Name: 설정 - 업 체외 모델 (BBB) : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: 배우세요 쥐 혈관내피세포와 성상교세포 공배양을 이용한 체외 혈뇌장벽 모델 설정법을. 이 재현 가능한 방법은 약물 전달 메커니즘 연구와 중추신경계 치료제 개발에 활용됩니다.

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VECT - HORUS에 대한 금융 지원은 드퐁 고유 Interministériel (FUI / MEDUL 프로젝트)하고 VECT - HORUS과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC 및 PREVENTAD 공동 프로젝트)에서 UMR7259 실험실에서 인정 . UMR7259 연구소는 CNRS에서와 엑스 - 마르세유 대학이 재정 지원을 인정합니다.

쥐 성상 1. 생산 각 준비는 섹스 중 하나의 10 신생아의 Wistar 쥐를 사용하십시오. <ol><li> 가위로 머리를 절단하고 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 즉시 전송하여 쥐를 희생. 소뇌없이 두개골에서 뇌를 제거하고 차가운 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 즉시 전송 : HBSS 1 % 소 혈청 알부민 (독소 BSA의 낮은 수준), 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 2 대뇌 반구를 분리하고 얼음에 해부 버퍼 깨끗한 세균 배양 용 접시에 그들을 전송, 절반의 머리를 잘라. 시신경을 잘라 실체 현미경을 이용하여 수막을 제거합니다. </li><li> 차가운 해부 버퍼 50 ㎖에 광범위하게 대뇌 피질의 조각을 씻으십시오. </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 3 뇌에서 대뇌 피질의 조각을 넣고 피펫 팅에 의해 쿠데타 아래 해리EDTA 5 분 0.02 %를 37 ° C에서 - 르 0.05 % 트립신 6 ㎖에 파란색 팁이 장착 된 10 ㎖ 일회용 피펫 회 </li><li> 24 10 % FBS와 보충 DMEM의 ML 다음과 같은 항생제, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖, 아교 세포 미디어 (GCM)라는 이름의 미디어, RT에서 5 분 300 XG에 원심 분리기를 추가합니다. FBS의 배치는 성상 세포 cutures의 성장과 생존을위한 선택과 검증되었다. </li><li> 75cm 2 T-플라스크 (T75)에 10 ㎖의 GCM 플레이트에서 해리 세포를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 세포의 파편과 DNA를 제거하려면 다음 하루 매체를 변경합니다. 일주일에 두 번 배양액을 교체합니다. </li><li> 확산 후 1 주일 후, 부드럽게 GCM에서 37 ° C에서 24 시간 동안 60 rpm에서 진탕와 glial 세포를 흔들. T75는 37 ° C 습한 분위기에서 5 % CO 95분의 2 % 년 공기 인큐베이터에 배치 할 수없는 경우, 5 mM의 HEPES와 미디어를 보충합니다. R로 두 번 세포를 씻으십시오비 점착성 미세 아교 세포를 emove. </li><li> 3 주 파종 후, 칼슘, 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 따뜻한 트립신 0.05 %-EDTA 0.02 %의 3 mL를 넣고 37 ° C에서 배양 및 세포 층 (일반적으로 5 분) 분산 될 때까지 기다립니다. , GCM 10 ㎖를 추가하여 트립신의 활동을 억제 8 분 120 XG에 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 90 % FBS의 성상 세포 펠렛을 재현 탁 - 10 % DMSO, 액체 질소 (2 × 10 6 cryovial 당 세포) 및 저장 cryovials로 전송할 수 있습니다. </li></ol> 쥐 뇌 미세 혈관의 2. 격리 우리의 실험 절차는 마르세유의 의료 학부의 윤리위원회의 승인을 국가와 유럽 규정 (EU 지침 번호 6백9분의 86)을 준수합니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용 된 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다. <ol><li> 각 준비를위한 하나의 experimente에 대한R, 3 오주 이전의 Wistar 쥐를 사용합니다. </li><li> 첫 번째 주 월요일, 모두 무균 배양 물에 1 ㎍ / cm 2 (T75 당 10 ㎖)에, 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴으로 코팅하여 2 T75 플라스크를 준비합니다. 미세 혈관 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 첫 번째 주 수요일 아침, 졸음을 유발하는 CO 2의 증가 흐름에 따라 쥐를 안락사, 자세와 호흡 중단의 손실은 다음 자궁 경부 전위 하였다. 70 % 에탄올로 스프레이 헤드. 가위로 머리를 잘라 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 그들을 전송합니다. </li><li> 얼음에 냉각 차가운 해부 버퍼로 가득 페트리 접시에 그들을 전송 한 후, 소뇌 및 시신경없이 두개골에서 뇌를 제거 (HBSS는 1 % BSA, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖로 보충) . </li><li> 용에서 2 대뇌 반구와 별도의 중뇌를 분리하는 반 머리를 잘라ebrain. 해부 버퍼 얼음에 깨끗한 페트리 접시에 forebrains을 전송합니다. </li><li> 주의 깊게 N ° 5 곡선 집게와 실체 현미경 forebrains에서 수막을 제거하는 차가운 해부 버퍼를 새로운 배양 접시에서 반구의 정도 소요. 그런 다음, 수초의 이불을 제거하고 껍질의 쉘을 얻을 수있는 뇌의 내부를 청소합니다. 이 단계는 조직의 보존 및 세포 생존을위한 2 개 이상의 시간이 걸릴 수 없습니다. </li><li> 다른 간극의 2 방앗 공이 각각 10 상하 스트로크, 20 μm의 다음 71 μm의에 의해 균질 다운스 7 ㎖의 차가운 해부 버퍼 6 ㎖에 3 두뇌의 피질을 떼어 놓다. </li><li> RT에서 5 분 1,000 XG에 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기 1 ㎖에 1 피질의 등가를 얻기 위해 서스펜션을 나눈다. 