Name: 신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 재조합 바이오틴 단백질의 설계, 발현 및 분리 방법을 세균 숙주 세포에서 수행하는 기술입니다. 친화성 크로마토그래피를 활용하여 고순도 단백질을 정제하고 다양한 생물학적 응용에 활용할 수 있습니다.

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저자는이 작업을 지원하는 자금 애 크런 대학을 인정하고 싶습니다.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

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재조합 단백질 공학은 여러 분야에 걸쳐있는 매우 강력한 기술이다. 이것은 맞춤 설계 단백질의 높은 수율의 생산을 허용하고 경제적 동조하고 비교적 간단한 절차이다. 이는 설계 및 표적 단백질을 발현하는 것은 항상 간단 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다. 기초 표현 및 재조합 단백질의 안정성은 벡터, E.의 특정 선택에 따라 달라집니다 대장균 세포주, 펩타이드 태그 추가 및 재배 매개 변수입니다. 우리의 특정 설계 기준은 잘 확립 E.을 활용 대장균은 단백질 공학에 대한 균주. 또한, 플라스미드 벡터는 T7의 lac 프로모터와 안정 재조합 단백질 발현에 대한 암피실린 내성 유전자가 포함되어 있습니다. 고순도 서브 클로닝 된 플라스미드를 얻은 후, 최초의 주요 절차가 성공적으로 숙주 세포에 표적 단백질을 변형 및 용해도를 결정하는 것이다단백질. 시험 ...

