다중 약물 내성을 보여 결핵균 증폭 마이크로 어레이

다음 실험의 전반적인 목표는 증폭 마이크로어레이를 사용하여 다제내성 미생물 결핵을 유전형화하는 것입니다. 이는 단일 미세유체 반응 챔버 내에서 마이크로어레이 상단에서 다중 비대칭 PCR을 수행함으로써 달성됩니다. 거기에서 샘플은 동시에 증폭되고, 크기가 선택되고, 단일 가닥으로 만들어지고, 마이크로어레이에 혼성화됩니다.

다음으로, 마이크로어레이를 세척한 후 판독기는 결핵균이 존재하는지, 그리고 리팜핀 iso, 니아지 에탐부톨 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 것으로 알려진 DNA 돌연변이가 포함되어 있는지 보여줍니다. 기존 마이크로어레이 라인 프로브 또는 핵산 혼성화 방법에 비해 이 방법의 장점은 증폭 마이크로어레이가 테스트와의 사용자 상호 작용을 크게 단순화한다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 PCR의 분석 감도와 마이크로어레이의 다중화 용량을 제공하는 동시에 이 절차를 위해 깨끗한 작업 공간을 오염 제거 용액으로 닦아내고 다중 PCR에 충분히 순수한 핵산을 가지고 있습니다.

모든 원액을 해동하고 혼합한 후 PCR 마스터 믹스를 조립합니다. 이 혼합물을 준비할 때 여기에 표시된 결핵 검사를 위해 적어도 하나의 혼합물을 추가로 만드십시오. 또한 마스터 믹스에 T 중합효소를 추가로 첨가합니다.

원자재 시약과 함께 제공되는 점착력의 양 외에도, 1마이크로리터의 샘플 DNA 분취량을 49마이크로리터의 마스터 믹스에 혼합합니다. 각 반응 혼합물 48마이크로리터를 적절한 마이크로어레이의 중심에 조심스럽게 첨가합니다. 마이크로어레이 자체를 만지지 마십시오.

그런 다음 마이크로어레이를 조심스럽게 덮고 부적절하게 밀봉합니다. 커버 슬립을 적용하면 기포가 발생하여 인공물, 증발, 증폭 불량 또는 불균일한 혼성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 조건 중 하나라도 잘못된 결과로 이어질 수 있습니다.

다음으로, 마이크로 속도를 열 순환기에 로드합니다. 기판이 열 블록에 대면 가열된 뚜껑 옵션을 꺼야 합니다. 보편적인 PCR 예방 조치를 따르는 실험실의 경우 슬라이드당 여러 개의 증폭 마이크로어레이를 포함하고 여러 테스트를 동시에 처리하는 것이 더 효율적입니다.

이제 적절한 열 순환 프로그램을 실행하십시오. 이 프로그램에는 50개의 증폭 주기가 있는데, 이는 높아 보일 수 있지만 반응에 의해 생성되는 주로 단일 가닥 앰플리콘 집단 때문에 필요합니다. 반응이 완료되면 마이크로어레이를 제거하고 열 순환기를 종료합니다.

평평하고 집게로 마이크로어레이 챔버를 조심스럽게 엽니다. 슬립, 커버 및 개스킷을 제거합니다. 마이크로어레이는 이 단계로 인해 손상될 수 있으므로 부적절하게 주의하십시오.

개스킷 어셈블리를 제거하면 마이크로어레이의 물리적 손상이 발생할 수 있습니다. 커버 슬립이 구부러지거나 구부러지지 않도록 주의하고 집게로 마이크로어레이 표면이 긁히지 않도록 각별히 주의하고, 이제 마이크로어레이 기판을 조직학 슬라이드 홀더로 옮깁니다. 세척 버퍼의 기질을 실온에서 부드러운 교반으로 10 분 동안 목욕시키고 세척 용액 수조를 따라 탈 이온수로 두세 번 더 세척합니다.

이미징을 진행하기 전에 마이크로어레이를 건조시킵니다. 이 데모에서는 이러한 목적으로 압축 공기의 부드러운 흐름을 사용할 수 있으며, 매개변수는 MDR TB 테스트 및 Econ DX 2100 현장 휴대용 이미저에 따라 다릅니다. 이미저의 파란색 표시등은 준비가 되었음을 나타냅니다.

컴퓨터를 켭니다. conni에서 제공하는 시스템 소프트웨어를 열고 소프트웨어가 카메라와 연결되었음을 알릴 때까지 기다립니다. 다음으로, 건조된 마이크로어레이를 이미저에 삽입합니다.

마이크로어레이가 렌즈 쪽으로 향하고 사용자로부터 멀어집니다. 이제 소프트웨어가 드롭다운 메뉴에서 미리보기 이미지를 제공합니다. MDR TB 분석 스크립트를 선택합니다.

노출 시간을 100밀리초에서 500밀리초 사이로 입력합니다. 과다 노출된 픽셀을 읽습니다. 노출을 조정하여 최소화하십시오.

과다 노출을 최소화하도록 채도가 설정되면 해석을 시작합니다. 이 소프트웨어는 이미지 점수, 샘플 및 배경 강도에 MDRT TB 그리드를 배치한 다음 약물 내성 및 유전형 분석 결과를 보고합니다. 분석이 완료되고 저장되면 이미저에서 칩을 제거하고 새 분석 세션을 시작하여 다음 어레이를 분석합니다.

처리된 각 마이크로어레이에 대한 분석을 계속합니다. 매번 데이터를 저장합니다. 정성적 이미지 분석은 자동화된 이미지 분석 소프트웨어로 생성된 데이터 테이블에서 식별하기 어려운 실험 노이즈 또는 변동성의 원인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

아티팩트가 없는 고품질 배열이 여기에 표시됩니다. 몇 가지 인공물은 후광을 생성하는 거품의 도입으로 이어질 수 있습니다. 어레이 아티팩트에도 불구하고 소프트웨어는 여전히 스캔에서 값을 검색합니다.

진단보고 알고리즘은 값을 얻음에도 불구하고이 배열을 유효하지 않은 것으로 인식합니다. 야생형 H 37 RA 게놈 DNA의 희석 시리즈를 1, 250 세포에 해당하는 6.25 피코그램의 마이크로어레이 PCR 템플릿에 사용했습니다. 모든 프로브가 감지되었습니다.

SNR 값이 3 이상이면 긍정적인 결과이며 등록된 값이 훨씬 더 높았습니다. 다음으로, 세계보건기구(WHO) 참조 분리물을 유전형화했습니다. 어레이에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성은 MDR TB 게놈에서 해당 돌연변이로 검출되었습니다.

근이웃 돌연변이(near neighbor mutations)를 감지하는 몇 가지 예도 분명했습니다. 텍스트 프로토콜에 대한 설명이 제공됩니다. 이 기법은 일단 숙달되면 DNA의 농도, 특이적 분석, 열 순환기의 효율성 및 균일성, 원하는 분석 또는 임상적 민감도 및 특이도에 따라 약 3시간 반에서 6시간 30분 안에 완료할 수 있습니다.

또한, 증폭 주기의 수와 증폭 후 혼성화 시간을 쉽게 단축하거나 연장하여 원하는 성능 특성을 얻을 수 있습니다.