개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 쥐의 뇌 절편에서 신경 전구 유사분열의 이미징 및 분석을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 배아에서 뇌를 해부함으로써 이루어진다. 두 번째 단계는 비브라토로 뇌 절편을 준비하는 것입니다.

다음으로, 뇌 절편의 실시간 이미징이 수행됩니다. 마지막 단계는 영화에서 정보를 추출하여 관심 있는 유사분열 파라미터를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 타임랩스 현미경은 뇌의 전구 개체군이 어떻게 분열하는지 실시간으로 보여주는 데 사용됩니다.

고정 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 뇌 절편에서 신경 전구 분열의 시간적 역학에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있다는 것입니다. 또한 유전적 섭동이 신경 전구 세포 분열에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 피질 발달을 이해하기 위해 이 방법을 사용하지만, 우리가 설명한 분석은 다른 뇌 영역이나 뇌 외부에 있는 줄기세포의 유사분열 연구에 적용될 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Louis y입니다. 마우스 배아를 채취하여 이 절차를 시작하고 뒷뇌와 두 개의 대뇌 반구가 있는 네 개의 뇌를 포함한 배아 뇌를 해부합니다. 얼음 양동이에 얼음에 임베딩 몰드를 위한 구멍을 만듭니다.

다음으로 플라스틱 틀에 3%aros 매체를 붓고 해당 틀을 얼음 구멍에 넣습니다. 온도가 섭씨 35도에 도달할 때까지 디지털 온도계 끝으로 aros 매체를 저어줍니다. 그런 다음 뇌와 뇌 사이의 계면에서 과도한 HBSS를 제거하기 위해 뇌를 포매 매체로 즉시 전달합니다.

임베딩 용액에서 뇌를 조심스럽고 부드럽게 반복적으로 회전시킵니다. 집게를 사용하면 얼음과 접촉하는 곰팡이 바닥에 젤 화 된 아로 쿠션이 형성됩니다. 뇌를 휘젓는 동안 집게 끝으로 쿠션을 느낄 수 있게 되면 등쪽이 위로 향하게 뇌의 위치를 잡으면 뇌가 곰팡이의 맨 바닥으로 가라앉지 않아야 합니다.

면도날로 곰팡이 모서리를 자르기 전에 최소 5분 동안 얼음에서 아로스를 굳히십시오. 뇌 주위에 aros 블록을 조심스럽게 새기고 내장된 뇌가 교란되지 않도록 절단 횟수를 최소화하십시오. VT 1000 s Viome을 사용하면 200-250 미크론 슬라이스를 생성할 수 있습니다.

이제 세포 11을 성장 인자와 12 웰 플레이트가 보충 된 슬라이스 배양 배지에서 0.5 대 1 마이크로 몰의 최종 농도로 희석하고, 각 웰의 염색 용액 2.5 밀리리터에 한 뇌의 슬라이스를 섭씨 37 도에서 1 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 염색 용액 없이 2.5ml의 슬라이스 배양 배지에 슬라이스를 20분 동안 세척합니다. 뇌 단면을 장착하려면 35mm 유리 바닥 마이크로웰 접시 바닥에 콜라겐 용액 한 방울을 떨어뜨립니다.

슬라이스의 크기에 맞게 피펫 팁으로 펴 바릅니다. 그런 다음 한 조각을 콜라겐 한 방울로 옮깁니다. 슬라이스를 실온에서 10분 동안 배양한 후 이산화탄소 5%가 함유된 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮깁니다.

20분 후 총 1.2ml의 슬라이스 배양 배지를 유리 바닥 마이크로에 넣고 한 번에 600마이크로리터의 배지를 잘 접시에 담고 피펫 팁으로 펴 바릅니다. 이산화탄소 5%와 함께 섭씨 37도에서 최소 1시간 30분 동안 인큐베이터에서 슬라이스를 회복한 후 동일한 조건으로 스피닝 디스크 컨포칼 현미경의 인큐베이션 챔버로 옮깁니다. 라이브 이미징의 경우 작동 거리가 300미크론이고 개구수가 1.3인 60 x 실리콘 오일 대물렌즈를 사용합니다.

세포 이미징 이미지의 경우, 30미크론 Z 스택의 세포는 슬라이스 표면에서 약 40미크론 아래에 위치한 Z 스택의 중심과 함께 배치됩니다. 필요한 경우 레이저 출력과 노출 시간을 조정하여 광표백을 제한하고 cyto 11 신호의 강도에 따라 30에서 200밀리초 범위의 노출 시간을 사용합니다. 다음은 이미지 J의 유사분열 수치를 식별하기 위해 이 분석을 통해 얻을 수 있는 대표적인 데이터입니다.한 위치에 대한 데이터 세트를 하이퍼 스택으로 연 후 조직과 세포가 건강해 보이는 Z 평면을 하나 선택합니다.

