Name: 순차 생체 내 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 생체 내 현미경을 이용하여 골절 치유 중 골 형성 줄기세포의 이동, 증식 및 분화를 추적하고 정량화하는 방법을. MX1-Cre 리포터 마우스 모델을 사용하여 반복적인 생체 이미징이 가능한 이 기술은 골 재생 메커니즘 연구와 골다공증 치료 개발에 활용됩니다.

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우리는 원고를 읽는 C. 공원 감사합니다. 이 작품은 상 수 K01AR061434 및 DP에 백혈병과 림프종 사회 원정대 수상 (5127-09)에서 NIAMS에 의해 지원 내용은 CPL 및 DTS에 건강의 국립 연구소의 보조금을하지 전적으로 저자의 책임이며 않는 한 반드시 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 나타냅니다.

1. 마우스 및 전처리 참고 : 모든 마우스는 무균 상태로 유지하고, 모든 프로토콜은 매사 추세 츠 종합 병원에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 오토 클레이브 멸균 장비를 사용하여 무균 조건 하에서 수행되어야한다. MX1-크레 15 Rosa26는 -에 loxP 스톱에 loxP - EYFP (로사 - YFP), 및 Rosa26 -에 loxP는 스톱에 loxP-tdTomato (로사 토마토)이었다 잭슨 연구소에서 구입. 오스테오칼신-GFP 마우스 박사 헨리 KRONENBERG에 의해 제공되었다. 생체 내에서 OSPC의 이동과 증식의 정량적 분석을 위해, MX1-크레 + 로사 - YFP + (단일 색상 기자) 마우스를 사용 하였다. 오스테오칼신 + 성숙한 조골 세포로 분화의 자세한 추적을 위해, 우리는 사용 trigenic MX1-크레 + 로사 - 토마토 + OCN-GFP +마우스. <ol><li> , 생체 내에서 MX1 + 세포에 라벨을 멸균 PBS 용액에 polyinosinic-polycytidylic 산 (PIPC, 2.5 ㎎ / ㎖)을 준비하고 20 MX1-크레 + 기자 마우스의 G 복강 한 번 10 일 동안 매일 200 μl를 주입합니다. </li><li> 주민 MX1 + 조혈 세포를 제거하기 위해, 9.5 Gy의 단일 용량으로 쥐를 조사. 정맥 16 조사, 이식 야생형 골수 세포 (1 × 10 6 세포 / 마우스)의 24 시간 후. 주 : MX1 - 유도 세포가 조혈 세포 및 조혈 유래 파골, MX1 + 조혈 세포의 제거 MX1 + 조골 세포의 이미징 품질 및 정량을 개선을 포함하기 때문이다. </li><li> 골수 이식 후 공여자 골수 세포의 성공적인 다시 채우기를 달성하기 위해 4-6주위한 동물을 모니터링한다. </li></ol> 2. 모준비에게 사용 <ol><li> IACUC 승인 절차를 사용하여 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / ㎏, 자일 라진 12 ㎎ / ㎏ 체중)의 50 μL의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 참고 : 효과 지속 시간이 케타민 / 자일 라진의 추가 투여에 의해 연장 될 수있다. </li><li> 마우스가 완전히 발가락 및 / 또는 꼬리 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 마취되어 있는지 확인합니다. 