단백질은 궁극적으로 적절한 조직 형성과 조직에 이르는 많은 생물학적 기능에 대한 책임은 생체 분자의 넓은 범위를 커버. 이 분자는 인체 내에서 평형을 유지, 규제 업 및 / 또는 아래로 조절 유전자와 다른 단백질의 제어 신호 전달 경로의 수천을 시작합니다. 하나의 단백질의 중단은 치명적인 장애 또는 질병의 발병으로 이어질 수있는 신호의이 웹 전체에 영향을 미칩니다. 실험실에서 각각의 단백질을 설계하는 것은 이러한 부작용을 퇴치하기위한 하나의 솔루션을 제공하고 작은 분자 약물에 대한 대안을 제공합니다. 1977 년 14 아미노산 소마토스타틴 서열을 코딩하는 유전자가 E.을 사용하여 만든 제 설계 폴리펩티드 중 하나였다 대장균 1. 곧 1979 년, 인슐린, 플라스미드 나 pBR322에 복제 변형, 표현, 2 정제 하였다. 그 이후로, 재조합 단백질은 입술의 여러 필드에 자신의 영향력을 확대earch 등 생체 적합 물질, 약물 전달, 조직 공학, 바이오 의약품, 농업, 산업 효소, 바이오 연료 등 (리뷰를 참조에게 3-8 참조). 이 기술을 포함한 목적 주문형 화학 잔기 또는 단백질 서열의 첨가를 통해 제공하고 있지만, 표적 단백질 식별, 안정화 및 정제에 한정하지 않는 것이 범용성 크게 때문이다. 재조합 DNA 기술을 통해, 재조합 단백질은 포유 동물, 식물, 곤충, 효모, 균류 또는 박테리아 등의 진핵 및 원핵 숙주 다양한 시스템에서 발현 될 수있다. 각 호스트는 서로 다른 장점을 제공하며, 일반적으로 가장 좋은 시스템은 단백질 기능, 수율, 안정성, 전반적인 비용 및 확장 성을 기준으로 결정됩니다. 박테리아 세포는 종종 진핵 호스트 (즉, 당화, 디설파이드 브리지, E에게 제공하는 번역 후 변형 메커니즘을 결여<html> TC.) 5. 그러나 이러한 호스트는 일반적으로 더 많은 비용과 시간이 많이 구를 수 있으며 결과적으로, 포유 동물 및 곤충 시스템은 보통 진핵 단백질의 더 나은 호환성 및 식 초래한다. 따라서, E. 세포가 저렴 성장 조건에서 급속하게 확장하고 유전자 발현 메커니즘이 잘 5,9 이해하고 있기 때문에 대장균은 우리의 발현 시스템에 대한 선호 호스트입니다. 또한,이 시스템은 번역 후 변형 (10)의 부족에도 불구하고 생산의 목적과 기능 단백질의 결과에 대한 최대 크기를 조절하기 쉽다. E. 이 변형이 높은 변환 효율에 따라 우수한 플라스미드 수율을 제공하기 때문에 대장균 K12 균주 복제에 대해이 프로토콜에서 선택된다. 또한, E. 이 호스트의 변형을 제어 단백질 발현과 안정성 11를 제공하는 T7의 RNA 중합 효소 유전자를 포함하고 있기 때문에 대장균 BL21 균주 발현에 이용된다. 십t &quot;&gt; 호스트를 선택하면, 추가 치료는 재조합 단백질을 합성하는 박테리오파지 T7의 전사 및 번역 신호의 지시에 따라 복제 된 대상의 DNA 시퀀스를 시작합니다. 선택 및 조절 단백질 발현을 촉진하는 최적의 발현 벡터를 선택하는 촬영되어야합니다 식 T7의 RNA 중합 효소 유전자 12 염색체 사본을 포함하는 숙주 세포에서 유도된다. 플라스미드 벡터 인 pBR322에서 파생 된이 벡터는 (검토를 위해 참조 13 참조), 단단히 처음 Studier 및 동료 (14)에 의해 개발 된 T7 프로모터에 의해 제어 및 추가를 제공하고 있습니다 락 오퍼레이터와의 lac 리프레 서 (lac1)의 포함을 통해 제어 15,16. 재조합 단백질 공학의 경우,이 발현 계는 상이한 타겟 DNA 서열을 삽입하여 목적 단백질의 특정 아미노산 서열을 짓기 위해 또는 융합 단백질을 생성하는 기능을 구비 결합 도메인으로 구성하나의 단백질에서의. 또한, 일부 벡터 시리즈는 N 또는 C 말단에 배치되는 펩타이드 태그 수정이 (가) 있습니다. 우리의 설계 목적을 위해, 히스티딘 (그의) 태그는 정제 DNA 표적 서열에 첨가하고, 15의 아미노산 서열은 바이오 티 닐화 biotinylatable 17,18 위해 포함되었다. 이 프로토콜에서 암피실린 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를, 우리 biotinylatable 융합 단백질 서열을 운반하도록 선택되었다. 표정은 T7의 lac 프로모터를 통해이 벡터 제어되어 쉽게 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)로 유도된다. 시험 식 (소량 배양) 정제 과정을 공식화하거나 수용성 또는 불용성 인 형태로 표현 될 수있는 표적 단백질의 존재 및 용해도를 결정하기 위해 사용된다. 박테리아 세포 내에서 발현 수용성 단백질의 기본 구조 (19)를 유지하기 위해 자연 폴딩을 받게 될 것이다. 일반적으로 기본구조는 열역학적으로 바람직하다. 많은 경우에 숙주의 대사 활동은 불용성 단백질 생산 및 불용성 단백질 응집체 이루어지는 봉입체의 형성에 이르게 시스템에 응력을 배치, 표적 단백질에 공헌하지 않다. 따라서 표적 단백질은 일반적으로 20 생물학적 비활성들을 렌더링 변성. 두 시험 식은 업 스케일링하고, 분리 과정은 표적 단백질의 용해도에 의해 결정된다. 추가 탈 변성 또는 단계 폴딩은 불용성 단백질이 필요합니다. 얻어진 재조합 단백질을 더욱 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다. 집에서 재조합 단백질 생산을 목적 단백질의 밀리그램의 주요 문화 리터당 고립 될 수 있기 때문에 상용 제품을 통해 비용 이점을 제공합니다. 필요한 장비의 대부분은 일반적인 생물 또는 화학 실험실에서 사용할 수 있습니다. 단백질 공학은 생성 가능항상 상업적으로 사용할 수없는 추가 기능과 사용자 지정 융합 단백질. 1 공학 재조합 단백질과 관련된 주요 절차를 묘사 그림. 이 식 시스템을 통해 우리는 인터페론 - 감마, 혈소판 유래 성장 인자 및 뼈 형태 형성 단백질 21 ~ 23 많은 biotinylatable 단백질을 생성했다, 그러나 우리는 우리가 축삭지도, NGF (29 kDa의를 위해 디자인이 단백질에 초점을 맞출 것이다 ) 및 Sema3A (91 kDa의) 10 (검토) 24을 참조를 참조하십시오. 바이오 티 닐화 식별, 고정 및 잘 알려진 비오틴 - 스트렙 타비 딘의 상호 작용을 이용하여 25 ~ 27라는 단백질의 분리에 대한 일반적인 기술입니다. 생물 물리학 프로브 (28, 29)은 30 바이오 센서, 양자 도트 (31)는 10 -15 M (27)의 순서에 K d의 비오틴 - 스트렙 타비 딘 활용의 높은 선호도를 활용 시스템의 몇 가지 예입니다. E. 대장균 바이오주석 리가, 피라는, 비오틴에서 발견 라이신 사이드 체인에 비오틴의 공유 결합에 에이즈 순서 18,32 태그. 재료 및 생체 분자에 테 더링 비오틴은 여러 조직 공학 응용 프로그램 21,33-35에 대한 세포에 성장 인자의 지속적인 전달을 생산하고있다. 