순차

이 실험 절차의 전반적인 목표는 골절 치유 과정에서 내인성 골성 줄기세포 및 전구세포의 이동, 증식 및 분화를 순차적으로 추적하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 poly cynic poly cyto ilic acid 주입을 통해 체내의 mixo virus, influenza virus resistance, one 또는 MX one 양성 세포를 표지한 다음, 방사선 조사를 통해 상주하는 MX one 양성 조혈 세포를 제거합니다. 두 번째 단계에서는 야생형 골수 세포를 방사선 조사된 마우스에 체계적으로 투여합니다.

다음으로, 니들 드릴링을 통해 마우스 Cal 영역에 미세 골절을 유도합니다. 마지막으로, 미세 골절 치유 과정에 대한 순차적 생체 내 영상 촬영을 수행합니다. 결과적으로, 이러한 생체 내 영상은 골절 부위로 유입되는 골형성 줄기세포 및 전구세포의 유입과 증식 역동성을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

따라서 이 기술의 주요 장점은 골절 치유 과정 동안 골 형성 줄기세포 및 전구세포를 체내에서 반복적으로 이미징할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 함의는 골절 치유 및 골다공증 치료로까지 확장됩니다. 본 방법은 골 재생 및 수복 과정에서 내인성 골 형성 줄기 전구세포를 모니터링할 수 있는 새로운 도구를 제공하기 때문입니다.

최소한의 조직 손상으로 미세골절을 생성하고, 심각한 흉터 형성을 유발하지 않으면서 골절 부위를 반복적으로 생체 내(in vivo) 영상화하는 것이 이 방법의 핵심이자 기술적으로 까다로운 부분이기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 생체 내에서 MX1 양성 세포를 표지하려면, MX1 Cree 리포터 마우스의 체중 20 g당 200 µL의 poly acidic poly cyto ilic acid를 10일 동안 이틀에 한 번씩 복강 내로 주입하십시오. 그다음, 상주하는 MX1 양성 조혈 세포를 제거하기 위해 주입된 마우스에 9.5 Gy를 단회 조사하십시오. 24시간 후, 마우스당 1 × 10⁶ 개의 야생형 골수 세포를 정맥 내로 이식하십시오.

4~6주 후, ketamine xylazine 50 µL를 복강 내 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기(toe pinch)로 진정 상태를 확인한 후, 골수 세포가 이식된 마우스의 두피를 삭모하고 70% 알코올 솜으로 노출된 피부를 소독합니다. 각막 탈수를 방지하기 위해 티어 젤(tear gel)을 도포한 다음, 한쪽 귀에서 다른 쪽 귀까지 두피를 가로질러 1 cm 미만의 횡절개를 실시합니다. 이어서 동물을 약 60도 회전시킨 후, 포셉을 사용하여 코에서 약 2~3 mm 떨어진 지점까지 절개를 계속합니다.

조직 플랩을 동물의 측면 방향으로 당겨 피부를 분리하면, 양측 전두골과 시상 봉합 및 관상 봉합의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다. 노출된 표면을 멸균 PBS로 세척한 다음 면봉으로 잔여 털을 부드럽게 닦아냅니다. 그 다음 두개골에 미세 골절을 생성하기 위해, 한 손으로는 마우스의 머리를 잡고 다른 손으로는 30 gauge 바늘을 잡습니다.

30 gauge 바늘 팁을 사용하여 시상 봉합과 관상 봉합의 교차 지점 근처 전두골의 한쪽에 미세 천공을 조심스럽게 뚫습니다. 뇌 조직을 관통하는 것을 방지하기 위해 더 굵은 게이지의 바늘로 교체하고, 새 바늘을 회전시켜 천공 구멍의 직경을 약 0.5 millimeters 정도로 넓힙니다. 반대측 전두골에도 두 번째 천공을 만든 후, 출혈이 멈출 때까지 각 부위에 PBS를 계속 떨어뜨리며 닦아냅니다.

그 다음 건조를 방지하기 위해, Vidal 이미지를 획득할 영역을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 양의 멸균 생리식염수를 두개골 위에 떨어뜨립니다. 먼저 폴리곤 기반 레이저 스캐너를 켜서 초당 30프레임의 비디오 속도로 동시 다채널 이미지 획득이 가능하게 합니다. 이어서 다광자 이미징을 위해 펨토초 티타늄 사파이어 레이저를 켭니다.