상층 액을 버린다. </li><li> 콜라게나 제 / 디스 파제의 혼합 (60 ㎍ / ㎖의 정보 R을 포함하는 효소 용액 1 ㎖로 한 외피로부터 현탁액 다이제스트11; 0.3 U / ㎖), DNA 분해 효소 타입 I (35 ㎍ / ㎖의 - 20 K 단위 / ㎖) 및 37 ℃에서 30 분 동안 진탕에서 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖) </li><li> 1 ㎖의 10 25 % BSA / HBSS 1X ㎖의 실온에서 15 분 동안 3,600 XG에 따라 밀도 원심 분리하여 별도의와 1 피질에서 소화 섞는다. 조심스럽게 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 위 디스크 (myelin의 뇌 실질 조직)과 뜨는을 전송하고 원심 분리를 반복합니다. 4 ℃에서 뇌 미세 혈관을 포함하는 결과 펠렛을 유지 </li><li> 조심스럽게 상단 디스크와 상층 액을 버린다. 차가운 HBSS 1X 1 ㎖와 뇌의 미세 혈관을 포함하는 두 결과 펠렛을 재현 탁하고 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 5 분 1,000 XG에 20 차가운 HBSS 1X ㎖의 원심 분리기를 첨가하여 미세 혈관을 씻으십시오. 상층 액을 버린다. </li><li> 또한 쉬에서 37 ° C에서 1 시간 동안 단계 2.9과 동일한 효소 용액 1 ㎖를 1 피질에서 미세 혈관을 소화AKER. </li><li> 그런 다음, 하나의 튜브에 3 피질의 각에서 소화 미세 혈관을 혼합하고 추가 튜브 당 1과 2 분의 1 (1.5) 피질의 동등한에서 추출 된 미세 혈관을 얻기 위해 두 개의 50 ㎖ 팔콘 튜브로 구분합니다. RT에서 5 분 1,000 XG에서 차가운 해부 버퍼와 원심 분리기 30 ML을 추가합니다. </li><li> 20 % 소 혈소판별로 혈장 유래 혈청, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF,이 NG / ㎖), 헤파린 (100 ㎍ / ㎖), 겐타 마이신 (50 ㎍ / ml)로 보충 된 DMEM/F12 10ml에 미세 혈관 펠렛을 재현 탁 와 HEPES 내피 세포 미디어 (ECM)라는 이름의 (2.5 mM)을, 4 ㎍ / ml로 마이신과 보충. </li><li> , 인큐베이터에서 2 코팅 T75 플라스크을 코팅의 과잉을 대기음 한 T75 플라스크 (T75 플라스크 1.5 피질에서 추출 된 미세 혈관)의 각 관에서 미​​세 혈관을 접시. </li></ol> RBEC Primocultures 3. 정제 및 대량 살상 무기 확산 <ol><li> 정화 : 수요일, 금요일에, purom 추가ycin 배양 배지 4 ㎍ / ml로. 목요일에 매체를 변경합니다. 금요일에, 월요일까지 2 ㎍ / ml로 세포를 씻어 퓨로 마이신을 추가합니다. </li><li> 대량 살상 무기 확산 : 두 번째 주 월요일에, 세포를 세척하고 문화가 두 번째 주 수요일에 90 %의 합류에 도달 할 때까지 배양 배지에 인슐린, 트랜스페린과 셀렌 산 나트륨 보충을 추가합니다. </li></ol> . 4 차별화 : 체외 BBB 모델 설정 <ol><li> 두 번째 주 월요일 (상단 구획 믹스 500 μL 모두 무균 배양 물에 0.5μg/cm 2에서 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴의 혼합 코팅 필터 (폴리에틸렌, 12 우물, 기공 크기 1.0 μm의) 준비 하부 격실에있는 무균 배양 물 1.5 ㎖). RBEC 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 두 번째 주 월요일 5 일 공동 문화의 설립 전에, 37 ° C와 전송에 cryovials의 성상 세포를 해동10 ㎖의 GCM과 15 ML 팔콘. 실온에서 13 분 동안 120 XG에서 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 12 - 웰 플레이트에 cm 2 당 30 × 10 3 세포의 밀도로 GCM과 판의 성상 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 두 번째 주 수요일, 단지 트립신 RBEC의 분리하기 전에, DMEM/F12 배지로 두 번 사전 코팅 필터를 세척한다. 아래 칸에 1.5 ㎖의 상부 구획에 0.5 ㎖ : ECM과 챔버를 미리 입력합니다. </li><li> 두 번째 주 수요일, 칼슘과 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 RBEC 씻는다. 정확히 30 초 동안 T75 플라스크 당 37 ° C에서 EDTA 0.02 % 용액 - 따뜻한 트립신의 4 ml의 0.05 %를 추가합니다. 이어서 트립신 용액 3.5 ㎖를 제거하고 현미경으로 관찰한다. 세포층은 매트릭스에서 분리 모든 셀이 플로팅 될 때까지 온화 T75 플라스크의 가장자리를 눌러이를 돕기 시작하면. </li><li> T75 플라스크 당 ECM의 10 ML을 추가하고 15 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 아주 부드럽게 세포를 해리노란색 팁 탑재 10 ㎖ 피펫으로 다운 4 회 피펫 팅에 의해 현탁 (용액 중의 기포의 생성을 방지). 현탁액에있는 세포 (약 3 × 10 6 cells/T75)를 즉각 세고 높은 밀도 (160 × 10 3 셀 / 필터, 따라서 약 18 filters/T75) (그림 8에 미리 코팅 및 프리 필드 필터에 접시 ). 다음 날 (목요일), 세포 파편을 제거하기 위해 상부 구획의 두 배 매체를 변경합니다. </li><li> 두 번째 주 목요일, 공동 문화의 설립 전날, 기초 구획에서 1 / 3 에어컨 매체로 보충 할 수있는 차별화 매체의 1.5 ML (500 nm에서 하이드로 코르티손과 ECM)에 의해 성상 세포 배양 배지를 교체 (내피 세포와 성상 세포 사이의 접촉의 3 일) 공동 문화 이전의. </li><li> 두 번째 주 금요일은 차별화의 날 0으로 정의된다; 필터 콘타에서 배양 배지를 교체차별화 미디어 RBEC ining. 성상 세포를 포함하는 우물에 RBEC 필터를 전송합니다. 이러한 조건에서, 체외 모델은 차별화하고 3 일 이내에 접합 관련 단백질을 표현한다. </li><li> 모델은 세 번째 주 월요일과 수요일 사이에 3 일 이상 동안 자신의 최적의 분화를 유지합니다. </li></ol>

Michel Khrestchatisky는 UMR7259 연구소의 소장이자 VECT-HORUS 생명공학 회사의 공동 창립자이자 과학 고문입니다.

