Name: 식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 배우세요 식물 세포 없는 시스템에서 단백질 분해를 분석하는 방법을. Nicotiana benthamiana 잎을 이용하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 단백질 안정성을 평가하고, 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 역할을 규명합니다.

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이 책에 이르는 작품은 GA 번호 246550에서 말라가 대학과 유럽 연합 (EU) 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에 의해 cofinanced 마리 퀴리 COFUND 프로그램 &quot;U-모바일&quot;에서 자금 지원을 받았다. 실험실에서의 작업은 VC에 NIH, USDA / NIFA, NSF, 시인, 및 BSF에서 교부금에 의해 지원됩니다

1. 단백질 발현 <ol><li> 발현 시스템의 선택 시스템, 즉, 벡터 및 특정 모델 생물 / 세포에 대한 관심의 단백질의 발현에 가장 적합한 벡터 전달 방법을 선택합니다. 우리의 분석에 가장 세포의 많은 수의 일시적 변화에 의해 달성된다 쉽게 검출 가능한 양의 시험 단백질의 발현을 필요로합니다. 식물에서, 예를 들어, 이는 유용한 전달 시스템과 같은 발현 벡터 및 아그로 이진 플라스미드를 사용하여 달성된다. </li><li> 바이너리 발현 벡터의 구축 에피토프 태그에 단독으로 또는 번역 융합 하나를 발현 벡터에 관심의 단백질 (들)의 코딩 서열 (들)을 복제합니다. 사용은 선택 발현 시스템 및 유전자 복제에 대한 표준 분자 생물학 절차에 적합한 벡터. 아그로 박테 리움 매개 유전자 전달을 위해, standa를 사용하여도, 이진 벡터를 고용하고 그들을 소개식물 조직의 후속 접종 등 EHA105으로 아그로 박테 리움 균주로 RD 프로토콜. </li><li> 식물 종의 선택 관심의 단백질 (들)로 표현 될 수있는 식물 종을 선택합니다. 아그로 박테 리움 매개 유전자 변형의 영향을 모든 식물 종은 사용할 수 있지만, 그주의, 선택의 우리의 식물 종은 쉽게 아그로 박테 리움에 매우 취약, 성장 된 담배 benthamiana이며, 쉽게 접종 큰 잎을 가지고 있습니다. </li><li> 식물 성장 긴 하루의 환경 통제 된 조건 (예를 들면, 성장 챔버) (130) (즉, 16 시간에서 냄비 (20cm가 X 20cm X 20cm)의 프로 믹스 BX와 함께 냄비에 4 주에서 6 주 동안 수행되는 하나의 식물을 성장 23 ° C에서 -150 μE m-2 S-1 등, 20 ° C에서 8 시간의 어두운)와 40-65% 상대 습도. 때때로 제조업체의 지침에 따라 상용 제품과 1.5.2 비료. 식물이 성장하면, 선택아그로 박테 리움 접종 50 X 70mm mm 또는 더 큰 크기 (이 길이 측정은 잎자루를 포함하지 않는다)를 남긴다. </li><li> 아그로 박테 리움 접종 / 적절한 항생제 (예를 들어, 100 mg의 보충 YEP 배지에서 28 ° C (1 % 펩톤 1 % 효모 추출물, 0.5 %의 NaCl)에서 하룻밤 단계 1.3에서 테스트 단백질 (들)을 표현하는 이진 구조를 숨겨 아그로 박테 리움 균주를 성장 L 스트렙토 마이신과 pPZP-RSC2 기반 벡터 24 ~ 25) 10 ㎎ / L의 리팜피신. [10 mM의 MgCl2를 2, 10 MM의 메스 (산도 5.6), 100 μM 아세토 시린 곤] 침투 버퍼 = 0.5 (600) OD, 실온에서 2 시간 동안 배양 재현 탁 1.6.2 원심 분리기 세포. 1 ML의 바늘없는 주사기를 사용하여 잎의 배축면에 문화를 침투, 공장에 연결되어있는 동안 잎이, 현장에서 접종 있습니다. 1.6.3 침투 한 후, 16 시간 130-150 &amp;의 빛 정권 하에서 72 시간 동안 식물을 성장# 181;에서 E m-2 S-1 등 23 ° 수확하기 전에 20 ° C에서 C / 8 시간의 어둠. </li><li> 프로 테오 좀 억제제의 적용 테스트 단백질 (들)은 프로 테오 경로를 통해 분해되는 개념을 지원하기 위해, 감소 또는 저하를 차단해야하는 특정 프로 테오 좀 억제제 MG132을 사용하여 28 ~ 29을 lactacystin. 네 시간 (2.1 단계 참조) 수확하기 전에, 10 μM MG132 (EMD 밀리 포어) 또는 10 μM의 lactacystin (시그마 - 알드리치) 또는과 아그로 박테 리움 접종 잎의 영역을 침투 각각의 용매, 즉, 0.1 % DMSO와 잎을 모의 치료 또는 증류수. </li></ol> 2. 