그 결과, 번역의 지역 제어는 신경 생물학의 연구의 중요한 화제가되고있다. 이 문제를 해결하기 위해 polyribosome 분획의 전위는 기법을 사용 하였다, 몇몇 연구에 도시 한 내용척수 개발 축삭지도를 조사하고, 뇌의 10, 11에서 BDNF의 활동에 의존 번역을 보여 주었다.

<table><tbody><tr><td>행크' s 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>튜브, Thinwall, 폴리알로머, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate&nbsp;</td><td>시그마</td><td>D5758</td><td>주의</td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>시그마</td><td>C7698</td><td>위험</td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마</td><td>43815</td><td>경고</td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>로슈</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드 용액</td><td>시그마</td><td>93482</td><td>위험</td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase 억제제</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>위험</td></tr><tr><td>나트륨 데 옥시 콜레이트</td><td>시그마</td><td>D6750</td><td>경고</td></tr><tr><td>산 - 페놀 : 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125 : 24 : 1)</td> <td>Ambion</td><td>AM9722</td><td>위험</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce 조직 그라인더, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti 로터, 스윙 버킷, 티타늄, 6 x 14 ml, 40,000 rpm, 285,000 x&nbsp; g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>밀도 그래디언트 분획기</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>애질런트 기술</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 translatome의 생체 심문

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

여러 프로세스의 mRNA와 단백질의 전사, 번역 및 안정성 등의 유전자 발현에 참여하고 있습니다. 각 단계가 밀접하게 단백질 풍요의 최종 역학에 영향을 미치는 규제하고 있습니다. 각종 규제 메커니즘 단독 유전자 발현의 불안정한 표시기 mRNA 수준 렌더링, 변환 단계에서 존재한다. 또한, mRNA의 번역의 지역 규제는 특히 신경 생물학에 관심의 초점을 &#39;translatomics&#39;을 이동, 신경 세포의 기능에 연루되어있다. 제시된 방법은 다리의 transcriptomics 및 프로테오믹스에 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 여러 리보솜에 적극적으로 번역의 mRNA 협회 및 자당 기울기에서의 차등 침강에 따라 translatome를 심문 polyribosome 분별의 기술에 필수적인 수정을 설명합니다. 전통적으로, 특히 센트라의 생체 샘플 작업L 신경계 (CNS)에 의한 재료의 제한된 양의 지방 조직과 성분의 존재에 도전 입증되었다. 하나의 마우스 척수 및 뇌의 사용에 의해 설명되는 것과 같이이 문제를 해결하기 위해, 설명 된 프로토콜은 특별히 CNS 재료의 최소한의 사용하기 위해 최적화된다. 간단히, CNS 조직 추출하고 변환하는 리보솜은 사이클로 헥시 미드와의 mRNA에 고정되어있다. 수초 부상은 다음 지질이 풍부한 구성 요소를 제거하기 위해 수행된다. 분별은의 mRNA가 자신의 리보솜의 상태에 따라 분리 된 자당 기울기에서 수행됩니다. 고립 된 분수는 새로운 게놈 넓은 분석 기술을 포함하여 다운 스트림 분석의 범위에 적합하다.