우리는 RBEC의 정화와 문화를 다음과 추가 특성 BBB 특성을 가진 생체 BBB 모델을 생성하는 기본 쥐의 성상 세포와 공동 배양의 설정, 뇌의 미세 혈관의 분리 및 도금 주간 재현 프로토콜의 구현을 설명합니다. 성공적으로 체외 BBB 문화에서 표준화 수립하는 프로세스의 여러 순차적 단계에서 최적의 조건을 필요로한다. 모델은 (a) 시험 관내 BBB 모델 &quot;성배&quot;남아 있고, (b) 및 유출 RMT 메커니즘에 대한 유효성 세포층 낮은 투과성을 얻을 수 있도록 최적화되었다. 생산, 정제 및 RBEC의 대량 살상 무기 확산 RBEC 재배의 가장 큰 문제는 서로 다른 문화 간의 재현성을 달성하는 것입니다. 프로토콜의 표준화가 표시 높은 품질 도구가 필요합니다섹션 고품질 시약 및 시약 만료일 대하여. 실험은 피질 표면에서 수막 및 대형 선박의 신속한 제거를 위해 입체 현미경 미세 해부에 숙련 될 필요가있다. 뇌가 절연 및 기계적 해리되면, 주요 과제 중 하나는 갓 격리 뇌 미세 혈관의 최적 소화 효소이다. 사용되는 효소의 종류와 품질이 중요하다. 일괄 처리 사이의 낮은 변동성과 높은 농도의 콜라게나 제 I 형 및 II와 디스 파제의 혼합 사용 하였다. 또 다른 중요한 효소 소화 기간과 소화 효소의 농도 / 티슈 중량 / 부피 사이의 비율이다. 뇌 미세 혈관 생산 최고의 수율은 30 분 ~ 1 시간에 각각 두 digestions 동안 60 ㎍ / ml로 혼합 디스 파제 / 콜라게나 제 1 ㎖에 1부터 뇌 피질의 등가 얻었다. 또 다른 중요한 세포 오염의 제거이다S (성상 세포, 주로 혈관 주위 세포). 이들 세포는 내피 세포보다 더 높은 속도로 증식 및 양호한 세포층 제한성으로 균질 세포 단층의 설립을 방지 후자 타이트 접속점을 설정하지 않는다. 비 - 내피 세포가 제거되는 동안 뇌 내피 세포는 미세 혈관에있는 다른 세포 유형에 비해 유출 펌프의 훨씬 높은 수준, 특히 P-GP를 표현하는 것을 고려하여, 그들은 더 P-GP 리간드 약물 달리 독성 농도를 용인. 처음 두 일 4 ㎍ / ml로 마이신 치료가 좋은 내피 세포의 순도를 얻기 위해 2 ㎍ / ㎖의 두 일 이상으로 이어졌습니다. 이 선택은 또한 세정맥, 전 모세관 동맥 이상 미세 혈관에서 그 대 모세 혈관 내피 세포를 선호하고, 엄격한 단일 층으로 이어질 수 있습니다. 또, 불량 혈장 유래 혈청의 사용은 내피 세포 47,48의 순수 배양을 얻는 것이 필수적이다. 플라즈마 데르ived 혈청 평활근 세포에 대해, 따라서 혈관 주위 세포를 들어, 섬유 아세포를위한 분열 촉진 혈소판 - 유래 성장 인자 (PDGF)를, 결여된다. 우리는 쥐의 꼬리에서 전통적으로 권장 콜라겐 I 형에 비해 확산 수익률의 2 배 증가, 생쥐와 인간 피브로넥틴은 상당한 이점을 얻을 수에서 콜라겐 유형 IV의 혼합 플라스틱 및 필터의 치료를 관찰했다. 세포 증식에 중요한 단서가 같은 인테그린 및 성장 인자 (bFGF를) 활성화 49과 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 의해 제공된다. 버퍼 농도와 배양액의 pH는 세포층의 견고 (50)에 긍정적 인 영향을 설명하고 우리는 5 ㎜로 HEPES 버퍼의 추가와 문화 사이의 더 나은 재현성을 관찰했다. 삽입 필터에 공동 문화 구축 : RBEC의 분화 뇌 혈관 내피 세포는 ㄴ하면EEN은 정제 6 일 동안 증식 한, 그들은 필터에 도금 될 수있다. 고밀도 셀 도금은 완벽한 단일 층을 얻을하는 것이 중요합니다. 12 웰 플레이트 필터 당 160x10 3 세포의 파종 밀도는 파종 후 합류 단층 24 시간을 얻기 위해 필요 충분했다. 그러나, 자신의 환경으로부터 기본 뇌 모세 혈관 내피 세포의 분리는이 일차 전지 및 특히 뇌 모세 혈관 내피 세포를 강하게 그들의 환경 규제와 유도 요소에 의해 생성되는 것으로 알려진 바와 BBB 시험 관내 모델을 건설 역설 다른 주변 세포 유형. 뇌 모세 혈관 내피 세포는 단독으로 신속하게 해제 차별화를 배양하고 일부 특정 뇌의 혈관 내피 세포 마커를 풀어. 따라서, 기본 내피 세포는 낮은 통로 (P1)에서 사용되어야하고 다시 연결, 적어도 부분적으로, 성상 세포 47,51에 의해 조절 성상 세포 또는 매체와 공동 배양하여 자신의 환경. 이 보유뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포와 같은 성상 세포의 분화에 대한 사실은 양방향 유도에 참여하고 있습니다. 성상 세포와 RBEC을 배양하는 것은 interendothelial TJ 52,23 강한 유도되었다. 다시 유도의 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아 있고, 연구는 최적의 내피 세포 분화 (53, 54)을 촉진 할 수 성상 세포에 의해 분비되는 특정 변조 요소를 식별하는 여러 실험실에서 진행되고있다. 백혈병 억제 인자 (LIF) 등의 뇌 혈관 내피 세포에 의해 분비 요인 성상 세포의 분화 (55, 56)을 유도하는 것으로 나타났다. 공동 문화 구축하기 전에, 성상 세포는 글루코 코르티코이드 수용체 작용제 하이드로 코티손을 포함하는 차별화 매체에 노출 및 공동 문화 매체를 가동했다. 하이드로 코티손은 뇌 내피 세포의 기밀성을 향상시키기 위해 공지되어 있고, 특히 57 래트 및 마우스 58,59 내피 세포로부터 BBB 모델에서 사용된다. 에어컨 메디음은 3 일 후 내피 세포 / 성상 세포 공동 배양 시스템의 하부 구획에서 수집하고 나중에 사용하기 위해 냉동. 공동 문화 에어컨 매체의 사용은 2 일 이상 최적의 세포층의 투과성과 문화 사이도 향상 재현성 3 일 내피 세포 분화의 시간을 감소시켰다. 전반적으로, 우리가 설명하는 프로토콜은 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm 가장 기본 셀 기반 BBB 모델 22과 유사 / 분, 300 옴을 통해 재현 봉사자 · cm 2, 평균 세포층의 투과성 계수 PE (LY)를 산출 12. 우리는 미세 혈관 효소 소화의 제안 변조하여 본 논문에서 설명하는 프로토콜은 쥐의 척수 (60)와 쥐의 뇌에서 내피 세포 확장 할 수 있습니다. 분자 및 기능적 특성 게다가TJ 유도로, 성상 세포는 뇌의 내피 세포 (61) P-GP로 유출 트랜스 포터의 발현에 기여한다. 우리는 실제로 BBB 모델의 유출 운송업자 P-GP의 발현을 표시하고 우리는 생화학 적 방법을 사용하여 P-GP 유출 펌프 국산화의 극성을 설명하고, P-GP 활동의 기능 분석을 사용하여. GLT-1의 발현은 미세 혈관의 기저 막 분획에서 검출 되었으나 배양 RBEC 검출되지 않았다. 우리는 GLT-1 아래에있는 생체 조건과 웨스턴 블롯 분석에 의한 결과 불검출에 비해 우리의 RBEC 문화에 규정 된 가설. 과도한 글루타메이트는 신경 독성과 생체 내에서, GLT-1은 혀끝의 구획 (혈액 순환)에 기초 함 (실질)에서 글루타메이트 유출에 대한 책임이 있습니다. 성상 세포 배양에서는 GLT-1의 발현은 매우 낮게 유지되고 매체 62, 63에 글루타메이트를 첨가함으로써 유도된다. 우리는 또한 믿어IRM 같은 LRP1, LDLR 및 TFR로 정점 막에 유입 운송업자의 표현. TFR과 LDLR의 기능은 이전에 체외 BBB 모델 64 소와 같이 단일 층의 abluminal 측에 내강에서 TF-를 Cy3와 DiLDL의 실험을 바인딩 및 전송 시연했다. 흥미롭게는 성상 세포에서 그 지질 요구 (65, 66)는 상기 체외 포함한 교세포와 뇌 내피 세포 간의 생리적 누화를 확인한 뇌 모세 혈관 내피 세포에 LDLR의 발현을 증가 보여왔다. 우리는 형광 염료로 전송을 예시하기로 선택한 예 를 Cy3와 DII는 spectrofluorimetric 분석은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있으며, 시험 관내 BBB 모델에서 유효성을 검사하는 데 유용 할 수 있다는 생각으로. 그러나, 형광의 정량화는 방사능보다 훨씬 덜 민감하고 중요한 데이터를 얻는 실험을 수의 증가를 요구한다.