무 세포 추출물의 제조 <ol><li> 잎 수확 잎의 접종 장소, 일반적으로 CA를 수확. 200-400 신선한 무게 ㎎, 액체 질소의 미세 분말로 그들을 갈기. 또한, 모든 비드 비터 (예를 들어, Biospec) 또는 치과 된 amalgamator (예를 들어, TPC 고급을 사용하여 조직을 비드 이길<html> 직접 분해 버퍼 기술) () 2.2 단계를 참조하십시오. </li><li> 단백질 추출 분해 버퍼 500 μL에 지상 조직을 배치하여 총 단백질 추출물을 준비 [50mM의 트리스 - HCL (산도 7.5), 100 mM의 NaCl을, 10 mM의 MgCl2를 2, 5 mM의 DTT, 5 MM의 아데노신 5&#39;-인산, 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치)]. 프로테아제 억제제 칵테일은 주로 세린, 시스테인, 아스파라긴산, 그리고 메탈로 영향을 미치는 26S 프로 테아을 방해하지 않습니다. 5 분 12,000 XG에서 두 개의 연속 centrifugations하여 추출물을 명확히. </li><li> 단백질 분해 반응 튜브의 미세 시간의 증가 된 기간 동안 실온에서이를 배양, 추출, 보통 20 μL 같은 부피를 전송합니다. 일반적으로, 샘플 시간 제로 및 5, 10, 15, 20, 그리고 30 분 시간 지점. SDS 젤 샘플 버퍼에 끓여 반응을 중지하고 서부 블롯을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. 면역 블 롯팅에 의해 단백질 분해 검출 <ol><li> 겔 전기 영동 3.1.1 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동하여 단백질 시료를 해결하고 표준 프로토콜 30에 따라 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 해결 electrotransfer. 3.1.2 브래드 포드 방법 (바이오 래드)를 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 레인 당 총 단백질의 50 ~ 80 μg을로드합니다. 모든 샘플이 동일하게로드되어 있는지 확인합니다. 컨트롤을로드를 들어, 약 50 kDa의 상대 전기 이동성과 주요 밴드로 마이그레이션 추정 RuBisCo 대형 체인 등 유비쿼터스 단백질 종의 농도를 비교, 그들은 쿠마시 블루 염색 젤 또는 개양귀비 빛의 S-또는 감지 할 수 있습니다 형광 SYPRO 니트로 셀룰로오스 막 루비 스테인드. </li><li> 블로킹 실온에서 1 시간 동안 TBST에서 5 % 탈지 우유 (10 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4의)으로 멤브레인을 차단. </lI&gt; <li> 차 항체 제조업체에서 권장하는 농도로 TBST 1 % 탈지 우유에 기본 안티 - 항원 항체를 희석하고 교반과 함께 4 º C에서 실온에서 1 시간 동안이나 밤새 차단 막과 부화. </li><li> 세정 막 한 번 15 분 동안 20 ㎖의 TBST에 린스 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분. </li><li> 이차 항체 제조업체에서 권장하는 TBST 1 % 탈지 우유에 말 무 퍼 옥시 데이즈 (HRP)가 결합 이차 항체 (예를 들어, 안티 - 토끼 IgG의)를 희석하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 막에 품어. </li><li> 검출 단계 3.4에 설명 된대로 다시 멤브레인을 씻어. TBST에서 최종 헹굼 후, 가장 일반적으로 ECL 키트를 사용하여, HRP를 화학 발광 기질과 관심 단백질을 가시화. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 분석은 식물 조직에서 시험 단백질의 발현에 의존하고, 따라서, 잠재적 인 프로 테오 분해 과정은 분명히 생체 조직 내에서 이미 발생한다. 우리는 제로 샘플은 초기 기준점으로서의 시간만을 추출한 그러나 단백질 불안정화를 분석 실험. 따라서, 우리는 세포가없는 분석으로 정의합니다. 이 분석의 성공에 대한 한 가지 중요한 측면은 시험 단백질 (들)이 생성 될 것이다에서 발현 벡터의 올바른 선택이다. 테스트 단백질에 대한 특이 항체를 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 그것은 에피토프 태그 웨스턴 블로 팅에 의해 검출해야한다. 태그 단백질은 아그로 박테 리움 이진 벡터에서 표현되어야한다. 이러한 많은 벡터가 26 사용할 수있는 반면, 우리는 pPZP-RCS2 이진 플라스미드로 발현 카세트의 1 단계를 삽입 할 수 있습니다 모듈 식 PSAT 플라스미드 시스템 (24)에서 파생 된 벡터를 사용하는 것이 좋습니다24 ~ 2...

ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 경로는 다른 사람의 사이에서 전사 조절, 세포주기의 진행과 신호 전달 수용체 하향 조절 또는 엔도 시토 시스, 1-4을 처리하는 등 다양한 생물학적 반응의 제어를위한 광범위한 메커니즘으로 부상하고있다. 이 경로에서, 목적 단백질은 제 유비퀴틴 활성화 효소 E1에 thiolester 결합을 통해 부착하고 유비퀴틴 접합 효소 E2의 시스테인 아미노산 잔기에 옭되는 잔기를 유비퀴틴로 태그되며 마지막으로, E2는 유비퀴틴 리가 제 E3와 상호 작용 , 단백질 기질의 polyubiquitination 결과. 궁극적으로, polyubiquitinated 단백질은 26S 프로 테아 좀에 의해 인식 저하된다. 이 메커니즘에서, E3 효소는 기질을 지정하고 ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 주요 구성 요소를 규정하는 역할을한다. E3 리가 제의 예 RING 도메인 리가 제로서, 또는 multisubunit의 SCF (S의 일부로서 역할을 할 수 독립적이러한 F-상자 도메인 리가 제와 같은 kp1/Cullin/F-box 단백질) 복잡한. SCF-매개 프로 테오 분해 경로는 전사, 세포주기, 신호 전달 5-10 많은 다른 주요 세포 기능의 조절에 관여하고 있습니다. 세포 과정의 조절에 이러한 중요한 역할 외에, UPS는 많은 식물 병원균 상호 작용에 중앙 무대 걸립니다. 예를 들어, 증거가 증가하고 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 등 여러 가지 식물 병원균, 감염 과정 (11)를 용이하게하기위한 호스트 UPS에 의존하는 것이 좋습니다. 아그로 박테 리움은 자연의 호스트를 나타내는 식물에 종양 성장을 이끌어, 또한 인간의 세포 (12, 13)에 곰팡이 1,2에서, 다른 진핵 생물의 넓은 범위를 변환 할 수 있습니다. 그 감염시, 아그로 박테 리움은 숙주 세포 12-13으로 DNA 요소 (T-DNA) 및 여러 독성 (비르) 단백질을 보냅니다. 이러한 단백질 중 하나는 VirF, 발견 된 첫 번째 F-박스 단백질원핵 유전체 (14)에 의해 부호화된다. SCF 유비퀴틴 리가 아제 단지, VirF, 그 기능 호스트 상동 VBF (15)의 한 부분으로, 아마도 VirE2, 그 부속 세균 및 호스트 단백질에서 침입하는 세균의 T-DNA의 uncoating을 용이하게 UPS 매개 단백질 분해를 통해 아그로 박테 리움 감염을 촉진 및 VIP1 각각 16, 17. 흥미롭게도, VirF 등 많은 F-박스 단백질은, 때문에 autoubiquitination 활동 18, 19 또는 F-박스 단백질이 기판 20-23 역할을 할 수있는 다른 E3의 리가 제에 의해 매개되는 자신의 단백질 분해, 본질적으로 불안정하다. F-박스 단백질, 다른 유비퀴틴 리가 제, 및 / 또는 기판의 생화학 활동을 연구 할 때, 프로 테오 저하위한 간단하고 신뢰성있는 분석을 사용하는 것이 매우 유용 할 것이다. 여기에서 우리는 세포의 단백질 안정성 분석을위한 하나의 프로토콜을 설명없는 시스템입니다. 이 분석에서, UPS 기판의 안정성은 무 세포계에서 이러한 F-박스 단백질로서 프로 테오 열화 통로의 필수 성분 중 하나의 존재 또는 부재 하에서 분석된다. 일반적으로, 우리는 이러한 조직에서 무 세포 추출물을 준비하고 웨스턴 블로 팅에 의해 관심의 단백질 (들)의 양을 모니터링, 식물 조직에서 테스트 된 단백질 (들)을 표현한다. 단백질 분해의 UPS 의존 메커니즘은 특정 프로 테오 좀 억제제 및 / 또는 SCF 성분 Cullin의 우성 음성 형태의 동시 발현을 사용의 포함에 의해 증명된다. 우리 VBF 15 F-박스 단백질에 의해 아라비돕시스 VIP1 17 단백질의 프로 테오 저하하여이 분석을 예시하는 반면, 그것은 임의의 다른 프로 테오 기판의 안정성을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>반건조 웨스턴 블로팅 SD 전기 전달 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG Peroxidase Conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT 니트로셀룰로오스 전사 멤브레인</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon western chemiluminescent HRP substrate</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