마우스를 마취하는 경우 (선택), 테이핑하여 코를 통해 이소 플루 란 가스 마스크를 고정합니다. 동물이 완전히 진정되어 있는지 확인하기 위해 이소 플루 란의 레벨을 조정합니다. </li><li> 전기 트리머 또는 작은 가위를 사용하여 두피 머리를 클립. 머리 조각을 제거하고 70 % 알코올 면봉으로 노출 된 피부를 소독. 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 적용합니다. </li></ol> 3. 미세 균열 부상 <ol><li> 동물이 완전히 진정되고 확인한 후, 두피의 피부를 열 수있는 하나의 역 L 자형 절개를합니다. 요약하면, 제 1의 가로 절개 (1cm 미만) starti을다른 귀 하나 귀에서 겨. 60 ° ~ 켜고 ~ 멀리 코에서 2-3mm 때까지 코를 향해 절개를 계속합니다. 주 :이 절개 묘화되는 영역 위에 흉터 조직의 형성을 최소화한다. </li><li> 집게로 양쪽으로 잡아 당겨 피부 플랩을 분리합니다. 모두 정면 뼈와 시상 및 관상 봉합의 교차점 명확하게 노출되어야합니다. </li><li> 모든 잔여 머리카락이 제거 될 때까지 멸균 PBS 및 멸균 거즈 또는 면봉과 부드러운 닦아로 세척하여 열린 표면을 청소합니다. </li><li> 개관에 미세 균열을 생성하려면, 한 손으로 마우스의 머리와 다른 손으로 30 G 바늘을 개최합니다. 부드러운 압력으로 30 G 바늘의 끝 부분을 삽입하고 운동을 왜곡하여 시상 ​​및 관상 봉합의 교차점 왼쪽 정면 뼈의 미세 구멍 (&lt;1 mm 깊이와 ~ 0.2 mm 직경의 상처)를 확인합니다. 주의 :함으로써 bleedi 최소화 뇌로 관통 바늘을 피하기 위해 중요NG 및 조직 손상. </li><li> 큰 바늘 (20 또는 25 G)로 전환하고 바늘 (~ 0.5 mm 직경)을 왜곡하여 구멍 구멍을 넓혀. </li><li> 반대측 정면 뼈에 두 번째 구멍을 생성하는 단계 3.3-3.5를 반복합니다. </li><li> 출혈이 멈출 때까지 PBS의 연속 낙하에 의한 부상 반점을 닦습니다. 주 : 골절 사이트에 출혈이 적절한 영상을 방해하고 흉터 형성을 유도 할 것이다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 두개골에 멸균 생리 식염수 또는 2 % 토셀의 드롭을 적용합니다. 참고 : 이미지 선명도를 줄일 수있는 두개골 표면이 건조하지 않도록하십시오. 이 영역을 커버하는 젤 또는 식염수의 충분한 양을 사용하는 것이 중요하다. </li></ol> 4.의 intravital 이미징 <ol><li> (선택 사항) 촬영하기 전에 일부 마우스는 혈관을 시각화하는 혈관 염료로 주입된다. 비 대상 Qtracker 705 80m에 희석 (50 mM의 붕산 버퍼에 2 μM 용액) 20 ㎕와 함께 복고풍 궤도 주입PBS의 L. 시약의 낭비를 최소화하기 위해 인슐린 주사기를 사용합니다. 신호가 충분히 밝지 않은 경우, 추가적인 양이 요구 될 수있다. </li><li> 스캐너의 전원을 켭니다. 참고 : 다각형 기반의 레이저 스캐너 비디오 속도로 동시 다중 채널 이미지 수집 (초당 30 프레임)을 할 수 있습니다. 