순차 생체 내 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징
2014년 5월 23일
골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.
이 절차의 전반적인 목표는 골절 복구에서 내인성 골형성 줄기 세포와 전구 세포의 이동, 증식 및 분화를 순차적으로 추적하고 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 혼합 바이러스, 인플루엔자 바이러스 내성, 하나 또는 MX one 양성 세포를 poly cynic poly cyto ilic acid 주입으로 생체 내에서 라벨링한 다음 방사선 조사로 상주 MX one 양성 조혈 세포를 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 야생형 골수 세포를 방사선 조사된 마우스에 체계적으로 투여합니다.
다음으로 바늘 드릴링에 의해 마우스 Cal 영역에서 미세 골절이 발생합니다. 마지막으로, 미세 파괴 복원의 순차적인 바이알 내 이미징이 수행됩니다. 궁극적으로 이러한 생체 내 이미지는 골형성 줄기 및 전구 세포의 파동 부위로의 유입 및 확장의 역학을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 이 기술의 주요 장점은 골절 치유 과정에서 골형성 줄기 세포와 전구 세포의 생체 내 반복 이미징이 가능하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 골절 치유 및 골다공증 치료로 확장되었습니다. 이 방법은 뼈 재생 및 복구에서 내인성 골형성 줄기전구세포를 모니터링하기 위한 새로운 도구를 제공합니다.
이 방법의 시각적 시연은 조직 손상이 최소화된 미세 골절의 생성과 심각한 흉터 형성을 유발하지 않고 골절 손상의 반복적인 생체 내 이미징이 방법에 중요하고 기술적으로 어렵기 때문에 중요하며 기술적으로 어렵습니다. 생체 내에서 MX one 양성 세포를 라벨링하려면 MX 1 크리어 리포터 마우스 무게 복강 내 20g당 200마이크로리터의 폴리산성 폴리 사이토 일산을 주입하는 것으로 시작합니다. 10일 동안. 그런 다음 상주 MX를 제거하기 위해 하나의 양성 조혈 세포가 주입된 마우스에 9.5그라의 단일 용량을 조사합니다. 24시간 후, 마우스 한 마리당 여섯 번째 야생형 골수 세포에 1회 10회 이식합니다.
4-6주 후, 케타민 자일라진 50마이크로리터를 복강내 주사로 마우스에 마취하고 발가락 꼬집음으로 진정을 확인한 후 골수 세포 이식 마우스의 두피 쌍을 클립한 다음 노출된 피부를 70% 알코올 면봉으로 살균합니다. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 바르고 한쪽 귀에서 시작하여 다른 쪽 귀에서 끝나는 두피를 가로질러 길이가 1cm 미만인 가로 절개를 만듭니다. 그런 다음 동물을 약 60도 돌리고 집게를 사용하여 코에서 약 2-3mm에 도달할 때까지 절개를 계속합니다.
조직의 플랩을 동물 쪽으로 당겨 피부를 분리하면 전두골과 시상 봉합사와 관상 봉합사의 교차점이 이제 명확하게 노출되어야 합니다. 열린 표면을 멸균 PBS로 씻어낸 다음 면봉으로 잔여 털을 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 종아리에 미세 골절을 일으키려면 한 손으로 마우스 머리를 잡고 다른 손으로 30 게이지 바늘을 잡습니다.
30게이지 바늘 끝을 사용하여 시상 봉합사와 관상 봉합사의 교차점 근처 전두골의 한쪽 면에 미세 구멍을 부드럽게 뚫습니다. 뇌를 관통하지 않으려면 더 큰 게이지로 바꾸고 새 바늘을 비틀어 구멍을 직경 약 0.5mm로 넓힙니다. 반대쪽 전두골에 두 번째 천공을 생성한 후 출혈이 멈출 때까지 각 부위에 PBS를 계속 떨어뜨려 닦습니다.
그런 다음 건조를 피하기 위해 멸균 생리식염수를 두개골에 충분히 떨어뜨려 Vidal 이미지를 획득할 수 있는 영역을 완전히 덮습니다. 먼저 폴리곤 기반 레이저 스캐너를 켜서 초당 30프레임의 비디오 속도로 동시 다중 채널 이미지를 획득할 수 있습니다. 다음으로 다광자 이미징을 위한 펨토초 티타늄 사파이어 레이저를 켭니다.