단백질 분해에 대한 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로는 거의 모든 진핵 생물의 세포 기능의 다양한 스펙트럼의 규제를위한 가장 중요한 메커니즘 중 하나로 떠오르고있다. 구체적으로, 식물에서, 프로 테아 좀의 ubiquitin/26S 시스템 (UPS)의 단백질 분해를 조절하고 면역 반응, 개발 및 프로그래밍 된 세포 사멸을 포함한 공정의 넓은 범위의 발전에 크게 기여한다. 또한, 증가하는 증거는 아그로 박테 리움 등 다양한 식물 병원균, 식물 병원균 상호 작용에있는 UPS의 중요성을 강조하고, 효율적인 감염 호스트 UPS를 이용하는 것이 좋습니다. UPS의 기질 특이성은 E1과 협력 작용 및 E2가 그들에게 유비퀴틴 분자 체인을 부착하여 열화로 향하는 특정 단백질 분자를 인식하고 표시하는 리가 제 E3 유비퀴틴 리가 제에 의해 달성된다. E3의 리가 제의 하나의 클래스가 SCF입니다 (Skp1 / C특히 UPS 기판을 인식하고 자사의 F-박스 단백질 구성 요소를 통해 유비퀴틴을 위해 그 (것)들을 대상으로 율린 / F 상자 단백질) 복잡한. 그 생물학적 과정에서 UPS의 잠재적 인 역할을 조사하기 위해, UPS 매개 단백질 분해에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 분석을 고안하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 식물 세포가없는 시스템을 사용하여 하나의 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 F-박스 단백질 기판의 상호 작용에 특별한 중점을두고, 다양한 세포 과정의 조절 단백질 분해의 역할의 연구에 적용 할 수 있습니다.