비디오 속도 스캐닝 라이브 동물 이미징을위한 매우 중요합니다. </li><li> (: 사파이어 레이저 펨토초 티타늄) 다 광자 레이저의 전원을 켭니다. 880 nm의 파장을 설정하고 뼈의 두 번째 고조파 발생의 영상 (440 NM)의 전원을 조정합니다. GFP 및 tdTomato 여기를 들어, 491 ㎚, 561 nm의 고체 레이저의 전원을 켭니다. </li><li> PMT 각 신호 (광전자 증 배관) 검출기를 켭니다 (두 번째 고조파 발생에 대한 435 ± 20 nm의 대역 통과 필터, GFP의 528 ± 19 nm의 대역 통과 필터 및 tdTomato 590 ± 20). (선택 사항) Qtracker보기 (705)의 신호를 검출하도록 695 ± 27.5 nm의 대역 통과 필터와 638 nm의 헬륨 - 네온 레이저 및 PMT를 사용한다. </li><li> PLACXYZ 축 동력 현미경의 무대에서 동물을 전자. (이것은 동물 손실의 위험을 감소시킨다)의 체온을 유지할 수 있도록 전기 가열 패드를 가장 편안한 위치에 마우스를 유지한다. 촬영하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 가능한 한 수평으로 몇 군데 지역을 유지하기 위해 마우스를 잡고 테이프를 사용합니다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 두개골에 따뜻한 2 % 메틸 셀룰로오즈 겔 또는 생리 식염수 용액의 방울을 적용한다. 이미징 영역에 커버 글래스를 넣어. 덮개 뼈를 스캔 (0.9 NA로 30 배 물 침지 목적) 낮은 배율의 렌즈를 사용합니다. </li><li> XYZ 축 제어기를 사용하여 뼈 SHG 신호를 검출함으로써 덮개 뼈의 표면을 발견하고 시상 봉합과 관상 봉합의 교점으로서 중요한 랜드 마크의 위치를​​ 식별한다. 이미지를 획득하고 XYZ 좌표를 기록한다. </li><li> SHG 형광 신호를 관찰하여 손상의 위치를​​ 검색하기 위해 계속합니다. </li><li> 부상 사이트 또는 지역 오 때F 관심이 발견되어, 그 세포로부터 SHG 형광 신호를 포함하는 최적 초점 평면의 이미지를 획득. 저장 XYZ 좌표와 시상 및 관상 봉합의 교차점까지의 거리 이미징의 다음 라운드를 위해 자신의 정확한 위치를 정의 할 수 있습니다. </li><li> 골절 부상의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집, Z-스택으로 이미지를 기록 - 내막 뼈 표면에서 ~ 100 μm의 깊이 (5 μm의 간격). 부상의 한쪽의 촬상 종료 후, 다음 부상 사이트에 대한 촬영 처리를 반복한다. </li></ol> 5. 포스트 운전 설정 <ol><li> 촬상 후, 두개골에서 메틸 셀룰로오스 겔을 제거 멸균 식염수로 촬상 사이트를 헹군다. 멸균 면봉을 사용하여 표면에 트리플 항생제 연고 묻혀. 피부 플랩 커버 및 수술 봉합하여 두피를 다시 닫습니다. 이것은 저자 극성 봉합사 (흡수 polyglactin 스와 함께 할 수있는진짜야)와 5-0 크기 봉합 바늘. 주의 : 좋은 봉합 기술은 흉터 형성을 최소화한다. </li><li> / kg 부 프레 노르 핀 48 시간마다 12 시간이 수술 후 0.05 ~ 0.1 밀리그램의 IP 주입과 모든 동물을 치료. 그들은 충분한 의식을 되 찾을 때까지 따뜻한 복구 실에서 동물이 오지 않게하십시오. 3~5일 후 봉합을 다시 및 골절 치료시 세포의 변화를 추적 할의 intravital 이미징 단계를 반복합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 금융 관심이 없다는 것을 선언합니다.