GFP 및 TD 토마토 여기를 위해 440나노미터에서 석골의 2차 고조파 생성 이미징을 위해 출력과 파장을 880나노미터로 설정하고 491나노미터 및 561나노미터 고체 레이저를 켭니다. 그런 다음 각 신호에 대해 광 증배관 감지기를 켭니다: 2차 고조파 생성을 위한 435 플러스 또는 마이너스 20나노미터 대역 통과 필터, GFP를 위한 528 플러스 또는 마이너스 19나노미터 대역 통과 필터, TD 토마토를 위한 590 플러스 또는 마이너스 20 나노미터 대역 통과. 이제 섭씨 37도로 설정된 전기 가열 패드 위에 있는 XYZ 축 전동 현미경 스테이지에 동물을 놓습니다.
테이프를 사용하여 마우스를 제자리에 고정한 다음 따뜻한 2% 메틸셀룰로오스 기반 젤 한 방울을 두개골에 바릅니다. 건조를 방지하려면 이미징 영역에 커버 유리를 씌우십시오. 그런 다음 0.9 개구수가 있는 30 x 수침 대물렌즈와 XY, Z축 컨트롤러를 사용하여 뼈에서 SHG 신호를 감지합니다.
종아리의 표면을 찾으려면 시상 봉합사와 관상 봉합사 사이의 교차점과 같은 중요한 랜드마크 위치를 식별하고 이미지를 획득합니다. 랜드마크의 XY, Z 좌표를 표시한 다음 SHG 및 형광 신호를 가이드로 사용하여 부상 위치를 계속 검색합니다. 각 관심 영역이 발견되면 SHG와 관심 세포의 형광 신호를 포함하는 최상의 초점면의 이미지를 획득합니다.
XY, Z 좌표 및 시상 봉합사와 관상 봉합사의 교차점까지의 거리를 저장하여 다음 이미징 라운드를 위한 정확한 위치를 정의합니다. 그런 다음 골절 부상의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집합니다. 엔도 뼈 표면에서 약 100미크론 깊이의 약 2-5미크론 Z 스택 간격으로 이미지를 기록합니다.
마지막으로, 두 손상 부위를 모두 이미징한 후 멸균 식염수를 여러 방울 떨어뜨려 두개골에서 2% 메틸셀룰로오스 젤을 제거합니다. 이제 표면을 항생제로 코팅하고 피부 덮개로 두개골을 덮고, 저자극성 봉합사로 두피를 다시 봉합하고, 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 회복실에 보관합니다. 3-5일 후, 골절이 치유되는 동안 세포 변화를 추적하기 위해 Intravital 이미징 단계를 반복합니다.
이 대표적인 실험에서, 유전자 조사 후 MX 1 토마토 오스테오칼신, GFP 마우스의 전두골에 두 개의 미세골절이 발생하였으며, 미세골절의 순차적인 3D 생체 내 이미징은 2일차에 골절 부위 내에서 토마토 양성 골형성 줄기 및 전구 세포의 재배치를 보여주었습니다. 5일차에 확장팩도 있습니다. 이 당시에는 GFP 양성 조골세포가 검출되지 않았지만, 12일째에 골절 표면 근처의 골 전구 세포의 하위 집합이 화살표로 표시된 바와 같이 토마토 양성 GFP 양성 골아세포의 분화를 시작했으며, 21일째에 새로운 골아세포와 새로운 뼈 형성의 축적은 골형성 전구 세포의 이동 및 증식이 골절 치유를 위한 새로운 골세포를 공급하는 주요 메커니즘임을 나타냅니다. 이 방법이 골절 치유 중 골형성 줄기세포의 일관되고 정량적인 출력을 제공하는지 여부를 테스트하기 위해 MX one YFP 양성 골형성 줄기세포 및 전구세포를 손상 후 14일 동안 추적했습니다.
소수의 전구 세포는 3일까지 부상 부위에서 일관되게 검출되었습니다. 세포 수는 7일째에 지속적으로 증가하여 10일째에 최대 개체수에 도달했고 14일째에 유지되었습니다. 골전구세포(osteo progenitors) 생성의 동역학은 시간 경과에 따른 YFP 신호 강도를 측정하여 정량화되었으며, 생체 내 현미경 검사에서 관찰된 것과 상관관계가 있었습니다.