시간을 거슬러 스크롤하여 세포가 유사분열에 들어가는 시점을 식별합니다. 셀은 Z 평면을 가로질러 이동할 수 있지만 앞에서 설명한 시간 해상도와 Zack 매개변수는 이 프로세스를 가능하게 하도록 최적화되었습니다. 스프레드시트에서 하이퍼 스택에 있는 셀이 유사분열로 들어갈 때 세포의 4개 D 좌표를 기록합니다.

이러한 좌표를 알면 동일한 셀을 여러 번 계산하는 것을 방지할 수 있습니다. 시간을 앞으로 스크롤하여 세포가 한 단계에서 다른 단계로 진행되는 시간을 기록합니다. 주어진 세포가 세포의 3D 재구성을 수행하고 중기 동안 회전을 정량화하기 위해 각 유사분열 단계의 지속 시간을 문서화합니다.

여러 개의 유사분열 세포가 식별된 후 세포의 좌표를 사용하고 처음부터 시간을 거슬러 스크롤합니다. 중상은 심실 경계가 더 평면이 되도록 전체 하이퍼 스택을 회전합니다. 각도 도구를 사용하여 이 회전에 적용할 각도를 결정합니다.

관심 있는 셀이 해당 평면에서 가장 잘 보이는 Z 평면을 식별합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 전체 셀을 포함하는 선택 영역을 그립니다. 그런 다음 관심 셀이 포함된 Z 평면을 식별하고 이미지 복제 명령을 사용하여 하위 스택을 만듭니다.

대화 상자에서 중복 하이퍼 스택이 슬라이스를 선택한 상태로 둡니다. Z 매개변수는 전체 셀을 포함한 Z 평면에 해당하고 프레임 T 매개변수는 현재 시점에 해당합니다. 그런 다음 세포의 3D 재구성을 생성합니다.

현재 시점에서. 슬라이스 간격은 각 Z 평면 이미지 사이의 간격(미크론)에 해당합니다. 스크롤 막대를 사용하여 metaphase 플레이트의 가장자리가 보이도록 결과 3D 재구성을 회전합니다.

프레임의 번호는 베타 각도에 해당합니다. 이 번호를 기록하십시오. 그런 다음 수평과 정렬 사이의 각도를 측정합니다.

중상판을 수직으로 해부하는 단계. 이것은 각도 알파 레코드입니다. 관심 세포의 모든 metaphase time point에 대한 이러한 각도.

시간 점 t와 t - 1 사이의 회전 각도는 t에서의 각도와 T에서의 이 각도에서 등쪽 복부 축을 따라 1을 뺀 값의 절대값과 같습니다. 유사분열은 R GC의 기저 과정이 더 짧아 viome에 의해 절단될 가능성이 적기 때문에 뇌 절편의 등쪽 영역에서 가장 쉽게 이미지화됩니다. ROS 코들 축을 따라 등쪽 피질의 코들 영역에 있는 절편이 가장 일관된 결과를 제공합니다.

이는 이미징에 좋은 영역과 나쁜 영역의 예입니다. 좋은 지역에서. 핵은 타원형 모양이며 나쁜 영역에서 타임 랩스 이미징 전에 심실 경계에서 많은 유사 분열 세포가 관찰되며, 심실 경계에서 극소수의 유사 분열 세포가 관찰되며 핵은 둥글습니다.

다음은 라이브 이미징 전에 저배율 현미경으로 관찰된 양호한 슬라이스의 예이며, 다음은 여러 유사분열 단계에서 cyto 11 표지된 세포의 몇 가지 예입니다. 여기에 표시된 것은 두 개의 신경 전구 세포가 다른 색상으로 표시된 유사 분열의 다른 단계를 거치는 심실 경계에있는 영역의 몽타주입니다.이 절차에 따라. DNA 구조체의 중성 전기천공법과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 분열의 운명은 무엇이며 세포 골격은 어떻게 행동하는지 등의 추가 질문에 답할 수 있습니다.

또한 유사분열을 따르기 위해 H 2 VGFP 형질전환 마우스와 같은 CY 11 이상의 2차 방법을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 브레인 슬라이스를 조작하는 방법, 가장 적합한 일치하는 매개 변수 및 데이터를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.