그림 2는 분류 후 대표 polyribosome 프로필을 보여줍니다. 세포 라인에 대해 전술 한 바와 같이 뇌와 척수의 프로파일 특성 흡수 곡선을 보여줍니다. 작은 리보솜 아 단위 (40S) 가벼운 분수에서 침전물과 바인딩의 mRNA는 큰 리보솜 아 단위 (60S)와 monosome (80S) 바인딩의 mRNA 다음 프로필의 피크로 먼저 나타납니다. 여러 리보솜에 바인딩의 mRNA는 나중에 피크가 결합 된 리보솜의 증가를 표시와 함께, 무거운 분수에 침전. 글로벌 번역은 프로필에서 평가 될 수있다. 예를 들어, 뇌 조직은보다 적극적인 번역을 표시, 척수 조직보다 비율을 monosome하는 높은 polyribosome 있습니다. 개별 분수에서 추출한 RNA는 18S와 28S rRNA의 분포를 보여주는 Bioanalyzer에 의해 평가되었다. 18S rRNA의 작은 리보솜 소단위 라이터 sucr에 침전에 따라, 프로필 이전에 나타납니다<html> OSE의 분수. 총 RNA의 일반적인 수익률은 뇌와 척수 2-4 μg 10-20 μg이다. 개별 분수에서 RNA 수익률은 비율에 따라 각각 4 μg과 뇌와 척수 0.8 μg까지입니다. 빈 자당 기울기는 이미 인해 DTT의 존재로, 260 nm에서 몇 가지 배경의 흡수를 보여줍니다. 이 배경 샘플 값을 정규화하기 위해 데이터 분석에서 차감 될 수있다. EDTA 치료는 침 프로필 번역에 의한 것입니다 보여 polyribosome 피크를 축소. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 워크 플로 및 생체 polyribosome 분별의 잠재적 인 응용 프로그램.&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> 빈 그라데이션과 뇌의 바깥쪽으로 그림 2. (A) 뇌와 Bioanalyzer에 의해 추출 된 RNA의 평가와 척수의 일반적인 polyribosome 프로필. (B) QRT-PCR에 의한 분수에 GAPDH mRNA의 분포. (C) Polyribosome 프로필 EDTA 처리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 배 그라데이션 버퍼 </td><td> 30 mM 트리스-HCl을 pH 7.4로, 30 mM의 MgCl2를 2, 600 mM의 NaCl을, 200 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드 (CHX), 2mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 17.5 % </td><td> 8.67 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 25.6 % </td><td> 12.8 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 33.8 % </td><td> 16.9 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 41.9 % </td><td> 20.95 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 50 % </td><td> 25g의 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> 균질화버퍼 </td><td> 0.25 M 크로스, 50 mM 트리스 / 염산, pH 7.4로), 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 200 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1mM의 phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ㎖ RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M 자당 용액 </td><td> 68.4 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M 자당 솔루션 </td><td> 38.5 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M 자당 솔루션 </td><td> 30.8 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> 시간omogenization B 버퍼 </td><td> 0.25 M 슈 크로스, 50 mM 트리스 / 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25MM의 KCl, 1 % NP-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 </td><td> 200 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제를 1mM DTT, 1mM의 PMSF, 100 U / ㎖ RNAsin </td></tr></tbody></table> 버퍼 및 솔루션의 표 1. 목록.