전구 세포는 3일째에 처음 관찰되었고, 10일째에 최고조에 달했으며, 14일째까지 비슷하게 높은 강도를 유지했다. 이 절차를 시도하는 동안 숙련된 봉합 기술과 최소한의 출혈로 흉터 형성을 줄이고 배경 자가형광을 낮출 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 골절 복원 과정에서 내인성 골형성 줄기전구세포의 이동 증식 및 분화를 이미지화하고 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
개요
이 연구는 생체 내 현미경을 사용하여 골절 치유 중 골 전구 세포의 기능을 정량적으로 측정하는 방법을 제시합니다. 설명된 프로토콜은 골 손상에 반응하여 이주, 증식, 분화하는 내인성 골형성 줄기/전구 세포를 추적 및 영상화할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 영역
- 신경 과학
- 골 생물학
- 영상 기술
배경
- 골절은 줄기/전구 세포를 포함하는 효과적인 치유 과정이 필요합니다.
- 생체 내 현미경은 세포 동태의 실시간 영상을 가능하게 합니다.
- 이러한 과정을 이해하는 것은 골절 및 골다공증 치료에 도움이 될 수 있습니다.
- 현재의 방법은 이러한 세포를 반복적으로 생체 내에서 시각화할 수 있는 능력이 부족합니다.
연구 목적
- 골절 치유 중 골형성 줄기/전구 세포를 추적하는 기술을 개발합니다.
- 골절 부위에서 세포 유입 및 확장의 역학을 평가합니다.
- 재현성을 위한 방법의 시각적 시연을 제공합니다.
사용된 방법
- 폴리시티딜산 주사를 사용한 특정 세포 유형의 표지.
- 방사선을 통한 거주 조혈 세포의 제거.
- 바늘 드릴링을 통한 두개골의 미세 골절 유도.
- 고급 현미경 기술을 사용한 골절 치유 과정의 순차적 영상화.
주요 결과
- 생체 내 내인성 골형성 줄기/전구 세포의 성공적인 추적.
- 골절 부위에서의 세포 이동 및 분화 시연.
- 중대한 조직 손상 없이 반복적인 영상화를 위한 방법의 확립.
- 골 재생에 관여하는 세포 메커니즘에 대한 통찰력.
결론
- 이 기술은 골 치유 역학을 연구하는 새로운 접근 방법을 제공합니다.
- 골절 치유 치료를 개선하는 데 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다.
- 미래의 응용은 골다공증 치료 이해로 확장될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of endogenous osteogenic stem/progenitor cell dynamics during fracture repair, providing mechanistic insights into bone regeneration. By tracking cell migration, proliferation, and differentiation in vivo, it supports target validation and de-risking in osteoporosis and fracture healing therapeutic development. The approach offers a reproducible platform for evaluating stem cell-intrinsic and extrinsic regulators, enhancing predictive confidence in preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking osteogenic stem/progenitor cell relocation and expansion at injury sites.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of cell influx and proliferation kinetics for functional target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking cellular dynamics to bone formation outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible imaging outputs for assessing compound effects on stem cell behavior.
- Operational Value: Establishes a scalable intravital imaging workflow for longitudinal monitoring of cellular responses.
- Assay Readiness: Produces quantifiable YFP signal intensity metrics correlated with progenitor cell kinetics over time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects early cellular events to late-stage bone formation, supporting mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking progenitor differentiation into osteoblasts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on validated cellular mechanisms of repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical research by providing dynamic, quantitative cellular readouts that inform therapeutic strategy.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing stem cell responses to injury in real time.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible imaging data for evaluating modulator effects on progenitor cell migration and proliferation.
- Analytics: Generates quantitative YFP signal intensity measurements over time, enabling correlation with histological endpoints.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by linking progenitor cell dynamics to osteoblast differentiation and bone formation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable intravital imaging platform for multiple bone regeneration studies across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in bone repair pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through sequential intravital imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of osteoporosis and fracture healing candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization based on validated stem cell-mediated mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, mouse surgery, and fluorescent cell labeling techniques.
- Depends on multiphoton laser scanning infrastructure with specific wavelength and filter sets for SHG and fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization for consistent microfracture induction and imaging interval execution.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different bone sites or disease contexts.
- Limited by the technical challenge of minimizing tissue damage and scar formation during repeated imaging sessions.