따라서 이러한 맞춤 설계 biotinylatable 단백질을 설계하는 것은 여러 연구 분야를 초월 할 수있는 강력한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hydroxyethylmercaptan &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicillin 나트륨 염&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9518</td><td>25g</td></tr><tr><td>소포제 204</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6426</td><td>500g</td></tr><tr><td>바스타-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &마이크로; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) 유능 세포</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1ml; 발현 호스트</td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>젤 여과 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 바이알</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>구아니딘 하이드로 디오라이드 amioformamidine hydrochloride</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA 수지</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>염산</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>이미다졸&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Broth&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1kg</td></tr><tr><td>NovaBlue 역량 세포</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1ml; 클로닝 호스트</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10</td></tr>팩 <tr><td>염화칼</td>륨 <td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 &마이크로; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1kg</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산나트륨 디아염기성</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500g</td></tr><tr><td>Terrific Broth</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5kg</td></tr><tr><td>테트라사이클린 염산염</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25g</td></tr><tr><td>트리스/글리신/SDS 완충액, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1kg</td></tr><tr><td>트립톤, 췌장</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>효모 추출물, 과립</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &오믈; KTApurifier10</td><td>GE 헬스케어</td><td>28-4062-64</td><td>키트 및 액세서리 포함</td></tr><tr><td>벤치탑 오비탈 쉐이커</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>효소는 반응 완충액과 비오틴 용액이 함께 제공됩니다</td></tr><tr>.<td>투석 Casette</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>투석 튜빙</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25,000 및 50,000</td></tr><tr><td>유량 전환 밸브 FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter 비오틴 정량 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 튜브 랙, 랙 C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기 Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>키트 및 액세서리</td></tr><tr><td>포함 가열/냉장 순환기&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>모델 1156D</td></tr><tr><td>가열 오븐 FD 시리즈</td><td>바인더</td><td></td><td>모델 FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>중단--교체 제품: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>포함 1L 폴리포르필렌 병</td></tr><tr><td>JS 5.3 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 시리즈 클린 벤치</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-gel vertical 전기영동 시스템</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Any kDa, 15-well comb</td></tr><tr><td>Ni-NTA 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; 볼륨 ECONO-Column</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>라운드 바닥 폴리프로필렌 공중합체 튜브</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; JA 25.50 로터</td></tr>용 <tr><td>튜브 Spin-X UF Concentrators</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 및 6 ml; MWCO: 10,000 Da</td></tr><tr><td>서브클로닝 서비스</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>단백질 서비스</td></tr><tr><td>초음파 프로세서&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>모델 CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>모델 G560</td></tr></tbody></table>