이상적은 Tf 및 LDL은 바인딩 / 흡수 및 전송 실험에 보통 (요오드 125) 방사성 동위 원소이다. 우리는 또한 제안 된 프로토콜을 얻은 차별화 된 내피 세포의 단층이 CCL2 해제하고 BBB 개방에 의해 밝혀로, TNF-α에 의해 유도 된 염증 반응을 보여준다. CCL2는 (MCP-1)와 그 수용체 CCR2는 다중 경화증, 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 67, CNS 외상 (68)와 신경 염증성 조건 69, 70에서 CNS에 백혈구 이동의 매개체로 알려져 있습니다와 같은 중추 신경계 병변에 참여하고 있습니다. BBB 개방은 CCL2 농도가 위 (꼭대기)와 하부 (기초) 구획 둘 사이의 평형을 할 수 있기 때문에 테스트 프로토콜로, 우리는 CCL2의 편광 분비에 결론을 내릴 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 분명히 24 시간 (그림 5A)의 정점 구획에 RBEC에 의해 생성 CCL2의 양을 과소 평가하는 경향이있다. 일반 개요 및 체외 모델에서 BBB의 제한 : 나는 N 생체 대 생체 외 및 설치류 인간의 비교 대 체외에서 BBB 통로에 효과가 입증 많은 유망 CNS 약물은 종종 인간 이외의 종에서 분리 된 세포를 기반으로 생체 BBB 모델에 의한 예측의 부족으로 임상 시험에 실패했습니다. 이 단백질 네트워크, 신호 전달, 수송 및 수용체의 기계적인 측면을 공부에 관해서는 우리가 아는 한, 체외 BBB 모델은 아마 예측이다. 체외에서 공부하는 모든 장치, 경로 또는 대상은 같은 동물의 종으로 보완 환경 단서 (다른 세포 유형, 화학 물질, 단백질)에 의해 조절에 대한 특징과 현장 연구에 결합 할 수있다및 제한 사항 및주의, 인간으로부터 격리 미세 혈관 내피 세포, 가능한 아래 유발합니다. 체외에서 BBB 모델은 몸의 규제에서 분리 된 자동 시스템으로 볼 수있다,하지만 여전히 중요한 생체 내 특성과 환경 단서에 의해 규제 가능성을 부여. 내피 세포 단일 층은 신경 교세포 혈관 장치 (NGVU)의 중요한 구성 성분의 수 부족과 혈액 및 신체 조절 분리되어 있기 때문에 더는 &quot;이상적인&quot;체외 BBB 모델은 아직 71,72,73를 제안하지 않았습니다. 혈관 주위 세포 74,16 또는 17,18 뉴런 또는 플라스틱 코팅 또는 내피하여 가장 일반적이고 &quot;쉬운 제&quot;체외 BBB 모델에서 세포 성장을 위해 사용 배지 및 혈청 사용 외 기질의 서로 다른 성분의 부족 성상 세포로 분화 된 세포가 단백질 발현을 조절 제가있다n은 생체 내 상황 75과 비교. 이러한 모델은 생체 내에서 표시 많은 수송을 표현하지만, 모든 수 있습니다. 일부의 경우, 전송 매개 변수는 제 고립 미세 혈관 (생체 내 상황에 가장 가까운)에서 검증 한 후, 세포 배양 시스템 76,61 공부. 분자 생물학 연구를 허용 한 같은 종에서 고립 된 미세 혈관과 낮은 통로 내피 세포 배양에있는 유전자와 단백질 발현의 특성, 그리고 다른 종 사이에, 가장 자주 설치류 (쥐 및 쥐)로 또는에서 소와 돼지의 작은 동물에서 인간 77,78,75,15 비교. 생체 내 및 생체 외 뇌 미세 혈관 내피 세포 사이의 Transcriptomic 비교 차별적 표현과 자주 크게 체외에서 하향 조절 된 다수의 유전자 사본을 보여 주었다. 이러한 TFR 및 홍보 등의 유입 수송을 인코딩 성적 증명서소포 인신 매매에 연루 oteins는 주로 세포 내 이입과 기공을 갖는 전송의 일반적인 감소를 제안하고, 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 하향 조절된다. 순도 (퓨로 마이신 처리) 및 하이드로 치료의 관점에서 문화의 조작보다 &quot;생체와 같은&quot;유전자 발현 프로파일 (77)을 복원하는 데 도움이 될 수 있습니다. Transcriptomic 연구는 또한. 인간의 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 체외 BBB 모델 (15)를 설명 하였다 또한 체외 BBB 모델 75 설치류를 기반으로 인간의 약물 흡수에 대한 예측을 복잡 종 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 관련 비록 그들이 사후 인간 조직에 규제 액세스를 필요로하고 이질성은 연령, 질병, 그리고 아마도 의료에 따라 인간의 뇌 내피 세포의 품질 / 속성있어, 이러한 모델은 정기적으로 구현하기가 더 어렵다 treatmen기증자의 t. 노력은 더 생리 해부학 및 생체 BBB의 기능적 특성을 재현 신규 체외 모델을 개발하기 위해 만들 수있다. 세 종류의 세포를 포함하는 공동의 문화는 매우 제한하고 정기적으로 구현하기 어려운 나타납니다. 현재까지 가장 복잡한 체외 BBB 모델은 성상 세포와 혈관과 같은 조직을 포함하고 혈액의 흐름 75,79,80,81,82을 모방 매체의 흐름을 포함하는 동적 체외 모델 (DIV-BBB)입니다 83,84,85. 대뇌 내피 세포가 흐름에 노출되는 경우, 생성 된 전단 응력은 세포 분열, 분화, 이동 및 아폽토시스 80 내피 세포 생리학에 관련된 다른 유전자의 발현을 조절하는 세포 표면에서 mechanotransducers를 활성화한다. 생체, 전단 응력 혈류에서 생성의 확립을 허용 세포 접촉에 유사 분열 정지를 책임진다혈관 (80)의 내피 세포 단일 층. 정상적인 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포의 게놈 및 단백질 체학 분석 BBB 내피 생리학 (84)에서 전단 응력의 ​​영향을 보여 주었다. 전단 응력은 CYP450에 의해 매개 75,86, 산화 75 효소 및 세포의 생존, 내피 세포 접착의 높은 수준, 유출 펌프 유도 및 운송 75, 포도당 대사의 조절을 더 잘 편광에 대한 책임의 표현을 증가시켜 세포층의 투과성을 조절 occludin과 ZO-1 87,75,80 결과적으로 높은 티이 같은 세포 간 접합부 요소에 대한 코딩 유전자의 1,500 - 2,000 옴 · cm 2, 생체 내에서 알려진 가장 가까운는 79,80 매개 변수 생명 공학 및 제약 산업에서 약물 또는 높은 처리량 검사 (HTS) 및 동물 실험을 줄이기위한 노력의 일상적인 검사가 주도셋업 일상적 어려워 남아 대뇌 내피 세포의 일차 배양 보충에 사용되는 상이한 세포주의 개발. 대부분의 경우에, 대뇌 내피 세포의 일차 배양은 레트로 바이러스 벡터를 사용 88,89,75 플라스미드 DNA의 형질 감염 또는 감염에 의해 하나, 불멸화 유전자 (SV40 나 폴리오 마 바이러스 큰 T 항원 또는 아데노 바이러스 E1A)로 형질 도입 하였다. 뇌 유래의 여러 내피 세포 라인은 RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS 또는 rBCEC4 쥐 세포주 88,75, b.End3 마우스 세포주 90,75, PBMEC/C1에게로 개발되고있다 - 2 돼지 세포주 87,75 및 hCMEC/D3 인간 세포주 89,75. 다른 모델은 같은 Madin-다비 개 신장 (MDCK) 또는 Caco2 세포주 12,75 같은 비 대뇌 유래의 세포를 기반으로합니다. 다른 인간 대뇌 내피 세포주 중에서도 hCMEC/D3 널리 인용되었다D 2005 년 91, 92 년에 설립 된 이후 BBB의 모델로 개선되었다. 차 문화, 세포주 선물 한 장점과 단점이있다. 그들은 차 문화를보다 쉽게​​ 처리 할 수​​ 있습니다 확장 된 수명을 가지고, 잘 특징 및 대규모 실험 사이의 재현성을 할 수 있습니다. 그러나, 세포주, 조직 고유의 기능을 잃게 환경 규제를 잃고 생체 75, 89에있는 세포와는 다른 분자 표현형을 획득 할 수있다. 특히, 세포주 현재 감소 압박감, 낮은 봉사자 및 쇼 수송 프로파일 변화 75,89에서 생성 된 단일 층. 따라서 일차 전지에있는 동물 실험이나 연구는 종종 자신의 복잡성에도 불구하고 바람직하다.

