신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

이 절차의 전반적인 목표는 프로브, 센서, 약물 전달 및 조직 공학과 같은 다양한 응용 분야에 통합할 수 있는 재조합 비오틴화 단백질을 성공적으로 설계, 발현 및 분리하는 것입니다. 이는 먼저 소규모 배양을 사용하여 맞춤형으로 설계된 플라스미드를 박테리아 숙주 세포주로 형질전환한 다음 표적 단백질의 발현을 유도함으로써 달성됩니다. 다음으로, 적절한 정제 절차를 공식화하기 위해 표적 단백질의 존재 및 용해도를 측정합니다.

그런 다음 표적 단백질의 더 큰 수율을 생산하기 위해 절차를 확장한 다음 친화성 크로마토그래피 기술을 사용하여 분리합니다. 마지막으로, 단백질은 정제된 다음 다운스트림 응용 분야 및 분석을 위해 농축됩니다. 궁극적으로 SDS 페이지 및 FPLC 결과는 재조합 단백질이 성공적으로 분리 및 정제되었으며 단백질의 기능성에 대한 추가 테스트를 거쳤음을 확인합니다.

재조합 단백질 기술설계의 주요 이점은 저희가 우리의 정확한 과학적인 명세에 응하기 위하여 주문 설계한 단백질의 대규모 또는 밀리그램 가늠자 양을 창조하는 것을 허용합니다 입니다. 예를 들어, 이러한 단백질의 일부에 새로운 기능을 추가하여 새로운 특성을 가능하게 할 수 있습니다. 오늘은 특정 단백질의 말단에 비오틴을 비오틴하는 방법을 보여드리고, 이를 사용하여 이러한 단백질을 표면에 특이적으로 고정시키거나 묶어 신경 세포 성장 또는 신경 세포 분화와 같은 세포 기능을 안내합니다.

이 기술을 처음 접하는 개인은 비변성 또는 비천연 단백질 분리 절차를 따를 때 큰 어려움이 없어야 합니다. 많은 단계가 동일하지만 네이티브 또는 비네이티브 조건에 대해 공식화된 특정 버퍼가 필요합니다. 처음에는 세부 사항에 세심한 주의를 기울입니다.

형질전환 및 테스트 발현 단계는 이후 최종 스케일 업 공정에서 높은 단백질 수율을 보장합니다. 이 방법의 시각적 시연은 간단한 실험실 장비 및 소모품을 사용하여 재조합 단백질을 만드는 방법을 보여주기 때문에 중요합니다. 간단한 배치 반응을 활용하여 e equalize 및 성장 배지는 리더 규모로 성장하여 주요 배양액당 10mg의 단백질을 생산합니다.

또한 크로마토그래피 기술을 사용하여 다운스트림 응용 프로그램을 위해 단백질을 추가로 정제하는 방법을 보여주고 시연할 수 있습니다.오늘 대학원 Cinema Lab인 Alicia는 관심 대상 단백질에서 발현을 위한 클로닝 및 테스트 후 하룻밤 사이에 20ml 배양을 성장시키는 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 암피실린이 함유된 1.8리터의 멸균 성장 배지에 하룻밤 배양을 붓고 페이스트르 피펫을 사용하여 0.2 미크론 필터를 통해 섭씨 37도의 수조에 6-8방울의 멸균 안티 폼 2 0 4 장소 배양물을 추가하고 폭기석을 통해 배양물에 압축 공기를 거품을 일으킵니다. 배양액이 1밀리몰 IPTG에서 0.7 내지 0.8의 OD 600에 도달하고 섭씨 37도에서 4시간 동안 또는 섭씨 18도에서 하룻밤 동안 유도하는 경우, 단백질이 시험 발현에서 용해성 또는 불용성 분획물에서 발견되었는지 여부에 따라 결정된다.

세포를 모으고, 1개 리터 분리기 병으로 배양물을 옮기고, 14의, 000배 중력 및 4 섭씨 온도에 15 분 동안 그것을 아래로 회전시키는 실험. 슈퍼 나틴을 붓고 얇은 주걱을 사용하여 박테리아 펠릿을 두 개의 50ml 튜브에 퍼냅니다. 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 몇 분 동안 원심분리로 세포를 다시 펠릿

비네이티브 단백질을 수행합니다. 각 냉동 대장균 펠릿에 대한 불용성 단백질에 대한 분리. 20ml의 용해, 세척 버퍼, 와류를 넣고 흔들어 다시 현탁시켜 큰 덩어리를 제거합니다.

하룻밤 동안 돌연변이체에서 배양한 후 용액은 점성이 있는 슬러리 원심분리기처럼 보일 것입니다. 20, 500배 중력 및 실온에서 30분 동안 슬러리. 상층액을 새 튜브로 옮기고 천연 단백질 분리를 위해 펠릿을 폐기합니다.

Resus는 재부유 펠릿을 얼음 위에 놓고 최종 부피 30ml에서 용해 완충액에 펠릿을 현탁시킵니다. 30 초 동안 30 초 동안 펄스를 켜고 30 초 동안 초음파 처리하여 30 % 진폭으로 설정하고 5 분 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 중에 튜브를 위아래로 흔들어 세포 펠릿을 완전히 분해합니다.

슬러리를 20, 500배 중력 및 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 비천연(non-native) 분리 단백질에서 친화성 크로마토그래피를 수행하려면 각 원심분리 튜브에 1ml의 니켈 NTA 수지 용액을 추가하고 실온에서 최소 1시간 동안 돌연변이체 또는 셰이커에서 배양합니다.

