개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 생쥐 뇌 절편에서 신경 전구세포 분열의 이미징 및 분석을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 배아에서 뇌를 적출함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 진동 절편기(vibratome)를 사용하여 뇌 절편을 준비하는 것입니다.

다음으로, 뇌 절편의 라이브 이미징을 수행합니다. 마지막 단계는 동영상에서 정보를 추출하여 관심 있는 유사분열 파라미터를 분석하는 것입니다. 최종적으로, 타임랩스 현미경을 사용하여 뇌의 전구세포 집단이 실시간으로 어떻게 분열하는지 보여줍니다.

고정 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 살아있는 뇌 절편 내에서 신경 전구세포 분열의 시간적 역동성에 대한 상당한 통찰을 얻을 수 있다는 점입니다. 또한 유전적 섭동이 신경 전구세포 분열에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데에도 사용할 수 있습니다. 우리는 피질 발달을 이해하기 위해 이 방법을 사용하지만, 설명한 분석법은 다른 뇌 영역이나 심지어 뇌 외부의 줄기세포 체세포 분열 연구에도 적용될 수 있습니다.

이 절차는 저희 연구실의 박사후 연구원인 Louis y가 시연하겠습니다. 먼저 마우스 배아를 수집하고, 후뇌와 두 개의 대뇌 반구를 포함한 네 개의 뇌 부위를 포함하여 배아 뇌를 절개해내는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 얼음 바구니의 얼음에 구멍을 내어 임베딩 몰드를 놓을 자리를 만듭니다.

다음으로, 3% aros 배지를 플라스틱 몰드에 붓고 해당 몰드를 얼음 속 구멍에 배치합니다. 온도가 35 °C에 도달할 때까지 디지털 온도계 끝으로 aros 배지를 젓습니다. 그 후, 뇌와 aros 사이의 계면에 남아 있는 과잉 HBSS를 제거하기 위해 뇌를 임베딩 배지로 신속하게 옮깁니다.

매몰 용액 속에서 뇌를 조심스럽고 부드럽게 반복적으로 회전시킵니다. 핀셋을 사용하면 얼음과 접촉하는 몰드 바닥에 젤 형태의 aros 쿠션이 형성됩니다. 뇌를 저으면서 핀셋 끝으로 쿠션이 느껴지면, 뇌의 등쪽(dorsal side)이 위로 오도록 배치합니다. 이때 뇌가 몰드의 맨 바닥까지 가라앉지 않도록 주의해야 합니다.

면도날로 몰드의 모서리를 자르기 전, 최소 5분 동안 얼음 속에서 aros를 경화시킵니다. 뇌 주변으로 aros 블록을 조심스럽게 깎아내며, 매립된 뇌에 가해지는 자극을 최소화하기 위해 절단 횟수를 최대한 줄이도록 합니다. VT 1000 s Viome을 사용하여 200 내지 250 micron 두께의 슬라이스를 제작합니다.

이제 cyto 11을 성장 인자가 보충된 슬라이스 배양 배지에서 최종 농도 0.5~1 µM이 되도록 희석합니다. 12-웰 플레이트의 각 웰에 2.5 mL의 염색 용액을 넣고, 뇌 한 개에서 얻은 슬라이스를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후 염색 용액이 없는 슬라이스 배양 배지 2.5 mL로 슬라이스를 20분 동안 세척합니다. 뇌 절편을 마운팅하려면 35 mm 유리 바닥 마이크로웰 디시 바닥에 콜라겐 용액 한 방울을 떨어뜨립니다.

피펫 팁을 사용하여 슬라이스 크기에 맞게 펴줍니다. 그런 다음 슬라이스를 콜라겐 방울 속으로 옮깁니다. 슬라이스를 실온에서 10분 동안 배양한 후, 5% carbon dioxide가 포함된 37 °C 인큐베이터로 옮깁니다.

글라스 바텀 마이크로웰 디쉬에 총 1.2 mL의 슬라이스 배양 배지를 넣은 후, 600 µL씩 배지를 나누어 넣으며 피펫 팁으로 넓게 펴줍니다. 슬라이스를 37 °C, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 최소 1시간 30분 동안 회복시킨 다음, 동일한 조건의 스피닝 디스크 공초점 현미경 배양 챔버로 옮깁니다. 라이브 이미징의 경우, 작동 거리 300 µm, 개구수 1.3의 60x 실리콘 오일 대물렌즈를 사용합니다.