중추 신경계 (CNS)을 치료하기 위해 개발 된 대부분의 약물은 질환 치료 관련 농도에서 뇌 실질에 도달 할 수 없습니다. BBB는 병원체로부터 혈장 조성물의 변동으로부터 뇌 신경 조직을 보호하고, 뇌 (1) 내로 및 밖으로 이온, 펩티드, 단백질 및 심지어 세포의 비특이적 자속을 제한함으로써 뇌 실질 조직의 항상성을 유지한다. BBB의 특성 등의 신경과 전문 클래스 뇌 미세 혈관 내피 세포와 신경 교세포 혈관 장치의 주변 요소 (NGVU) 사이의 친밀한 근접하고 크로스 토크 (cross-talk)에 의해 유도 및 유지, glial 세포 (정확하게 성상 세포 최종 피트), 및 혈관 주위 세포는 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸 2,3의 주로 구성되어 기저막에 ensheathed. 모세관 수준에서 내피 세포의 32 %와 중요한 재생 - 혈관 주위 세포는 약 22를 커버내피 세포의 증식, 혈관 신생과 염증 과정의 조절에서 역할. 내피 세포는 모세 혈관의 내면을 덮는 연속 시트를 형성한다. 이들은 꼭대기 영역에 띠 형상 구조를 형성하고 그 편광 셀에 올릴 TJS 의해 상호 접속된다. 성상 세포는 BBB 속성을 조절하고 TGF-β, GDNF, bFGF에와 IL-6와 같은 중요한 규제 요소의 소스입니다. 불완전한 기능을 GFAP 결핍 성상 세포는 BBB 속성 4를 조절 할 수 없습니다. 뉴런은 직접 BBB의 형성에 구조적으로 참여뿐만 아니라, 단백질 발현 및 BBB 기능 5의 중요한 측면을 조절하지 않습니다. 상기 BBB의 구조, 생리 및 병리를 연구하기 위해, BBB의 시험 관내 모델 연구 도구로 개발되었다. 뇌 혈관 내피 세포 기반 체외 BBB 모델에서 구현하는 다양한 종에서 추출 된소 6,7에서 낮은 통로 차 문화, 돼지 8, 9, 10,11,12 쥐, 마우스 (13) 또한 인간의 14, 15에. 이 모델은 생체 BBB를 모방하는 것으로 알려져있다 특히 쥐 또는 쥐 및 / 또는 혈관 주위 세포 16,12에서 glial 세포 및 / 또는 신경 전구 세포 유래 성상 세포 (17) 및 / 또는 신경 (18)와 공동 배양 하였다. 그들은 시험관 / 생체 실험과 비교 및 / 또는 유전자 변형 모델을 19 일부터 생산 뇌 혈관 내피 세포의 연구에 수 있기 때문에 &quot;의 실험실&quot;모델은 주로 설치류에서 생산됩니다. 새로 체외 BBB 모델 개발도 전에 생체 내 시험 15,20,21,3,6,22,11,23 잠재적 CNS 약물 후보의 뇌 흡수를 예측할 수 있도록 설계되었습니다. 체외 BBB 모델은 일반적으로 비교하는 데 사용됩니다 CNS에 내가) 알려진 침투 또는 L과 :와 약물의 수송BBB없이 중앙 효과 걸쳐 오우 투과성, 및 ⅱ) 동일한 종의 동물 모델에서 측정 된 동일 약품의 겉보기 PE. 쉽게 BBB를 전달하는 약물은 대부분 친 유성이며, 지질 매개 자유 확산 (카페인, 카르 바 마제 핀 등)에 의해 뇌의 혈관 내피 세포의 세포막을 교차. 이러한 디곡신, 베라파밀 또는 사이클로스포린과 같은 부정적인 수송 약물은 적극적으로 P-GP와 같은 뇌 내피 유출 컨베이어에 의해 압출된다. 그러나 새로 개발 된 치료 분자의 대부분은 이러한 재조합 단백질, siRNA를 또는 단일 클론 항체 등 바이오 의약품이다. 특정 운송의 I)의 부재, 그리고 세포층의 통로를 겪고에서 고 분자량의 분자를 방지 내피 세포의 II) 단단히 포장 층 : 그들 대부분은 인해 BBB를 통과하지 않습니다. 이러한 제한으로, &quot;트로이 목마&quot;전략은 내가, BBB 알려진 수용체에 대해 벡터 (항체, 펩티드) 참여를 사용하여 구현 된N 수용체 등 트랜스페린 (TF) 수용체 (TFR), 인슐린 수용체 (IR), 또는 LDL 수용체 (LDLR) 관련 수용체 가족 (LDLR, LRP1을)의 구성원으로 전송 또는 transcytosis (RMT)를, 중재. 이러한 수용체는 생체 (24, 25)에 고립 된 뇌 모세 혈관에와 BBB에서 발견되었다. 이러한 수용체 전사 프로필, 특히 LDLR 가족의 사람들은, 분석 및 공동 배양 직접 뇌 (26)로부터 자신의 추출 후 성상 세포 또는 뇌의 모세 혈관에서 뇌 혈관 내피 세포와 뇌 혈관 내피 세포를 비교 하였다. 파트 리지 (24)는 인슐린 수용체와 인슐린 성장 인자 수용체에 대한 항체 27,28이어서, 트랜스페린 수용체 (TFR)에 대하여 OX-26 항체 필드를 열었다. 이러한 항체 기반의 벡터로, ArmaGen 기술은 BBB (29)를 통해, 단백질을 포함, 약물을 전달하기 위해 BBB 분자 트로이 목마 플랫폼 기술을 개발했다.문학은 LRP1 뇌 혈관 내피 세포에서 발현과 강력한 세포 내 이입 / 스 캐빈 저 수용체의 역할을 보여주는 데이터 풍부하다. 웨스턴 블롯 분석 LRP1가 뇌의 모세 혈관이 풍부한 분수와 쥐의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (30)로 표현하는 것이 좋습니다. 같은 BBB (31)에 걸쳐 효율적인 마약 유입을 촉진 아프로 티닌에서 파생 된 펩타이드 벡터를 Angiochem 대상 LRP1 같은 회사. 그러나, LRP1은 활성 Aβ의 수송 및 뇌 실질 조직에서 혈액 32의 유출 / 통관에 참여하고있다. 이러한 데이터는 리간드에 따라 BBB에서 양방향 전송에 LRP1을 포함한다. biOasis는 VECT - HORUS가 LDLR (34)를 대상으로 펩타이드 벡터를 개발하는 동안 같은 BBB 33에서 리소좀 효소와 항체 등 바이오 의약품의 수송을위한 단백질 melanotransferrin를 사용하여 초월 기술을 개발하고 있습니다. 데이터는 LRP 및 LDLR는 비교를 전송하는데 사용될 수 있음이 시사된다같은 BBB 37에서 리소좀 효소 (35, 36) 또는 나노 입자 복합체로 erent 분자. 우리의 관심 분야는 벡터 분자와 중추 신경계 질환의 치료를위한 벡터화 된 약물 후보를 사용하여 CNS에 약물 전달합니다. 특히, BBB에 걸쳐 약물 전달은 신경 염증, 그 정도가 다를 수 있습니다 프로세스의 맥락에서 고려되어야하지만, 그 뇌염, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 등의 신경 염증을 포함, 아마 CNS 병변 및 질환에 공통적 인 세포층 및 세포 횡단 수송이 병적 인 상태 38,39,40,41,42,43에서 증폭 할 수 있음을 고려 BBB 생리학과 투자율의 변화와 BBB의 염증과 잠재적으로 관련이있다. 예를 들어, TNF-α, 비틀기, 기타 사이토 카인은 염증을 조절하고, 체외 BBB 모델과 실험들은 일의 세포층의 속성을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다전자 내피 세포 단일 층 38,39,40하고 TNF-α는 또한 LDL (41)의 세포 횡단 수송의 증가로 연결, 42, 락토페린 43 holotransferrin. 우리의 목표는 개발의 특성을했다 최적화 및 높은 재현성 쥐 동계 BBB 모델은 기본 뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 사용하여. 우리는 각각 뇌 혈관 내피 세포의 생산 및 성상 세포 제조를위한 5 주 된 신생아의 Wistar 쥐를 사용했다. 하나의 도전은 &quot;주간 재현성&quot;BBB 모델의 생산을 허용하는 프로토콜을 확립했다. 이 목적을 달성하기 위해 생산 프로토콜의 모든 단계는 첫 번째 주 수요일에 뇌의 미세 혈관의 생산에서 시작, 일주일의 고정 일에 실시 하였다. 해부는 지난 3 년 동안 거의 매주 실시 하였다. 또한 문화의 재현성을 향상시키기 위해 품질 보증 시스템이 설치되었다. 모든 reagenTS와 화학 물질 데이터베이스 (항목의 날짜, 주식, 유효 기간 등)에서 참조 하였다. 이 모델은 내피 세포의 조직과 순도 같은 기준의 숫자, 다음과 같은 특징으로하고, 봉사자, LY 침투성, 염증성 요원, TJ 단백질의 정성 및 정량 식, 같은 P-GP로 유출 수송의 기능 및 수용체에 대한 응답 이러한 TFR 또는 LDLR과 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 참여.