골격 줄기 세포의 조절은 골 재생을 달성하기 위해 더 나은 방법을 정의하기 위해 매우 중요 할 수있다. 세포 수준에서 정량 및 연속 촬영은 기술적으로 도전하고있다. 마우스 긴 뼈의 골절 모델이 널리 사용되는 생체 역학적 연구 (17)에 적합하였으나, 그 깊은 조직의 위치, 고르지 골절의 크기, 연부 조직 손상, 및 안정화 fixators의 응용 프로그램이 순차의 intravital 이미징을 제한했다. 여기서, 공 초점 / 이광자 현미경의 intravital 및 마우스 두 개관 골절 모델의 조합에 의해 이러한 한계를 극복하기위한 방법이 제공된다. 골 형성 줄기 / 전구 혈통 추적이 방법은 골절 수리 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 내 이미징에서 실시간에 대한 능력을 보여줍니다. 이 방법에서 중요한 기술적 문제는 시간이 지남에 일관된 고품질의 화상을 얻을 수있다. 고품질 임최대 촬상 깊이와 나이는 형광성 리포터 및 이미징 영역의 조직 상태의...

퇴행성 뼈 질환 및 골다공증 성 골절의 위험이 높은 선도 연령과 관련된 뼈 손실은 공중 보건의 1의 주요 과제가되고있다. 뼈의 유지 보수는 뼈가 형성 조골 세포와 뼈 resorbing 파골 세포에 의해 제어된다. 뼈 형성 세포의 결함은 연령과 관련된 뼈 손실 및 퇴행성 뼈 질환 2,3의 주요 원인입니다. 광범위한 연구는 골절 치료의 개선에 집중되었지만, 안정적인 약물의 발견은 뼈 퇴행성 질병을 치료 및 골다공증 성 골절의 약점을 취소하는 것은 중요한 문제가 남는다. 따라서, 골 재생 및 수리의 골 형성 세포 및 그 제어 메커니즘의 근원을 연구하면 골격 재생을 높이고 골 손실 질환을 반전하는 신규 한 통찰력을 제공한다. 골수에있는 다 능성 간엽 세포의 존재는 클론 원성 개체군의 식별에 기초하여 제안되었다 수 있었고 상이한골 형성에 늦었, 지방 형성과 연골 계보는 생체 4. 최근, 여러 연구는 골격 / 중간 엽 줄기 세포 (SSC가 / 엽 줄기 세포)는 조골 세포의 자연적인 원천 및 골 교체, 개조, 및 파괴 수리 5,6에 중요한 것으로보고있다 . 또한, 우리의 혈통 추적 연구는 성숙한 조골 세포가 예기치 않게 짧은 반감기 (~ 60 일)이 지속적으로 정상 항상성과 골절 수리 조건 6 모두 자신의 줄기 / 전구 세포에 의해 보충되는 것으로 나타났다. 그러나, 생체 내 줄기 세포의 정체성과 어떻게 이러한 세포는 부상 골절과 뼈 형성 세포가 불분명 공급하는 반응. 따라서, 생리적 상황에서 이주, 증식 및 내인성 개의 SSC / 엽 줄기 세포의 분화를 분석 할 수있는 방법을 개발하는 것이 중요하다. 골절 수리 복잡한의 배열에 의해 규제 다세포과 역동적 인 과정이다사이토 카인과 성장 7 요인. 골절 연구에 가장 인기있는 방법은 긴 뼈 골절 동물 모델을 사용하여 뼈 절편 및 면역 형광 기법 8-10로 뼈를 분석하는 것이다. 이 복구 프로세스는 마이크로 - CT (11), 근적외선 형광 (12) 및 화학 발광 영상 (13)을 포함하여 다수의 영상 기술로 모니터링 할 수있다. 그러나 각 기술은 특정 제한 사항이 생체 내에서 세포 수준에서 SSC가 / MSC 기능을 모니터링하는 효과적인 방법이 없었다. 최근에, 공 초점 / 이광자의 intravital 현미경이 개발 및 동물에게 14 리빙 심지어 단일 셀 해상도 그들의 골수 미세 환경의 컨텍스트에서 이식 된 암세포 및 조혈 줄기 세포를 검출하기 위해 사용되어왔다. 계보 추적 모델 시리즈 기술을 결합함으로써, 우리는 골 형성 줄기 / 전구 세포는 유전자 변이 (AC)에 의해 표시 될 수 있음을 정의 할 수 있었다믹소 바이러스 저항 -1 (MX1) 발기인 및 MX1 유도 조상의 tivation 시간이 지남에 성숙한 조골 세포의 대부분을 유지할 수 있지만, 성인 마우스 (6)에 연골 세포의 생성에 참여하지 않습니다. 또, MX1-표지 OSPCs은 골절 치료 6 새로운 골아 세포의 대부분을 공급하는 것을 보여 주었다. 여기에, osteo-혈통 추적 모델과의 intravital 현미경을 사용하여, 프로토콜은 골절 수리 MX1 + 골 형성 줄기 / 전구 세포의 생체 역학을 정의하기 위해 제공됩니다. 이 프로토콜은 골절 사이트에 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이전 및 초기 수리 과정에서 osteoprogenitor 확장의 정량적 측정을 추적하기 위해 순차적으로 영상을 제공합니다. 이 접근법은 골 수선을 향상시키는 치료 후보의 평가를 포함한 여러 상황에서 유용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2B)</td><td>Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>케타민 염산염 주입</td><td>Bionichepharma</td><td>67457-001-10</td><td>&nbsp; 바이알 크기: 10ml(50mg/ml)</td></tr><tr><td>자일라진 멸균 솔루션</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 Hl</td><td>BEDFORD LAB</td><td>NDC 55390-100-10</td><td>바이알: 0.3 mg/ml, 용량: 0.05-0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>CORNING cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드 (70% 이소프로필 알코올)</td><td>Kendall WEBCOL</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Fine Surgical Scissor</td><td>F.S.T</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>VICRYL*Plus Suture</td><td>Ethicon</td><td>VCP490G</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 705 비표적 양자 점</td><td>Invitrogen</td><td>Q21061</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>OmmiVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIpC (폴리이노신-폴리시티딜산)&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마</td><td>P0913-50MG</td><td>100 &mu; l (PBS에서 2.5 mg / ml) 마우스</td></tr><tr><td>Mai Tai 조정 가능한 초고속 레이저</td><td>스펙트럼 물리학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>듀얼 칼립소 491 + 532 nm DPSS 레이저</td><td>코 볼트 AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반경 -635 HeNe 레이저</td><td>코 히런트</td><td></td><td></td></tr> 10g</tbody></table>