세포 이미징의 경우, 슬라이스 표면에서 약 40 µm 아래에 Z 스택의 중심을 두고 30 µm Z 스택으로 세포를 촬영합니다. 필요한 경우, 광퇴색을 제한하기 위해 레이저 출력과 노출 시간을 조정하며, cyto 11 신호의 강도에 따라 30에서 200 ms 범위의 노출 시간을 사용합니다. 다음은 Image J에서 유사분열상을 식별하기 위해 이 분석을 통해 얻을 수 있는 대표 데이터입니다. 한 위치의 데이터셋을 하이퍼 스택(hyper stack)으로 연 후, 조직과 세포가 건강하게 보이는 Z 평면 하나를 선택합니다.

시간을 거슬러 올라가 세포가 유사분열에 진입하는 시점을 확인합니다. 세포가 Z 평면을 가로질러 이동할 수 있으나, 앞서 설명한 시간 분해능과 Zack 파라미터가 이 과정을 가능하게 하도록 최적화되었습니다. 하이퍼 스택(hyper stack) 내에서 세포가 유사분열에 진입할 때의 4차원 좌표를 스프레드시트에 기록합니다.

이 좌표들을 알고 있으면 동일한 세포를 여러 번 계수하는 것을 방지할 수 있습니다. 시간을 앞으로 스크롤하며 세포가 한 단계에서 다음 단계로 진행되는 시간을 기록하십시오. 특정 세포의 각 유사분열 단계 지속 시간을 기록하여 세포의 3D 재구성과 중기 동안의 회전 정량 분석을 수행합니다.

여러 개의 체세포 분열 세포를 확인한 후, 세포의 좌표를 사용하여 시간축을 앞쪽으로 스크롤하여 중기(Metaphase)의 시작 부분까지 이동하십시오. 뇌실 경계가 평면이 되도록 하이퍼스택(hyper stack) 전체를 회전시키십시오. 각도 도구를 사용하여 이 회전에 적용할 각도를 결정하십시오.

관심 세포가 가장 잘 보이는 Z 평면을 확인합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 세포 전체가 포함되도록 영역을 지정합니다. 그 다음 관심 세포가 포함된 Z 평면들을 확인하고, 이미지 복제(duplicate) 명령을 사용하여 서브 스택(sub stack)을 생성합니다.

대화 상자에서 duplicate hyper stack과 slices 항목을 선택된 상태로 둡니다. Z 파라미터는 전체 세포를 포함한 Z 평면(Z planes)에 해당하며, T 파라미터는 현재 시점에 해당합니다. 그 후, 세포의 3D 재구성 이미지를 생성합니다.

현재 시점입니다. 슬라이스 간격은 각 Z 평면 이미지 사이의 거리를 µm 단위로 나타낸 것입니다. 스크롤 바를 사용하여 생성된 3D 재구성 이미지를 회전시켜 중기판의 가장자리가 보이게 하십시오.

프레임 번호는 베타 각도에 해당합니다. 이 번호를 기록하십시오. 그런 다음 수평선과 정렬 바(align bys) 사이의 각도를 측정하십시오.

중기판을 수직으로 절단합니다. 이것은 각도 alpha 기록입니다. 분석 대상 세포의 모든 중기 시점에 대한 각도들입니다.

시점 t와 t-1 사이의 회전각은 등-복측(dorsal ventral) 축을 따라 t 시점의 각도와 t-1 시점의 각도 차이의 절대값과 같습니다. RGC의 기저 돌기가 더 짧아 절편 제작 시 절단될 가능성이 낮으므로, 뇌 절편의 등측 영역에서 유사분열을 가장 쉽게 촬영할 수 있습니다. ROS coddle 축을 따라 등측 피질의 coddle 영역 절편이 가장 일관된 결과를 제공합니다.

다음은 이미징에 적합한 영역과 부적합한 영역의 예시입니다. 적합한 영역에서는 핵이 타원형이며, 타임랩스 이미징 전 뇌실 경계에서 많은 수의 유사분열 세포가 관찰됩니다. 부적합한 영역에서는 뇌실 경계에서 유사분열 세포가 거의 관찰되지 않으며 핵이 둥근 형태를 띱니다.

실시간 이미징 전 저배율 현미경으로 관찰한 양호한 절편의 예시이며, 여기는 유사분열의 서로 다른 단계에 있는 cyto 11 표지 세포들의 예시입니다. 본 절차에 따라, 뇌실 경계 영역에서 두 개의 신경 전구세포가 서로 다른 색으로 표시된 유사분열의 각 단계를 거치는 모습을 몽타주로 나타내었습니다. 분열하는 세포의 운명은 무엇이며 세포골격은 어떻게 거동하는지를 포함하여, 추가적인 질문에 답하기 위해 DNA 구조물의 신경 전기천공법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

세포분열을 추적하기 위해서는 CY 11 외에도 H2B-VGFP 형질전환 마우스와 같은 보조 방법을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 영상을 시청하고 나면 뇌 절편을 조작하는 방법, 최적의 매칭 파라미터, 그리고 데이터를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.