<table><tbody><tr><td>BSA 분획 V 낮은 내독소</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1X)</td><td>인비트로겐</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Becton Dickinson 팔콘</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 (1M)</td> <td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>콜라겐 유형 IV 마우스 (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg; C / 1 개월</td></tr><tr><td>Fibronectin humain 혈장 (5 mg)</td> <td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg; C / 1 개월</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위, 스트레이트 (9cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>가위, 스트레이트 (9cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>집게 Dumont # 5/45 (11cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, 팁 폭 0.8 mmFine</td><td>Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pypps, 곡선 팁 폭 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 / 디스페이즈 믹스 (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg; C / 3 개월</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td> <td>시그마 Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>겐타마이신 (10 mg / ml)</td> <td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>혈소판 불량 혈장에서 소 혈청 (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg; C / 1년</td></tr><tr><td>bFGF (10 &마이크로; g)</td> <td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg; C / 6 개월</td></tr><tr><td>돼지 점막에서 Heparine Na 소금 등급 I</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C / 6 개월</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &deg; C / 1 년</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 교수형 셀 인서트 12 웰 플레이트</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>다공성 : 1 & 마이크로; m 표면: 1.1 cm2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1년</td></tr><tr><td>마우스 안티-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, 클론 TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>마우스 anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>마우스 anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 클론 V9, (58 &micro; g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>마우스 anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - 고정 PFA 4</td></tr><tr><td>%Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &micro; g/ml)</td><td>1/200 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>토끼 안티 오클루딘&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &마이크로; g/ml)</td><td>1/200 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 복합 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, 디리튬 염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>TNF-알파 인간</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>쥐 MCP-1 ELISA 키트</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg; C / -20 &deg; C</td></tr><tr><td>마우스 anti-P-glycoprotein</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, 클론 C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - 고정 PFA 4% 1/200 (웨스턴 블롯)</td></tr><tr><td>토끼 안티-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (웨스턴 블롯)</td></tr><tr><td>로다민 123</td><td>시그마 알드리치</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>베라파밀 하이드로 클로라이드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>사이클로스포린 A</td><td>시그마 알드리치</td><td>30024</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>EGF 반복</td><td>미국 Diagnostica</td><td>3501 (100 &마이크로; g/ml)</td><td>1/5 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>마우스 안티 LDLR</td><td>R& D 시스템</td><td>AF2255(200 &마이크로; g/ml)</td><td>1/50 - 고정 PFA 4%</td></tr><tr><td>쥐 전사rin-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg; 씨</td></tr></tbody></table>

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (bbb)​​ : bbb 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

혈액 뇌 장벽 (BBB)​​은 특히 혈액 및 신경 조직 사이의 분자 및 세포 광속을 조절한다. 우리의 목표는 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 관련된 수용체를 연구하는 기본 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (RBEC)의 공동 문화와 성상 세포를 사용하여 BBB의 체외 모델의 높은 재현성 쥐 동계을 개발하고 특성화하는 것이 었습니다. 성상 세포는 트립신 소화 다음과 같은 기계적 박리에 의해 분리 된 이후 공동 문화 동결했다. RBEC 5 주 된 쥐의 피질에서 분리되었다. 두뇌는 수막과 흰색 물질의 청소, 기계적 소화 효소 다음 해리했다. 그 후, 조직 파쇄 액은 신경 조직에서 혈관 단편을 분리하기 위해 혈청 알부민에서 원심 분리 하였다. 용기의 조각은 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 무료로 내피 세포에 두 번째 효소 소화를 시행 하였다. 이러한 혈관 주위 세포로 남아있는 오염 세포는 f를했다urther 퓨로 마이신 - 함유 배지에서 미세 혈관 단편을 도금함으로써 제거. 그들은 그 우물의 바닥에 성장 성상 세포와 공동 배양 필터에 계대 배양 하였다. RBEC 꽉 접합 높은 수준의 표현 등 occludin 등 (TJ) 단백질, 셀 테두리의 일반적인 현지화와 claudin-5와 ZO-1. TJS의 압박감을 나타내는 뇌의 혈관 내피 세포 단층의 내피 전기 저항 (봉사자)는 300 옴 · 평균 cm 2에 도달했습니다. (LY) 노란색 루시퍼의 내피 세포의 투과성 계수 (PE)은 / 분 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm의 평균 고도의 재현했다. 단일 층으로 구성 뇌 혈관 내피 세포는 유출 수송의 P-당 단백질 (P-GP)를 표현 로다 민 123, P-GP에 대한 리간드의 편광 전송을 보였으며, 내피 세포 단일 층에 걸쳐 트랜스페린 -를 Cy3와 DiILDL의 특정 전송을 보여 주었다. 결론적으로, 우리는 시험관을 설정하기위한 프로토콜을 제공한다때문에 품질 보증 방법에 높은 재현성, 그리고 그 BBB 컨베이어 및 수용체에 대한 연구에 적합 BBB 모델.