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

재조합 단백질 공학은 대장균에게 (대장균) 식으로 거의 4 수십 년 동안 시스템, 오늘을 활용했다 E. 대장균은 여전히 가장 널리 사용되는 숙주이다. 시스템의 유연성은 (스트렙 트 아비딘 상호 작용을위한) 비오틴 태그와 같은 잔기 및 녹색 형광 단백질 또는 체리 적색 단백질과 같은보다 큰 단백질의 기능성 또한 허용한다. 또한, 번역 후 변형을 부여하는 금속 이온의 킬레이트 고유 반응성 작용기, 분광 프로브, 분자와 같은 부 자연스러운 아미노산의 통합은 단백질의 특성과 기능을 더 잘 조작을 가능하게했다. 따라서이 기술은 연구의 다양한 분야에 대한 중요한 유틸리티를 제공하는 사용자 정의 융합 단백질을 생성합니다. 보다 구체적으로, biotinylatable 단백질 서열 때문에 아비딘 및 스트렙 타비 딘과 비오틴 사이의 높은 친 화성 상호 작용의 다양한 표적 단백질에 통합 된. 이 추가 태그 단백질의 검출 및 정제를 강화뿐만 아니라 세포의 정렬과 같은 보조 응용 프로그램을위한 길을 열어 주었있다. 따라서, 비오틴 표지 분자는 바이오 산업 및 생명 의학 분야에서 증가하고 광범위한 영향을 보여줍니다. 우리의 연구의 목적을 위해 우리는 신경 성장 인자 (NGF) 및 semaphorin3A (Sema3A) 기능 영역을 포함하는 비 오티 닐화 재조합 융합 단백질을 설계했다. 우리는 이러한 비오틴 융합 단백질은 다른 활성 단백질 서열과 함께, 조직 공학 및 재생을 위해 생체 적합 물질에 닿는 할 수있는 방법을 이전에보고했다. 이 프로토콜은 T7의 락의 유도 성 벡터와 E를 활용하여, 밀리그램 규모 엔지니어링 biotinylatable 단백질의 기본 사항을 설명합니다 변환하는 스케일 업 (scale-up) 및 정화부터 대장균 발현 호스트.

<html> 복제 및 테스트 식 도금이 정상적으로 수행 될 때, 하나의 고립 된 콜로니를 형질 전환 박테리아 클론 세포 (도 2A)를 버릴 가능성을 증가시키기 위해 형성한다. 너무 많은 세포를 도금하는 경우에는, 플레이트는 37 ° C의 또는 변환에 너무 오래 배양 식민지는 한천 플레이트를 덮거나 세포의 큰 집계 (그림 2B 및 2C)를 형성 할 수있다, 의문이다. 테스트 식 중, NGF와 Sema3A 먼저 37 ° C에서 4 시간 동안 유도 SDS-PAGE 분석은 두 단백질이 가용성 분획 (그림 2D)에 위치하고 있었다 결정되었다. 단백질 발현은 공정하고, 따라서 18 ° C에서 하룻밤 유도와 다른 테스트 식을 조사 하였다 보였다. Sema3A (그림 2E)과 눈에 띄는 차이는 없었다 반면 NGF...

biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 프로브, 센서, 약물 전달 및 조직 공학 등 다양한 응용 분야에 통합될 수 있는 재조합 비오틴화 단백질을 성공적으로 설계, 발현 및 분리하는 것입니다. 이는 먼저 소규모 배양을 통해 맞춤 설계된 플라스미드를 박테리아 호스트 세포주에 형질전환시킨 후, 표적 단백질의 발현을 유도함으로써 달성됩니다. 다음으로, 적절한 정제 절차를 수립하기 위해 표적 단백질의 존재 여부와 용해도를 결정합니다.그 다음, 표적 단백질의 수득량을 높이기 위해 공정 규모를 확대하며, 이렇게 얻은 단백질은 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리합니다. 마지막으로, 단백질을 정제한 후 하위 응용 및 분석을 위해 농축합니다. 최종적으로 SDS page 및 FPLC 결과를 통해 재조합 단백질이 성공적으로 분리 및 정제되었음을 검증하며, 해당 단백질의 기능성을 추가로 테스트합니다.재조합 단백질 공학의 주요 장점은 우리의 정확한 과학적 사양을 충족하도록 맞춤 설계된 단백질을 대량 또는 밀리그램 단위로 생성할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 이러한 단백질의 일부에 새로운 기능을 추가하여 새로운 특성을 부여할 수 있습니다. 오늘은 특정 단백질의 끝단에 비오틴을 표지하는 방법을 보여드릴 것이며, 이를 통해 단백질을 표면에 특이적으로 고정하거나 결합시켜 신경 돌기 성장 또는 신경 분화와 같은 세포 기능을 유도하는 방법을 다룰 것입니다.이 기술이 처음인 사람이라도 천연 또는 비천연 단백질 분리 절차를 따르면 큰 어려움 없이 수행할 수 있습니다. 많은 단계가 동일하지만, 천연 또는 비천연 조건에 맞게 조제된 특정 완충액이 필요합니다. 초기 단계에서 세부 사항에 각별히 주의하십시오.형질전환 및 테스트 발현 단계는 이후 최종 스케일업 과정에서 높은 단백질 수율을 보장합니다. 이 방법의 시각적 시연은 단순한 실험실 장비와 소모품을 사용하여 어떻게 재조합 단백질을 제조할 수 있는지 보여주므로 중요합니다. 단순 회분식 반응을 활용하여, 균등화 및 성장 배지를 리더 스케일로 배양함으로써 메인 배양당 10 mg의 단백질을 생산합니다.또한, 크로마토그래피 기술을 사용하여 단백질이 후속 응용 단계-를 위해 어떻게 추가로 정제되는지 보여줄 수 있습니다. 오늘 Alicia 대학원생이 그 절차를 시연하겠습니다. 표적 단백질의 클로닝 및 발현 테스트를 거쳐 20 mL 배양액을 하룻밤 동안 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 하룻밤 배양한 배양액을 ampicillin이 포함된 1.8 L의 멸균 성장 배지에 붓고 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균 anti foam 2 0 4를 6~8방울 첨가합니다. 배양액을 37 °C 항온 수조에 넣고 0.2 µm 필터를 통해 압축 공기를 에어레이션 스톤으로 공급합니다. 배양액의 OD 600이 0.7~0.8에 도달하면 1 mM IPTG를 첨가하여, 테스트 발현 시 단백질이 수용성 또는 불용성 분획에서 발견되었는지에 따라 37 °C에서 4시간 동안 또는 18 °C에서 하룻밤 동안 유도합니다.세포를 수집하기 위해 배양액을 1L 원심분리 병에 옮기고, 4°C에서 14,000 ×g로 15분간 원심분리합니다. 상층액을 따라내고 얇은 스패튤라를 사용하여 박테리아 펠릿을 두 개의 50mL 튜브에 옮겨 담습니다. 펠릿을 -80°C에 보관하기 전, 다시 몇 분간 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.비천연 단백질 분리를 수행하기 위해, 불용성 단백질이 포함된 각 냉동 E. coli 펠렛에 20 milliliters의 용해 및 세척 버퍼를 첨가하고, 큰 덩어리가 없도록 볼텍스 및 쉐이킹하여 재현탁시킵니다.mutator에서 하룻밤 동안 배양한 후, 용액은 점성이 있는 슬러리 형태로 나타납니다. 해당 슬러리를 20,500 ×g의 중력 가속도와 상온 조건에서 30분 동안 원심분리합니다. 천연 단백질 분리를 위해 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다.펠렛을 lysis buffer에 가해 최종 부피가 30 milliliters가 되도록 재현탁하고, 재현탁한 펠렛을 얼음에 둡니다. 초음파 파쇄기를 진폭 30%로 설정하고 30초 작동 후 30초 휴지하는 펄스 방식으로 5분 동안 처리합니다. 초음파 처리 중에 튜브를 위아래로 가볍게 흔들어 세포 펠렛을 완전히 분쇄합니다.슬러리를 20,500 ×g, 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다. 비천연 분리 단백질에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행하려면, 각 원심분리 튜브에 1 mL의 니켈 NTA 레진 용액을 넣고 상온의 교반기 또는 쉐이커에서 최소 1시간 동안 배양합니다.슬러리를 친화성 컬럼에 붓고, 용액이 스톱콕 밸브를 통해 폐액 비커로 완전히 떨어지도록 둡니다. 