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

뼈는 지속적으로 반전 높은 재생 부상을 따르고있다. 골 형성 줄기 / 전구 세포가 오랫동안 존재하는 가설이 있지만, 이러한 세포의 생체 내 데모 최근에 달성되었습니다. 여기에, 생체 이미징 기술 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 역할 (OSPCs)과 뼈 수리에 자신의 자손을 조사하기 위해 제공됩니다. 모델과 두 개관 뼈 유도 미세 균열의의 intravital 이미징을 추적 osteo-계보 세포를 사용하여, OSPCs 직접 초기 수리 과정에서 중요한 이벤트가 발생하는 부상 후 처음 몇 일 동안 관찰 할 수있다. 상해 사이트는 순차적으로 OSPCs가 부상으로 옮겨 놓을 수가 증가하고 뼈 형성하는 조골 세포로 분화 드러내는 이미지가 될 수있다. 이러한 방법은 뼈 재생 및 수리를위한 줄기 세포의 내장과 외부의 분자 규제의 역할을 조사하는 수단을 제공합니다.

<html> 안정화 된 긴 뼈의 골절 모델은 골절 연구에 인기가있다. 그러나, 긴 뼈의 골절 또는 큰 모델은 여러 조직의 손상을 야기하기 때문에, 뼈 세포 기능의 양적 측정에 제한이있다. 우리는 바늘 드릴링 (그림 1A-1C)와 두 개관 정면 뼈에 최소 침습 부상 (경막에없이 또는 최소한의 침윤 미만 mm 직경)를 개발했다. 이 뼈는 (다른 조직의 간섭없이 맑은 부상 뼈의 영상, 뼈 세포 및 혈관을 허용, 골수와 평평하고 얇은 뼈 구조를 가지고 있기 때문에 우리는 미세 균열의 생체 라이브 영상의 두 개관 정면 뼈의 평면도를 선택했다 그림 1C). 우리는이 미세 균열이 무기물 증착 및 새로운 골 형성 (데이터 미도시) 다음에 부드러운 캘러스 형성을 포함한 대규모 파괴 부상의 많은 특성을 되풀이되었습니다 것을 관찰했다. MX1 + 골 형성 줄기 전구 세포의 생체 내 이미징</stron...