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

이 절차의 전반적인 목표는 재현성이 높은 쥐 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier) 인비트로(in vitro) 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 실체 현미경 하에서 시신경, 소뇌 및 뇌수막을 제거한 후, 두 뇌 반구를 분리하고 해부하여 깨끗한 피질 조각을 얻습니다. 두 번째 단계는 효소 처리와 밀도 구배 원심분리를 통해 피질에서 미세혈관을 분리하는 것입니다.다음으로, 기생충과 같은 오염 세포로부터 혈관 내피 세포를 정제하기 위해 미세혈관을 도말하고 퓨라마이신(purmycin)과 함께 배양합니다. 정제된 쥐 뇌 내피 세포 배양물은 세포가 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 증식시킵니다. 마지막 단계는 인서트 필터의 상단 챔버에 있는 세포들을 이전에 준비하여 도말한 쥐 성상교세포와 공동 배양함으로써 쥐 뇌 내피 세포의 분화를 유도하는 것입니다.최종적으로, 분화된 뇌 혈관 내피세포 단층은 특정 밀착 연접 단백질의 발현과 상부 챔버에서 내피세포 단층을 통해 전달되는 표준 화합물의 투과도 지수로 특성을 분석할 수 있습니다. 본 연구에서 제시한 것과 같은 인 비트로(in vitro) BBB 모델은 주요 분자의 세포 내 분포를 탐색하고 BBB 기능의 기본적인 세포 및 분자적 메커니즘을 규명하는 데 유용합니다. 특히, 이러한 모델을 통해 BBB 수용체와 이들이 엔도시토시스 수송 및 트랜스사이토시스에 관여하는 과정을 직접 탐구할 수 있습니다.in vitro BBB 모델은 주로 당사가 개발한 펩타이드 벡터를 이용해 특정 수용체를 표적으로 하는 연구에 사용됩니다. BBB를 가로질러 CNS 약물 전달을 용이하게 하기 위해, 저희는 수용체 매개 세포횡단수송(receptor mediated transcytosis)이라고 하며 '트로이 목마' 접근법으로도 알려진 과정을 이용합니다. 시각적 설명은 매우 중요합니다. 이 방법이 생소한 개인은 세포 생산 과정 동안 조직의 생존력을 유지하며 신속하고 정확하게 진입할 수 있도록 현미경을 활용하는 해부 기술이 필요합니다.또 다른 중요한 점은 실험 중 배리어(barrier)가 열리는 것을 방지하기 위해 fragile 및 tele salmon 영역을 조기에 종료하는 것입니다. 마지막으로, 본 아이디어는 프로토콜 전반에 걸쳐 세부 사항을 보여줄 것이며, 이는 저와 동료가 수행할 절차를 입증하는 시각화된 프로토콜과 일반 프로토콜의 차이를 만들어낼 것입니다. 이 절차를 시작하기 위해, 두 개의 T 75 플라스크를 멸균 배양수 내의 1 µg/cm² 농도의 collagen type four 및 fibronectin으로 코팅하고, 미세혈관(micro vessels)을 파종할 때까지 37 °C 인큐베이터에서 부착시키십시오.이틀 후, 5주령 Vista 쥐 3마리의 두개골에서 뇌를 적출하여 얼음 위에 놓인 차가운 해부 완충액이 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. 소뇌와 시신경을 제외하고 뇌를 해부합니다. 그런 다음 실체 현미경 하에서 각 뇌를 절반으로 잘라 두 대뇌 반구를 분리합니다.중뇌를 제거하기 위해 다시 한번 절개하고, 네 개의 뇌 모두를 해부 완충액이 들어 있고 얼음 위에 놓인 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 전뇌 하나를 차가운 해부 완충액이 채워진 새 페트리 접시로 옮깁니다. 클램프로 전뇌를 고정한 후, 전뇌 가장자리에서 뇌수막을 조심스럽게 분리합니다.그 후, 전뇌를 뒤집고 찢어지지 않게 주의하며 뇌수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 전뇌에서 뇌수막이 완전히 제거되었는지 확인하고 시신경의 남은 부분을 절단합니다. 이 단계의 목적은 백질 층을 제거하여 피질 껍질을 얻는 것입니다.먼저 전뇌의 가장자리를 고정한 후, 피질 표면이 찢어지지 않도록 주의하며 핀셋을 표면을 따라 조심스럽게 끕니다. 그 다음, 뇌를 굴려 잔여 뇌수막이나 큰 표면 혈관이 없는지 확인하여 뇌수막이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 이어서, 두개골에서 뇌 3개를 추출하는 시점부터 조직 보존과 세포 생존을 위해 해부 전체 소요 시간이 2시간을 초과하지 않아야 합니다.뇌 세 개에서 적출한 피질을 7 mL 다운 호모게나이저(down homogenizer)에 담긴 6 mL의 차가운 해부 버퍼로 옮깁니다. 이어서 간극이 넓은 첫 번째 페스틀(pestle)로 10회 상하로 스트로크하여 피질을 분쇄한 다음, 간극이 좁은 두 번째 페스틀로 10회 상하로 스트로크합니다. 그 후, 현탁액 6 mL를 새로운 50 mL Falcon 튜브로 옮기고, 다운 호모게나이저를 24 mL의 차가운 해부 버퍼로 세척합니다. 현탁액을 세 개의 Falcon 튜브에 나누어 담아 튜브당 피질 한 개 분량이 되도록 합니다. 이후, 상온에서 1000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.펠릿을 관찰하면 피질의 미세혈관 부분을 나타내는 분홍색 그라데이션이 보입니다. 이제 상층액을 버리고, 콜라게나제(collagenases) 믹스, DNA type one 및 Gentamycin이 포함된 효소 용액 1 mL를 사용하여 한쪽 피질의 펠릿을 균질화합니다. 튜브를 쉐이커에 넣고 37 °C에서 30분 동안 반응시킵니다.그런 다음 소화물 1 mL를 25% B-S-A-H-B-S-S 1X 10 mL와 혼합하고, 튜브를 가볍게 볼텍싱한 후 상온에서 3,600 Gs로 15분 동안 밀도 구배 원심분리를 통해 분리합니다. 밀도 구배 원심분리 후 펠렛에는 미세혈관이 포함되며, 상층 디스크에는 수초화된 뇌 실질과 잔여 미세혈관이 포함됩니다. 상층 디스크와 상층액을 깨끗한 50 mL 팔콘 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.미세혈관 펠릿을 흡입하지 않도록 주의하며 튜브를 가볍게 볼텍싱하고, 두 번째 원심분리 과정에서도 밀도 의존적 원심분리를 반복합니다. 미세혈관이 포함된 결과 펠릿을 4 °C에서 보관하십시오. 두 번째 밀도 의존적 원심분리가 끝난 후, 상단의 디스크와 snat 혼합물을 조심스럽게 제거하고, 두 번의 원심분리에서 얻은 미세혈관 포함 펠릿들을 차가운 1x HBSS 1 mL로 재부유시킵니다.