Zaltsman 등. 17에서 적응 그림 1은 세포가없는 시스템에서 프로 테오 저하의 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 특히, 우리는 N.의 SCF VBF 경로를 통해 VBF F-박스 단백질에 의한 식물 방어 관련 단백질 VIP1의 불안정을 보여 benthamiana. 애기 VBF 및 HA-태그 VIP1 (HA-VIP1) 단백질을 일시적으로 동시 발현하고, 표현 잎의 추출물 내의 HA-VIP1 콘텐츠 단백질은 서양 블로 팅에 의해 분석 하였다. 이 분석은 VBF과 동시 발현 때 VIP1의 양이 상당한 수준으로 감소되었다는 것을 보여 주었다, 그러나 VBF의 동시 발현 (그림 1A)의 부재에 상대적으로 안정적으로 유지. VBF없이 VIP1 내용에 약간의 감소가 내생 담배 VBF 활동의 낮은 수준으로 인해이 발생할 수 있습니다. VBF로 VIP1의...

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 &quot;태그&quot;봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

다음 실험의 전반적인 목표는 무세포 시스템(cell-free system)에서 단백질 안정성을 분석하는 것입니다. 이는 바이너리 컨스트럭트를 포함하는 목적 단백질을 보유한 서로 다른 아그로박테리움(agrobacterium) 균주를 Oceana Biana에 접종함으로써 달성됩니다.그 다음으로 식물 잎에서 총 단백질을 추출합니다. 잎을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 상온에서 시간을 달리하여 배양합니다. 이어서 단백질 시료를 SDS-Acrylamide 겔 전기영동으로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막으로 전기 전이시킵니다.특이적 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출하기 위해, 웨스턴 블로팅 분석을 기반으로 특정 프로테아좀 억제제의 존재 또는 부재 시 단백질 안정성을 나타내는 결과를 얻습니다. 본 논문에서는 무세포 시스템(cell-free system)에서 프로테아좀 분해 경로의 필수 구성 요소 중 하나가 존재하거나 없을 때, INE 프로토좀 시스트 기질의 안정성을 연구하기 위한 간단한 방법론을 설명합니다. 이러한 방법들은 더 안전한 프로테아좀 분해에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.또한 이는 다양한 세포 과정에서 조절된 단백질 분해의 역할에 관한 연구와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 본 시연에서는 NCOA hamana가 사용됩니다. 이 식물은 재배가 쉽고, 아그로박테리움(agrobacterium)에 매우 민감하며, 접종이 용이한 큰 잎을 가지고 있습니다.장일 조건과 40~65% 상대 습도의 환경 제어 조건 하에, promix B가 담긴 화분에서 식물을 4~6주 동안 재배합니다. 제조업체의 지침에 따라 시판 제품을 사용하여 식물에 가끔 시비합니다. 식물이 충분히 성장하면 크기가 50 millimeters by 70 millimeters 이상인 잎을 선택합니다.아그로박테리움 접종을 위해, 테스트 단백질을 발현하는 바이너리 컨스트럭트를 보유한 Agrobacterium 균주를 적절한 항생제가 첨가된 YEP 배지에서 28 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 세포를 원심 분리한 후, 침투 완충액(infiltration buffer)으로 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.5가 되도록 재현탁하고 상온에서 2시간 동안 배양합니다. 1 mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 배양액을 잎의 AAL 측에 침투시킵니다. 침투 후, 동일한 광조건 하에서 식물을 72시간 동안 재배합니다. 수확 4시간 전에, 아그로박테리움이 접종된 잎 부위에 10 µM 억제제 또는 mock을 침투시킵니다.잎을 각각의 용매로 처리하고, 일반적으로 생체중 200~400 mg인 잎의 접종 부위를 수확하여 액체 질소에서 미세한 분말로 분쇄합니다. 그다음 분쇄된 조직을 500 µL의 분해 버퍼에 넣어 총 단백질 추출물을 준비합니다. 단백질 분해 반응을 수행하기 위해 12,000 ×g에서 5분 동안 두 번 연속으로 원심분리하여 추출물을 정제합니다.추출물을 보통 20 µL씩 동일한 부피로 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 이를 상온에서 시간을 달리하여 배양합니다. 