두개골의 제2고조파 생성(second harmonic generation) 이미징을 위해 출력과 파장을 880 nanometers로 설정하고, GFP 및 TD tomato 여기를 위해 440 nanometers로 설정한 후, 491 nanometer 및 561 nanometer 고체 레이저를 켭니다. 그다음 각 신호에 맞는 광전증폭관(photo multiplier tube) 검출기를 켜는데, 제2고조파 생성의 경우 435 ± 20 nanometer 밴드패스 필터를, GFP의 경우 528 ± 19 nanometer 밴드패스 필터를, 그리고 TD tomato의 경우 590 ± 20 nanometer 밴드패스 필터를 사용합니다. 이제 동물을 37 °C로 설정된 전기 가열 패드 위의 XYZ축 전동 현미경 스테이지에 놓습니다.

테이프를 사용하여 마우스의 위치를 고정한 다음, 따뜻한 2% Methylcellulose 기반 겔 한 방울을 두개골 위에 도포합니다. 건조를 방지하기 위해 이미징 영역 위에 커버 글라스를 덮습니다. 그런 다음 0.9 개구수로 30 x 수침 렌즈와 XY, Z축 컨트롤러를 사용하여 뼈에서 발생하는 SHG 신호를 검출합니다.

두개골 표면을 찾으려면 시상봉합과 관상봉합의 교차점과 같은 중요한 랜드마크 위치를 식별하고 이미지를 획득하십시오. 해당 랜드마크의 XY, Z 좌표를 표시한 다음, SHG 및 형광 신호를 가이드로 사용하여 손상 부위의 위치를 계속해서 검색하십시오. 각 관심 영역을 찾으면, 관심 세포의 SHG 및 형광 신호가 포함된 최적의 초점 평면 이미지를 획득하십시오.

시상 봉합과 관상 봉합의 교차점까지의 거리와 XY, Z 좌표를 저장하여 다음 영상 촬영을 위한 정확한 위치를 정의합니다. 그런 다음 골절 부위의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집합니다. 내골 표면으로부터 약 100 µm 깊이까지 약 2~5 µm의 Z 스택 간격으로 영상을 기록합니다.

마지막으로, 두 손상 부위의 이미징을 마친 후 멸균 생리식염수를 여러 방울 사용하여 두개골에서 2% Methylcellulose 겔을 제거합니다. 이제 표면에 항생제를 도포하고 피부 플랩으로 두개골을 덮은 다음, 저자극성 봉합사로 두피를 다시 봉합하고 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 회복 챔버에 보관합니다. 3~5일 후, 골절 치유 과정 중의 세포 변화를 추적하기 위해 생체 내 이미징(Intravital imaging) 단계를 반복합니다.

이 대표 실험에서는 방사선 조사 및 골수 교체 후, tomato osteocalcin, GFP 마우스의 전두골에 두 개의 미세 골절을 생성하였습니다. 미세 골절에 대한 순차적 3D 생체 내 영상 촬영 결과, 골절 발생 2일 차에 골절 부위 내에서 tomato 양성 조골성 줄기세포 및 전구세포의 재배치가 관찰되었으며, 5일 차에는 이들의 확장이 확인되었습니다. 이 시점에서는 GFP 양성 조골세포가 검출되지 않았으나, 12일 차에는 화살표로 표시된 바와 같이 골절 표면 근처의 조골 전구세포 일부가 tomato 양성 GFP 양성 조골세포로 분화를 시작하였습니다. 21일 차에 새로운 조골세포가 축적되고 신생 골 형성이 이루어진 것은, 조골 전구세포의 이동과 증식이 골절 치유를 위한 새로운 조골세포 공급의 주요 기전이었음을 나타냅니다. 본 방법이 골절 치유 과정 중 조골 전구세포 수에 대해 일관되고 정량적인 결과물을 제공하는지 테스트하기 위해, 손상 후 14일 동안 MX one YFP 양성 조골성 줄기세포 및 전구세포를 추적하였습니다.

손상 후 3일째에 소수의 전구세포가 손상 부위에서 일관되게 검출되었습니다. 세포 수는 7일째에 지속적으로 증가하여 10일째에 정점에 도달했으며, 14일째까지 그 수준이 유지되었습니다. 골 전구세포 생성의 역학은 시간에 따른 YFP 신호 강도를 측정하여 정량화하였으며, 이는 생체 내 현미경 관찰 결과와 상관관계가 있었습니다.

전구세포는 3일 차에 처음 관찰되었으며, 10일 차에 정점에 도달한 후 14일 차까지 비슷하게 높은 강도로 유지되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 숙련된 봉합 기술과 출혈의 최소화가 흉터 형성을 줄이고 배경 자가형광을 낮출 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 골절 치유 과정에서 내인성 골성 줄기 전구세포의 이동, 증식 및 분화를 이미징하고 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.