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 골절 치유 과정에서 내인성 골성 줄기세포 및 전구세포의 이동, 증식 및 분화를 순차적으로 추적하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 poly cynic poly cyto ilic acid 주입을 통해 체내의 mixo virus, influenza virus resistance, one 또는 MX one 양성 세포를 표지한 다음, 방사선 조사를 통해 상주하는 MX one 양성 조혈 세포를 제거합니다. 두 번째 단계에서는 야생형 골수 세포를 방사선 조사된 마우스에 체계적으로 투여합니다.다음으로, 니들 드릴링을 통해 마우스 Cal 영역에 미세 골절을 유도합니다. 마지막으로, 미세 골절 치유 과정에 대한 순차적 생체 내 영상 촬영을 수행합니다. 결과적으로, 이러한 생체 내 영상은 골절 부위로 유입되는 골형성 줄기세포 및 전구세포의 유입과 증식 역동성을 평가하는 데 사용될 수 있습니다.따라서 이 기술의 주요 장점은 골절 치유 과정 동안 골 형성 줄기세포 및 전구세포를 체내에서 반복적으로 이미징할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 함의는 골절 치유 및 골다공증 치료로까지 확장됩니다. 본 방법은 골 재생 및 수복 과정에서 내인성 골 형성 줄기 전구세포를 모니터링할 수 있는 새로운 도구를 제공하기 때문입니다.최소한의 조직 손상으로 미세골절을 생성하고, 심각한 흉터 형성을 유발하지 않으면서 골절 부위를 반복적으로 생체 내(in vivo) 영상화하는 것이 이 방법의 핵심이자 기술적으로 까다로운 부분이기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 생체 내에서 MX1 양성 세포를 표지하려면, MX1 Cree 리포터 마우스의 체중 20 g당 200 µL의 poly acidic poly cyto ilic acid를 10일 동안 이틀에 한 번씩 복강 내로 주입하십시오. 그다음, 상주하는 MX1 양성 조혈 세포를 제거하기 위해 주입된 마우스에 9.5 Gy를 단회 조사하십시오. 24시간 후, 마우스당 1 × 10⁶ 개의 야생형 골수 세포를 정맥 내로 이식하십시오.4~6주 후, ketamine xylazine 50 µL를 복강 내 주사하여 마우스를 마취합니다. 발가락 꼬집기(toe pinch)로 진정 상태를 확인한 후, 골수 세포가 이식된 마우스의 두피를 삭모하고 70% 알코올 솜으로 노출된 피부를 소독합니다. 각막 탈수를 방지하기 위해 티어 젤(tear gel)을 도포한 다음, 한쪽 귀에서 다른 쪽 귀까지 두피를 가로질러 1 cm 미만의 횡절개를 실시합니다. 이어서 동물을 약 60도 회전시킨 후, 포셉을 사용하여 코에서 약 2~3 mm 떨어진 지점까지 절개를 계속합니다.조직 플랩을 동물의 측면 방향으로 당겨 피부를 분리하면, 양측 전두골과 시상 봉합 및 관상 봉합의 교차점이 명확하게 노출되어야 합니다. 노출된 표면을 멸균 PBS로 세척한 다음 면봉으로 잔여 털을 부드럽게 닦아냅니다. 그 다음 두개골에 미세 골절을 생성하기 위해, 한 손으로는 마우스의 머리를 잡고 다른 손으로는 30 gauge 바늘을 잡습니다.30 gauge 바늘 팁을 사용하여 시상 봉합과 관상 봉합의 교차 지점 근처 전두골의 한쪽에 미세 천공을 조심스럽게 뚫습니다. 뇌 조직을 관통하는 것을 방지하기 위해 더 굵은 게이지의 바늘로 교체하고, 새 바늘을 회전시켜 천공 구멍의 직경을 약 0.5 millimeters 정도로 넓힙니다. 반대측 전두골에도 두 번째 천공을 만든 후, 출혈이 멈출 때까지 각 부위에 PBS를 계속 떨어뜨리며 닦아냅니다.그 다음 건조를 방지하기 위해, Vidal 이미지를 획득할 영역을 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 양의 멸균 생리식염수를 두개골 위에 떨어뜨립니다. 먼저 폴리곤 기반 레이저 스캐너를 켜서 초당 30프레임의 비디오 속도로 동시 다채널 이미지 획득이 가능하게 합니다. 이어서 다광자 이미징을 위해 펨토초 티타늄 사파이어 레이저를 켭니다.두개골의 제2고조파 생성(second harmonic generation) 이미징을 위해 출력과 파장을 880 nanometers로 설정하고, GFP 및 TD tomato 여기를 위해 440 nanometers로 설정한 후, 491 nanometer 및 561 nanometer 고체 레이저를 켭니다. 