잔류 레진을 제거하기 위해 원심분리 튜브에 세척 버퍼 10 milliliters를 넣고, 용액이 모두 떨어진 후 해당 용액을 컬럼에 추가합니다. 유리 막대를 사용하여 레진을 저어준 뒤, 다음 세척액을 추가하기 전에 용액이 모두 떨어질 때까지 기다립니다.다음으로, 10 mL의 세척 완충액을 사용하여 원심분리 튜브를 다시 헹구고 이를 컬럼으로 옮깁니다. 그런 다음, 회당 10 mL의 용해 세척 완충액으로 컬럼을 8회 더 세척합니다. 세척이 완료되면 스톱콕을 잠그고 폐액 비커를 50 mL 원심분리 튜브로 교체합니다.컬럼에 15 milliliters의 용출 버퍼를 가하고 수지를 교반한 후 용액을 5분 동안 방치합니다. 그다음 스톱콕을 열어 EIT를 수집하고, 천연 단백질을 정제하기 위해 15 milliliters의 용출 버퍼를 추가로 사용하여 동일한 과정을 반복합니다. 단백질 용액에 니켈 NTA 수지를 첨가한 후, 4 °C의 셰이커에서 최소 1시간 동안 배양합니다.세척 버퍼로 컬럼을 10회 세척한 후, 용출 버퍼 5 mL를 첨가하고 레진을 5분 동안 배양합니다. 이후 새 튜브를 사용하여 컬럼에서 EIT가 떨어지는 동안 대부분의 EIT를 수집하며, 투명한 96웰 플레이트의 각 웰에 Bradford 시약 90 µL를 첨가합니다. 버퍼로 5 mL씩 용출할 때마다, 솔루션 10 µL가 컬럼에서 Bradford 시약 90 µL가 들어 있는 웰로 떨어지게 합니다. 단백질이 더 이상 검출되지 않을 때까지 EEU를 계속 진행하여 투석 또는 Rena를 수행합니다.각 EIT 단백질을 투석 튜브로 옮기고 적절한 완충액으로 투석합니다. 처음 4시간 동안 4°C에서 투석한 후 해당 완충액으로 교체합니다. 두 번째 투석은 4°C에서 하룻밤 동안 진행합니다. 스핀 농축기를 사용하여 투석된 단백질을 5 mL 미만으로 농축하며, 필요한 경우 ATIN 8을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제합니다.텍스트 프로토콜의 테스트 발현 과정에 따라, 먼저 37°C에서 4시간 동안 NGF와 SE MA 3A를 유도하였으며, SDS-PAGE 분석을 통해 두 단백질 모두 이 가용성 분획에 위치함을 확인하였습니다. 단백질 발현 수준이 적절한 것으로 보여, 18°C에서 하룻밤 동안 유도하는 또 다른 테스트 발현을 검토하였습니다. 그 결과, 가용성 분획에서 NGF의 발현은 개선되었으나, SEMA 3에서는 눈에 띄는 차이가 없었습니다.NGF를 native 및 non-native 조건에서 분리하여 정제를 위해 FPLC 컬럼에 통과시켰습니다. 테스트 발현 과정에서 NGF가 가용성 분획(soluble fraction)에 존재했음에도 불구하고, native 분리법으로는 37°C와 18°C 유도 조건 모두에서 수율이 낮았습니다. 반면, 재변성(renaturation)을 포함한 non-native 분리법을 통해 더 높은 NGF 수율을 얻을 수 있었습니다.그 결과, NGF는 비천연 상태 조건에서 분리되었습니다. 18 °C에서 하룻밤 동안 유도한 후 비천연 분리를 수행한 결과, SEMA 3A가 생성되지 않았으며, 천연 분리를 이용한 2 L 주 배양당 생성량은 8.61 ± 3.1 mg이었습니다. 따라서 SEMA 3A를 37 °C에서 4시간 동안 유도하고 천연 분리 파라미터를 사용하여 분리하였습니다.FPLC 피크를 수집하고 NGF 및 SEMA three A 샘플을 SDS page로 분석하였습니다. SEMA three A의 FPLC 결과에서 발견된 추가 단백질 피크들을 수집하여 SDS page로 분석한 결과, SEMA three a의 분자량 영역에 위치하지 않았습니다. 이 분획들은 SEMA three와 달리 세포 기반 분석에서 기능적 활성을 나타내지 않았으므로, 분해 산물일 가능성이 매우 높습니다.여기에 표시된 피크입니다. 재조합 단백질이 확립되고 숙달되면, 적절하게 수행할 경우 분리 및 정제는 며칠밖에 걸리지 않습니다. 하지만 단백질 용해도를 정확하게 확인하기 위해 초기 박테리아 형질전환 및 테스트 발현 단계에는 더 많은 시간이 소요됩니다.용해도가 결정되면, 형질전환된 박테리아 라이브러리를 -80°C에 보관할 수 있습니다. 또한, 단백질 발현 후 E. coli 펠릿 역시 추가적인 분리 및 실험 전까지 -80°C에 보관이 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 프로테아제에 의해 단백질이 변성되거나 분해되는 것을 방지하기 위해 버퍼를 멸균하고 신선하게 제조하는 것이 중요합니다.분리 버퍼는 4~6주마다 제조 및 멸균해야 하며, 투석 버퍼는 분리 전날에 제조해야 합니다. 여러 가지 비오틴화 단백질로 인한 교차 오염을 방지하기 위해 N-I-N-T-A 및 FPLC 컬럼은 제조사의 프로토콜에 따라 세척되어 있어야 합니다. 이 영상을 시청하고 나면 박테리아 숙주 발현 시스템을 사용하여 맞춤 설계된 비오틴화 단백질을 발현, 분리 및 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이는 소규모 및 대규모의 과학적, 상업적 수행 방식과 유사하므로 활용 범위가 매우 넓습니다.