일반적으로 시점 0분과 5, 10, 15, 20, 30분 시점이 사용됩니다. SDS 겔 샘플 버퍼를 넣고 가열하여 반응을 중단시킨 후, 웨스턴 블로팅으로 분석합니다.먼저 Bradford 법을 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 레인당 50 to 80 µg의 총 단백질을 로딩하여 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 단백질 시료를 분리합니다. 로딩 컨트롤을 위해 모든 시료가 동일하게 로딩되었는지 확인하십시오. 약 50 kDa의 상대적 전기영동 이동도를 가진 주요 밴드로 이동하는 추정 rubis large chains와 같은 보편적 단백질 종의 강도를 비교하십시오.표준 프로토콜에 따라 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전기 전이시킨 후, 상온에서 1시간 동안 TBST 내 5% skim milk로 막을 블로킹합니다. 다음으로, 제조사에서 권장하는 농도로 TBST 내 1% Skim milk에 1차 항-에피토프 항체를 희석합니다. 블로킹된 막을 해당 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 또는 4 °C에서 완만하게 흔들어주며 하룻밤 동안 반응시킵니다.그 다음, 멤브레인을 20 milliliters의 TBST로 15분 동안 한 번 헹구고, 이어서 실온에서 완만한 교반과 함께 5분 동안 두 번 더 헹굽니다. 다음으로, 제조사의 권장 사항에 따라 horse radish peroxidase가 접합된 2차 항체를 TBST 내 1% Skim milk로 희석합니다. TBST로 다시 한번 헹군 후, 2차 항체를 멤브레인과 함께 실온에서 완만한 교반 하에 1시간 동안 반응시킵니다. horse radish peroxidase를 이용해 표적 단백질을 시각화하며, 식물 방어 관련 단백질의 불안정화를 보여주는 대표적인 실험 결과입니다.SCF 경로를 통한 VBF box 단백질에 의한 Veep one의 분해가 N hamana에서 입증되었습니다. 웨스턴 블롯 분석 결과, Veep one의 양은 VBF와 공동 발현되었을 때 상당히 감소하였으나, VBF 공동 발현이 없을 때는 상대적으로 안정적으로 유지되었습니다. VBF에 의한 Veep one 불안정화의 프로테아좀 분해 메커니즘은 프로테아좀 억제제인 MG 1 32에 의해 억제되는 점을 통해 추론되었습니다.이러한 결과에 대한 정량 분석 결과, VBF에 의해 V one이 거의 완전히 억제되었으며, 이는 MG 1 32에 의해 사실상 차단되었음이 입증되었습니다. MG 1 32 존재 하에 V one 수치가 약간 더 높게 나타난 것은 내인성 VBF 상동체(homolog) 활성의 억제로 인해 설명될 가능성이 가장 높습니다. 이 영상을 시청한 후에는 초기 프로테아좀 경로에 의한 단백질 분해를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.동일한 실험 설계는 다른 모든 유기체에도 적용될 수 있으며, 다양한 세포 과정에서 조절된 단백질 분해의 역할과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

생활 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

이 비디오에서는 프로테아좀 억제제를 사용하여 프로테아좀 활성을 차단하여 형광 표지에 융합된 잘못 접힌 돌연변이 단백질이 유비퀴틴 의존성 프로테아솜 분해를 겪어 세포 세포질 내에 축적되는 것을 방지하는 세포 기반 단백질 응집 분석을 시연합니다. 그런 다음 단백질 응집체를 시각화하고 형광 현미경으로 정량화합니다.

Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기에 제시된 인포프로테오믹 접근법, 즉 아라비도시스 인포프로테오움의 높은 처리량과 깊은 커버리지를 제공하는 추출 팁 기반인 인포프로테오믹을 이동합니다. 이 접근은 아라비도시스에서 삼투압 신호의 개요를 설명합니다.

애기독증에서 삼투압 신호 프로파일링을 위한 인포프로테오믹 전략

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

배우세요 식물 세포 없는 시스템에서 단백질 분해를 분석하는 방법을. Nicotiana benthamiana 잎을 이용하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 단백질 안정성을 평가하고, 유비퀴틴-프로테아좀 경로의 역할을 규명합니다.

식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

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