슬러리를 친화력 컬럼에 붓고 용액이 스톱 콕 밸브를 통해 폐기물 비커로 완전히 떨어지도록 합니다. 원심분리 튜브에 10ml의 세척 버퍼를 추가하여 잔류 수지를 제거하고 용액이 흘러내린 후 컬럼에 용액을 추가합니다. 유리 교반 막대를 사용하여 수지를 저어주고 다른 세척을 추가하기 전에 물이 떨어지는 것을 마칠 때까지 기다립니다.

다음으로, 10ml의 세척 버퍼를 사용하여 원심분리기 튜브의 헹굼을 반복하고 컬럼으로 옮깁니다. 그런 다음 세척할 때마다 10ml의 lysis 세척 버퍼로 컬럼을 8회 더 세척합니다. 세척이 완료되면 스톱 콕을 닫고 폐기물 비커를 50ml 원심분리기 튜브로 교체하십시오.

컬럼에 15ml의 엘루시안 완충액을 추가하고 수지를 저어주며 용액을 5분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 스톱 콕을 열고 EIT를 수집한 후 추가로 15ml의 용리 완충액을 사용하여 네이티브 단백질을 정제합니다. 단백질 용액에 니켈 NTA 수지를 첨가한 후, 적어도 1시간 동안 섭씨 4도의 돌연변이체에서 배양했습니다.

세척 버퍼를 사용하여 컬럼을 10회 세척한 후 5ml의 용리 버퍼를 추가하고 수지를 5분 동안 배양한 후 EIT가 컬럼에서 떨어지는 동안 새 튜브를 사용하여 대부분의 EIT를 수집하고, 투명한 96웰 플레이트에 웰당 90마이크로리터의 Bradford 시약을 추가합니다. 완충액이 있는 각 5밀리리터 엘루시안 후에 10마이크로리터의 용액이 컬럼에서 90마이크로리터의 브래드포드 시약이 들어 있는 웰로 떨어지도록 합니다. 단백질이 더 이상 투석할 수 없거나 Rena가 감지되지 않을 때까지 EEU를 계속합니다.

단백질은 각 EIT를 투석 튜브로 옮기고 적절한 완충액을 투석하며, 각 완충액으로 대체하기 전에 섭씨 4도에서 4시간 동안 투석합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 두 번. 스핀 농축기를 사용하여 투석된 단백질을 5ml 미만으로 농축하고 원하는 경우 아틴 8로 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제합니다.

테스트 발현 중 텍스트 프로토콜에 따르면, NGF 및 SE 3 A는 먼저 섭씨 37도에서 4 시간 동안 유도되었으며 SDS 페이지 분석은 두 단백질이이 용해성 분획에 위치하는 것을 확인했습니다. 단백질 발현은 공정한 것으로 보였으므로 섭씨 18도에서 야간 유도를 사용한 또 다른 테스트 발현을 검사했습니다. 용해성 분획에서는 NGF 발현이 개선된 반면, SEMA 3에서는 눈에 띄는 차이가 없었습니다.

NGF는 네이티브 및 비네이티브 조건에서 분리되었으며 정제를 위해 FPLC 컬럼을 통과했습니다. NGF는 테스트 발현 중에 용해성 분획에 있었지만 네이티브 분리는 섭씨 37도 및 섭씨 18도 유도 모두에서 낮은 수율을 생성했습니다. 그러나, 재 성숙을 통한 비 네이티브 분리를 통해 더 높은 수율의 NGF를 얻었다.

그 결과, NGF는 비토착 조건에서 분리되었습니다. 섭씨 18도에서 하룻밤 동안 유도한 후, 비네이티브 격리는 네이티브 격리를 위해 2리터의 주요 배양액당 8.61 플러스 마이너스 3.1 밀리그램으로 SEMA 3 생산을 초래하지 않았습니다. 따라서 SEMA 3A는 섭씨 37도에서 4시간 동안 유도되고 기본 절연 매개변수를 사용하여 분리되었습니다.

FPLC 피크를 수집하고 NGF 및 SEMA 3 개의 A 샘플을 SDS 페이지로 분석했습니다. SEMA 3 A에 대한 FPLC 출력에서 발견 된 추가 단백질 피크는 SDS 페이지로 수집 및 분석되었으며 SEMA 3 분자량 영역에 위치하지 않았습니다. 이러한 분획은 SEMA three와 같이 세포 기반 분석에서 기능적으로 작용하지 않았기 때문에 분해 산물일 가능성이 가장 높습니다.

여기에 표시된 피크. 재조합 단백질을 확립하고 숙달한 후에는 적절하게 수행할 경우 분리 및 정제가 며칠 밖에 걸리지 않습니다. 그러나 초기 박테리아 형질전환 및 테스트 발현 단계는 단백질 용해도를 적절하게 식별하기 위해 더 오랜 시간이 걸립니다.

용해도가 결정되면 형질전환된 박테리아의 라이브러리를 마이너스 80에 저장할 수 있습니다. 또한, 단백질 발현 후, 대장균 펠릿은 추가 분리 및 실험이 있을 때까지 마이너스 80에도 저장될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 프로테아제가 변성하여 단백질을 분해하는 것을 방지하기 위해 완충액을 멸균하고 새로 만드는 것이 중요합니다.

격리 완충액은 4주에서 6주마다 만들고 멸균해야 하며, 투석 완충액은 격리 전날에 만들어야 합니다. N-I-N-T-A 및 FPLC 컬럼은 여러 비오틴화 단백질로 인한 교차 오염을 방지하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 세척해야 합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 박테리아 숙주 발현 시스템을 사용하여 맞춤형으로 설계된 비오틴화 단백질을 발현, 분리 및 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이것은 소규모와 대규모로 과학적으로나 상업적으로 수행되는 것과 유사합니다. 따라서 이것은 광범위하게 적용됩니다.