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

다음 실험의 전반적인 목표는 일차 중추신경계(CNS) 조직 내에서 번역 중인 mRNA를 식별하는 것입니다. 프로토콜은 cycloheximide가 처리된 마우스로부터 관련 조직을 추출하는 것으로 시작합니다. 이후 기계적 균질화와 세제를 이용한 용해 과정을 거칩니다.다음으로 마이엘린 부유법(myelin flotation)을 수행하여 폴리리보솜 프로파일을 가릴 수 있는 조직의 지방 지질 성분을 제거합니다. 리보솜과 결합된 mRNA가 포함된 펠릿을 수크로스 밀도 구배(sucrose gradient) 상에서 침강시켜 리보솜과 결합된 mRNA를 분리합니다. 이후 구배를 분획하여 폴리리보솜 프로파일을 얻으며, 각 피크는 특정 수의 리보솜 또는 리보솜 하위 단위와 결합된 mRNA를 나타냅니다.그 후 폴리리보솜을 포함하는 분획을 정제하여 하위 응용 단계에 필요한 RNA를 얻습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 중추신경계(CNS) 조직으로도 작업이 가능하다는 점과 하위 응용 분야에서 다용도로 활용될 수 있다는 점입니다. 이 방법은 서로 다른 조건에서의 번역 수준 변화, 그리고 번역의 역할, 조절 인자 및 서열 모티프와 같이 신경계의 번역 연구에서 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 생체 내(in vivo) 중추신경계(CNS) 시료의 양이 보통 한정적이며 조직 내에 존재하는 정적 성분들이 폴리리보솜 프로파일을 가릴 수 있기 때문입니다. HBSS와 cycloheximide로 경심장 관류를 마친 마우스에서 빠르게 조직 추출을 시작하십시오. 두개골의 등쪽을 열고 뇌를 적출합니다. 뇌를 얼음처럼 차가운 buffer A로 옮긴 후 뇌 조직을 즉시 잘게 다집니다.다음으로, 흉추와 요추의 척추궁 절제술을 수행합니다. 척수 4cm를 절제하여 얼음 위에 놓인 차가운 buffer A로 옮깁니다. cyclo heide의 흡수율을 높이기 위해 분리된 조직들을 잘게 자른 후, 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.다음으로, 핵이 온전하게 유지되도록 다운 호모게나이저(down homogenizer)로 조직을 분쇄합니다. 뇌 조직의 경우 촘촘한 페스틀(tight pestle)로 5회 분쇄한 후, 메쉬 조직을 튜브로 옮깁니다. 척수 조직의 경우 느슨한 페스틀(loose pestle)로 5회 분쇄한 다음, 다시 촘촘한 페스틀로 5회 더 분쇄합니다.이제 총 RNA 분리를 위해 척수 200 µL와 뇌 조직 분쇄물 400 µL의 분주량을 수집하십시오. 이를 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관하십시오. 핵, 파괴되지 않은 세포 및 조직 파편을 제거하기 위해 조직을 500 ×g에서 10분 동안 원심 분리하십시오.결합된 리보솜이 포함된 소포체 함유 상층액을 수집하고, 핵이 포함된 펠렛은 제거합니다. 다음으로, NP 40 및 sodium deoxy coate 세제를 각각 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하여 소포체 막 조각을 용해함으로써 리보솜을 방출시킵니다. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 신경계 조직을 다룰 때 발생하는 어려움 중 하나는 마이엘린 및 기타 지질 함량이 높은 성분들이 마스터 폴리솜 프로필(Master Polysome profiles)과 함께 나타난다는 점입니다.이 문제를 해결하기 위해, 시작 전 이러한 성분들을 제거하기 위한 부유 밀도 구배 원심분리(flotation) 모델링 과정이 도입되어야 합니다. 먼저 초원심분리기의 버킷과 로터를 4 °C에서 예냉하십시오. 이제 수집된 용해물에 2 M sucrose를 1.22배 부피로 혼합하십시오.각 혼합액을 폴리에틸렌 초원심분리관으로 옮기고 1.1 molar sucrose를 사용하여 관의 부피를 10 milliliters까지 채웁니다. 그런 다음 0.9 molar sucrose를 관 위에 조심스럽게 층으로 쌓습니다. 이제 관을 냉각된 버킷으로 옮기고 buffer B로 균형을 맞춥니다. 균형이 잡힌 버킷을 냉각된 로터에 장착하고 원심분리기를 100, 000 Gs에서 작동시킵니다. 4°C에서 3시간 동안 원심분리하면 리보솜과 RNA가 부유하는 지질 아래로 펠릿화됩니다.마이엘린 부유 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 리보솜이 포함된 펠릿을 버퍼 B로 용해합니다. 그런 다음 NanoDrop 장비를 사용하여 260 nanometers에서 리보솜 용액의 흡광도를 측정합니다. 이 값들로 총 RNA 농도를 추정합니다. 이제 샘플을 준비된 sucrose gradients로 옮깁니다.농도 기울기가 흐트러지지 않도록 주의하고, 대조군으로 빈 농도 기울기 튜브를 포함하십시오. 