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

이 비디오는 성상교세포 배양에서 세포 표면 및 세포 내 단백질의 분리를 보여줍니다. 성상세포 배양액을 얼음 위에 올려 세포내이입(endocytosis)을 억제한 다음 세포 표면 단백질을 비오틴화(biotinylation) 시약으로 표지합니다. 세포는 비오틴화된 세포 표면 단백질과 비오틴화된 세포 내 단백질을 방출하기 위해 용해됩니다. 마지막으로, 스트렙타비딘으로 코팅된 비드를 사용하여 세포 내 단백질에서 비오틴화된 세포 표면 단백질을 분리합니다.

Isolation of Cell-Surface and Intracellular Proteins from an Astrocyte Culture

신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

BDNF, 신경 영양 인자의 축삭 수송은 여러 신경 인구의 생존과 기능을 위해 중요하다. 일부 퇴행성 질환은 축삭 구조와 기능의 장애로 표시됩니다. 우리는 차 신경 세포를 사용하여 미세 유체 챔버에서 QD-BDNF의 라이브 인신 매매를 검사하는 데 사용되는 기술을 보여 주었다.

양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

혈장 막에서 발현 된 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 결정하기 위해 고안된 두 가지의 바이오 티 닐화 기반 방법이이 보고서에 제시되어있다.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

여기에 제시된 프로토콜은 체외 신경 내피 공동 배양 시스템과 sialoglycan의 대사 통합을 생체 장태 작용기와 결합하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포를 확장하고 그들의 표면에 레이블을 붙이는 프로토콜입니다 세포 표면 마커의 화상 진찰 또는 질량 분광분석을 위한 sialoglycoproteins.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 비용 효율적인 방식으로 생산되며 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. BDNFavi는 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니화된다. BDNFavi 및 모노 바이오타이니드 BDNFavi는 시판되는 BDNF와 비교하여 생물학적 활성을 유지합니다.

뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

배우세요 재조합 바이오틴 단백질의 설계, 발현 및 분리 방법을 세균 숙주 세포에서 수행하는 기술입니다. 친화성 크로마토그래피를 활용하여 고순도 단백질을 정제하고 다양한 생물학적 응용에 활용할 수 있습니다.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

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