그다음 각 신호에 맞는 광전증폭관(photo multiplier tube) 검출기를 켜는데, 제2고조파 생성의 경우 435 ± 20 nanometer 밴드패스 필터를, GFP의 경우 528 ± 19 nanometer 밴드패스 필터를, 그리고 TD tomato의 경우 590 ± 20 nanometer 밴드패스 필터를 사용합니다. 이제 동물을 37 °C로 설정된 전기 가열 패드 위의 XYZ축 전동 현미경 스테이지에 놓습니다.테이프를 사용하여 마우스의 위치를 고정한 다음, 따뜻한 2% Methylcellulose 기반 겔 한 방울을 두개골 위에 도포합니다. 건조를 방지하기 위해 이미징 영역 위에 커버 글라스를 덮습니다. 그런 다음 0.9 개구수로 30 x 수침 렌즈와 XY, Z축 컨트롤러를 사용하여 뼈에서 발생하는 SHG 신호를 검출합니다.두개골 표면을 찾으려면 시상봉합과 관상봉합의 교차점과 같은 중요한 랜드마크 위치를 식별하고 이미지를 획득하십시오. 해당 랜드마크의 XY, Z 좌표를 표시한 다음, SHG 및 형광 신호를 가이드로 사용하여 손상 부위의 위치를 계속해서 검색하십시오. 각 관심 영역을 찾으면, 관심 세포의 SHG 및 형광 신호가 포함된 최적의 초점 평면 이미지를 획득하십시오.시상 봉합과 관상 봉합의 교차점까지의 거리와 XY, Z 좌표를 저장하여 다음 영상 촬영을 위한 정확한 위치를 정의합니다. 그런 다음 골절 부위의 3D 세포 및 뼈 구조를 수집합니다. 내골 표면으로부터 약 100 µm 깊이까지 약 2~5 µm의 Z 스택 간격으로 영상을 기록합니다.마지막으로, 두 손상 부위의 이미징을 마친 후 멸균 생리식염수를 여러 방울 사용하여 두개골에서 2% Methylcellulose 겔을 제거합니다. 이제 표면에 항생제를 도포하고 피부 플랩으로 두개골을 덮은 다음, 저자극성 봉합사로 두피를 다시 봉합하고 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 따뜻한 회복 챔버에 보관합니다. 3~5일 후, 골절 치유 과정 중의 세포 변화를 추적하기 위해 생체 내 이미징(Intravital imaging) 단계를 반복합니다.이 대표 실험에서는 방사선 조사 및 골수 교체 후, tomato osteocalcin, GFP 마우스의 전두골에 두 개의 미세 골절을 생성하였습니다. 미세 골절에 대한 순차적 3D 생체 내 영상 촬영 결과, 골절 발생 2일 차에 골절 부위 내에서 tomato 양성 조골성 줄기세포 및 전구세포의 재배치가 관찰되었으며, 5일 차에는 이들의 확장이 확인되었습니다. 이 시점에서는 GFP 양성 조골세포가 검출되지 않았으나, 12일 차에는 화살표로 표시된 바와 같이 골절 표면 근처의 조골 전구세포 일부가 tomato 양성 GFP 양성 조골세포로 분화를 시작하였습니다. 21일 차에 새로운 조골세포가 축적되고 신생 골 형성이 이루어진 것은, 조골 전구세포의 이동과 증식이 골절 치유를 위한 새로운 조골세포 공급의 주요 기전이었음을 나타냅니다. 본 방법이 골절 치유 과정 중 조골 전구세포 수에 대해 일관되고 정량적인 결과물을 제공하는지 테스트하기 위해, 손상 후 14일 동안 MX one YFP 양성 조골성 줄기세포 및 전구세포를 추적하였습니다.손상 후 3일째에 소수의 전구세포가 손상 부위에서 일관되게 검출되었습니다. 세포 수는 7일째에 지속적으로 증가하여 10일째에 정점에 도달했으며, 14일째까지 그 수준이 유지되었습니다. 골 전구세포 생성의 역학은 시간에 따른 YFP 신호 강도를 측정하여 정량화하였으며, 이는 생체 내 현미경 관찰 결과와 상관관계가 있었습니다.전구세포는 3일 차에 처음 관찰되었으며, 10일 차에 정점에 도달한 후 14일 차까지 비슷하게 높은 강도로 유지되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 숙련된 봉합 기술과 출혈의 최소화가 흉터 형성을 줄이고 배경 자가형광을 낮출 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 골절 치유 과정에서 내인성 골성 줄기 전구세포의 이동, 증식 및 분화를 이미징하고 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간 perivascular 줄기 세포는 (PSCs) mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 유사한 골격 조직 재생을위한 소설 줄기 세포 클래스입니다. PSCs는 표준 지방 흡입 절차 동안 조달 지방 조직에서 FACS (형광 활성 세포 분류)에 의해 격리 수 있습니다 다음, 뼈 형성을 달성하기 osteoinductive 비계와...