이전과 마찬가지로 샘플을 넣어 냉각된 버킷의 균형을 맞춥니다. 그런 다음 원심분리기를 4°C에서 285,000 Gs로 1시간 30분 동안 가동하십시오.원심분리기가 회전하는 동안 분획기를 준비하십시오. 먼저, UV 램프 감도를 설정하십시오. 다음으로, 튜브 피어서를 분획기에 장착하고 튜브를 통해 60% sucrose 병에 연결하십시오.중간에 롤링 펌프를 이용하여 수크로스를 분획기에 분당 1 mL의 속도로 펌핑하기 시작하십시오. 기포를 유발하는 공기 누출이 있는지 확인하고 해당 씰을 조이십시오. 그런 다음, 베이스라인을 설정하기 위해 UV 검출기에 그래디언트 버퍼를 수동으로 펌핑하십시오.울트라원심분리기로부터 샘플을 충격 없이 조심스럽게 꺼낸 후 분획기에 넣고, 펀처를 사용하여 튜브 바닥을 뚫습니다. 60% sucrose 펌핑을 시작하여 농도 구배가 UV 검출기를 지나 드롭 디스펜서로 밀려나게 합니다. 260 nanometers에서 흡광도 프로파일을 기록합니다.드롭 디스펜서를 통해 2 mL 튜브에 20개의 분획을 수집합니다. 분획당 600 µL를 수집하고, 각 분획에 10% SDS를 처리하여 최종 농도가 1% SDS가 되도록 샘플 구배를 처리한 후 잘 섞어줍니다. 이제 산성 페놀 클로로포름 추출법을 사용하여 RNA를 분리합니다.실온의 산성 페닐 클로로폼을 1부피분 첨가한 다음, 튜브를 65°C에서 10분 동안 가열합니다. 가열 후에는 흄 후드 내에서 바이알을 조심스럽게 열어 압력을 제거합니다. 그 다음, 실온에서 17,000 ×g로 20분 동안 분획물을 원심분리하고, sucrose 층의 위 또는 아래에 위치할 수 있는 수층을 수집합니다.다음으로, 이소프로판올 1부피, 아세트산나트륨 1/9부피, 그리고 glyco blue 1µL를 첨가합니다. RNA를 -80°C에서 최소 1시간 동안 침전시킨 후, 원심분리를 통해 펠릿화합니다. 그 다음, 냉각된 80% ethanol로 펠릿을 한 번 세척하고, RNA를 다시 펠릿화한 후 펠릿을 공기 건조시키고 물에 재부유시켜 후속 분석을 진행합니다.또는, 샘플을 사용 전까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 공백의 sucrose gradient는 DTT의 존재로 인해 260 nm에서 일부 배경 흡광도를 나타냅니다. 샘플 값을 정규화하기 위해 데이터 분석 과정에서 이 배경값을 뺄 수 있으며, 뇌와 척수 RNA의 프로파일은 특징적인 흡수 곡선을 보여줍니다. 작은 리보솜 소단위체에 결합된 mRNA는 프로파일의 앞부분에 해당하는 더 가벼운 분획으로 침전됩니다.이어서 큰 리보솜 하위 단위체가 나타나며, 단일 리보솜이 결합된 mRNA와 여러 개의 리보솜이 결합된 mRNA는 더 나중 분획에서 침전됩니다. 샘플을 EDTA로 처리하면 폴리리보솜 피크가 사라지며, 이는 침전 프로필이 번역에 의한 것임을 입증합니다. 번역에 관한 세포 유형 특이적 연구를 수행하기 위해 Ribot attack 및 trap과 같은 추가적인 방법을 이 기술과 결합할 수 있습니다.이러한 발전 이후, 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 뉴런 발달 및 질환에서 번역 조절의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 소량의 CNS 조직으로부터 폴리솜 분획을 수행하고 이후 선택한 하위 응용 분석을 위해 RNA를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 진핵 세포의 변이를 번역의 추출을위한 프로토콜을 설명합니다. 일단 추출된, 리보솜은 다른 ribosomal 인구가 분석 수 있도록 자당 기울기 분별 (분리)에 의해 monosomes 및 polyribosomes로 구분됩니다. 따라서이 방법은 번역의 규정을 조사를위한 황금 표준입니다.

진핵세포 Polyribosome 프로필 분석

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

리보솜은 단백질 합성에 중요한 역할을한다. 자당 밀도 구배 원심 분리하여 Polyribosome (polysom​​e) 분별은 게놈 전체의 규모에 개인의 mRNA의 번역 효율을 직접 측정 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 신호 전달 분자 샤페론 및 리보솜과 같은 polysom​​e - 관련 인자의 생화학 적 분석에 이용 될 수있다.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

배우세요 중추신경계 조직에서 폴리리보솜 분별을 이용한 번역체 연구 방법을 마우스 뇌와 척수 조직을 활용하여 번역 중인 mRNA를 분석하고 신경계 번역 조절 메커니즘을 규명하는 데 활용할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

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