다음으로, 미세혈관을 20 milliliters의 차가운 hbss one x로 세척하고 1000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 미세혈관이 손실되지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 튜브를 가볍게 vortexing한 후, 피질 한 곳에서 얻은 미세혈관 펠릿을 1 milliliter의 동일한 효소 용액으로 균질화합니다.쉐이커를 이용하여 37°C에서 미세혈관을 1시간 동안 추가로 소화시킵니다. 그 후, 세 개의 피질에서 소화된 미세혈관을 하나의 튜브에 혼합합니다. 다시 이 혼합물을 두 개의 50 mL falcon 튜브에 나누어 담아, 튜브당 피질 1.5개 분량에 해당하는 추출된 미세혈관을 확보합니다.그런 다음 1000 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 미세혈관을 플레이팅하기 직전 실온에서, 코팅된 T 75 플라스크 2개를 인큐베이터에서 꺼내어 과량의 코팅액을 흡입하여 제거합니다. 상층액을 버리고 미세혈관 펠릿을 1 mL의 ECM에 재부유시킨 후, 4 µg/mL가 첨가된 ECM을 사용하여 각 튜브의 최종 부피를 10 mL로 맞춥니다.정제 과정을 시작하기 위해 purmycin을 넣고 플라스크에 미세혈관을 플레이팅합니다. 그 후 플라스크를 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 정제 과정에 따라 미세혈관이 콜라겐 피브로넥틴 매트릭스에 부착되도록 합니다. 미세혈관 플레이팅 24시간 후에 신선한 ECM으로 세포 잔해를 세척하고, 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 5일까지 4 µg/mL purmycin이 첨가된 ECM으로 배양액을 교체합니다. 미세혈관 플레이팅 24시간 후부터 내피세포가 콜라겐 피브로넥틴 매트릭스 상에서 이동 및 확산되기 시작합니다. 5일째에 정제 과정을 마무리하기 위해 세포 잔해를 신선한 ECM으로 세척하고 배양액을 2 µg/mL가 첨가된 ECM으로 교체합니다.증식을 위해 Puramycin을 3일 더 처리합니다. 8일째 되는 날, 세포를 세척하고 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄산나트륨을 첨가합니다. 10일째에 배양이 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 배양액에 보충합니다.8일 차에, 멸균 배양수에 collagen Type four와 fibronectin을 각각 0.5 µg/cm² 농도로 혼합하여 코팅함으로써 12-well 플레이트 3개의 필터를 준비합니다. 우선 하단 챔버에 멸균 배양수 1.5 mL를 첨가하는 것으로 시작합니다.그런 다음 상단 구획에 혼합액 0.5 milliliters를 추가합니다. 공동 배양 구축 5일 전인 당일에 혈관 내피 세포를 파종할 때까지 37 degrees Celsius에서 매트릭스가 부착되도록 둡니다. 냉동 보관 튜브의 성상교세포를 37 degrees Celsius에서 해동하고, 세포를 10 milliliters의 GCM이 들어 있는 15 milliliter falcon tube로 옮겨 원심 분리합니다.실온에서 120 Gs로 8분 동안 원심분리합니다. 그 후 성상교세포 펠렛을 GCM에 다시 현탁하고 cm²당 30,000 cells의 밀도로 플레이팅합니다. 12-well 플레이트의 경우, 10일째에 trypsin을 사용하여 RBEC를 해리시키기 직전에 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에 넣습니다.사전 코딩된 필터를 DMM F 12 배지로 세척하고, 챔버를 ECM으로 미리 채운 후 당일 RBEC 플레이팅 전까지 인큐베이터에 다시 넣어 둡니다. RBEC를 칼슘과 마그네슘이 없는 DPBS로 두 번 세척합니다. 37 °C에서 T 75 플라스크당 4 mL의 따뜻한 trypsin EDTA 용액을 정확히 30초 동안 첨가하고, trypsin EDTA 용액 3.5 mL를 제거합니다.내피세포가 항상 trypsin EDTA 층으로 덮여 있도록 주의하십시오. 그 후 현미경 관찰을 통해 세포의 탈착 여부를 확인합니다. 세포층이 기질에서 떨어지기 시작하면, 모든 세포가 부유할 때까지 T 75 플라스크의 가장자리를 가볍게 두드립니다.각 T 75 플라스크에 3 mL의 ECM을 넣고 50 mL falcon tube로 옮깁니다. 모든 세포를 회수하기 위해 배지를 세척하며 이 단계를 두 번 더 반복합니다.노란색 팁이 장착된 10 milliliter 피펫으로 네 번 상하로 피펫팅하여 세포 현탁액을 매우 부드럽게 해리합니다. 현탁액 내의 세포 수를 측정하고, 다음 날 미리 코딩되고 채워진 필터에 고밀도로 즉시 분주합니다. 배지 교체 중 세포 단층이 파괴되는 것을 방지하기 위해, 세포 잔해를 제거하도록 상단 챔버의 배지를 두 번 교체합니다.플레이트를 약간 기울여 흡입 피펫이 세포 단층에 너무 가까이 가지 않도록 하며, 배지 교체 시 세포 단층이 건조되는 것을 방지하기 위해 항상 단층 위에 일정량의 배지를 남겨둡니다. 한 번에 6개의 인서트만 세척하십시오. 세포 도말 24시간 후에 세포 단층이 confluence 상태가 되어야 합니다.그런 다음 공동 배양을 시작하기 하루 전인 같은 날, 분화 1일 차로 정의되는 12일 차에 성상교세포 배양액을 1.5 milliliters의 보충된 분화 배지로 교체합니다. RBEC가 포함된 필터의 배양액을 분화 배지로 교체합니다. 그 후, 이러한 조건 하에서 RBEC 필터를 성상교세포가 들어 있는 웰로 옮깁니다.In vitro 모델은 3일 이내에 분화되어 접합 관련 단백질을 발현하며, 최적의 분화 상태는 이후 3일 동안 유지됩니다. 본 실험에서 세포 단층을 면역 염색한 결과, 형태가 겹치지 않는 조밀한 뇌 혈관 내피세포 단층과 내피세포 특유의 전형적인 방추형 세포가 확인되었으며, ZO-1 및 occludin과 같은 밀착 접합 단백질의 발현이 나타났습니다. 12-well BBB 모델의 단층 치밀도는 Lucifer yellow의 투과도를 측정하여 평가되었습니다.결과는 투과성 또는 PE로 표현하며 단위는 10⁻³ cm/min이고, LY의 PE가 0.6 × 10⁻³ cm/min 이상일 때 장벽이 투과성 또는 개방된 상태인 것으로 간주합니다. 지난 수십 년 동안 많은 논문과 리뷰를 통해 다양한 종의 정적 및 동적 인비트로(in vitro) BBB 모델에 대한 정보가 제공되었습니다. 하지만 이러한 모델들은 여전히 다루기 어렵고 장벽 품질의 재현성을 확보하는 것이 주요 과제로 남아 있습니다.이 영상을 시청한 후, 연구자들은 PBB의 인비트로(in vitro) 모델을 제작하고 특성을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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