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

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산만 Osteogenesis, 또는 임계 크기의 결함의 치유는 Intramembranous 골화을 평가하기위한 Rigidly 안정 골절 만들기

조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs) 및 골수 틈새 시장 사이의 상호 작용의 본질은 제대로 이해된다. 맞춤형 하드웨어 변형 및 다단계 획득 프로토콜은 생체 화상 골수 영역 내에 홈 표지 HSPCs 추적 상호 작용과 움직임 이광자 및 공 초점 현미경의 사용을 허용한다.

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말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Endochondral 뼈 치유 하는 동안 골절 굳은 살에 조직 개발의 평가 치료 과정을 모니터링 하는 데 필수적 이다. 여기, 우리는 자기 공명 영상 (MRI)의 사용을 보고-MRI 있도록 마우스 대 퇴 골에 대 한 호환 외부 fixator 쥐에서 뼈 재생 동안 검색.

Vivo에서 골절 뼈 쥐 마우스 대 퇴 골에 대 한 MRI-호환 Osteosynthesis 장치를 사용 하 여 치료 기간 동안 굳은 살 개발의 평가

Murine 닫힌된 대 퇴 골절 모델 골절 치유를 공부 하는 강력한 플랫폼 이며 뼈 재생을 촉진 하는 새로운 치료 전략. 이 수술 프로토콜의 목표는 일방적인 폐쇄 대 퇴 골절 대 퇴 골을 안정화 하는 intramedullary 강철 막대를 사용 하 여 마우스에 생성.

마우스에 닫힌된 대 퇴 골절의 발생: 뼈 치유 연구 모델

다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

이 프로토콜은 살아있는 동물 내 생물체 검사를 사용하여 실시간으로 CCL5 매개 periosteal skeletal 줄기 세포 이동의 검출을 설명합니다.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

이 프로토콜은 골절 치유 연구를 위해 골수 내 와이어로 안정화된 마우스의 대퇴골에 골절 골절을 확립하기 위한 수술 절차를 설명합니다.

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

배우세요 생체 내 현미경을 이용하여 골절 치유 중 골 형성 줄기세포의 이동, 증식 및 분화를 추적하고 정량화하는 방법을. MX1-Cre 리포터 마우스 모델을 사용하여 반복적인 생체 이미징이 가능한 이 기술은 골 재생 메커니즘 연구와 골다공증 치료 개발에 활용됩니다.

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