Name: 휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 소포체 내 전사 및 번역 기계 캡슐화를 통한 세포 모방체 구축 방법을. 이 기술은 합성생물학 및 무세포 시스템 연구에 활용됩니다.

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저자는 Armenise ​​하버드 재단, 마리 퀴리 트렌 티노 COFUND (ACS), 트 렌토 (Ecomm)의 자치 지방과 자금 CIBIO을 인정합니다.

1. DNA 템플릿을 준비 <ol><li> E.의 표준 실험실 균주에서 플라스미드 정제 같은 E. 등의 대장균, 대장균 DH5a 또는 상용 키트와 함께 노바 블루. 또한, 선형 PCR 제품은 유사 상용 키트로 정제 할 수있다. 단지 H 2 O와 DNA를 용출. </li><li> 페놀 - 클로로포름은 DNA 솔루션에게 26의 압축을 풉니 다. </li><li> UV 흡광도 또는 다른 적당한 방법으로 예를 들어 DNA 농도 및 순도를 결정합니다. 그것은 전사 번역 효율을 위해 고순도의 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 얇은 지질막을 준비 <ol><li> 건조한 지질 분말 무게를 용매에 용해. 1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-3-포스 포 콜린 (POPC)의 주식 솔루션은 40 mg / ml의 농도로 클로로포름에 준비가되어 있습니다. 주 : 유기 용제는 항상 유리 피펫 및 병 처리해야합니다. 즉, 플라스틱을 사용해서는 안됩니다. 스토어의바람직 아르곤 하에서 -20 ° C에서 밀폐, 용매 저항 호박색 유리 병에 똑딱 솔루션. </li><li> 5 ML 둥근 바닥 플라스크에 나누어지는 12 μmol의 POPC (40 MG / ML 주식 솔루션의 220 μL). </li><li> 얇은 지질막을 생성하는 회전 증발기 (그림 1) 용매를 증발. <ol><li> 안전하게 원형 클립 증류 관에 둥근 바닥 플라스크를 연결하고 플라스크의 회전을 시작합니다. </li><li> 콘덴서 코일을 통해 물의 순환을 시작합니다. 클로로포름 61.2의 낮은 비등점 ° C 대기압에서을 가지고 있기 때문에 열 목욕을 사용하여 필요하지 않습니다. </li><li> 시스템이 마개가 열려 있는지 확인하여 대기로 열려 있는지 확인합니다. 진공 펌프의 전원을 켜고 천천히 시스템에 진공을 적용 꼭지를 닫습니다. </li><li> 얇은 지질 필름은 불투명 필름을 형성하는 회전 증발하는 동안 둥근 바닥 플라스크의 벽에 증착그 눈으로 볼 수 있습니다. 회전 증발 0.5-2 시간 동안 계속하자. 프로세스를 중지하려면, 천천히, 진공 압력을 해제 회전을 중지하고 둥근 바닥 플라스크를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 3. 지질 부유 및 소포 균질화 <ol><li> 직접 둥근 바닥 플라스크에 얇은 지질막에 1 ML 18.2 MΩ H 2 O를 추가합니다. 최대 속도 적극적으로 소용돌이 솔루션, 약 3,200 rpm으로, 지질 영화는 눈으로 관찰되는 유리에서 분리 될 때까지. </li><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브에 지방 분산을 전송합니다. </li><li> 셋업 링 5 개 mm 팁 균질화를 개최하라. 안전하게 지방 분산을 보유하는 균질 아래의 microcentrifuge 스탠드를 놓습니다. 18.2 MΩ H 2 O의 끝을 담그고 몇 초 동안 실행하여 균질의 분산 요소를 씻어. </li><li> 일을 보장 지질 분산에 직접 분산 요소를 배치끝에서 microcentrifuge 관의 바닥에 접촉하지 않습니다. 전력 레벨 4 이상 14,000 rpm에서 1 분간 균질화. </li></ol> 4. 소포 압출 및 동결 건조 <ol><li> 외부 케이싱으로 구성되어 미니 압출기 (그림 2), 두 개의 테플론 내부 막 지원, 두 개의 O-링, 하나의 테프론 베어링을 전시 리테이너 너트의 부품을 조립. <ol><li> 내부 막 지지대 홈에 두 개의 O-링을 놓습니다. Prewet 2 개의 필터 한 400 nm의 막. 필터는 그들 사이의 막으로 O-링의 안쪽에 테플론에 배치됩니다. </li><li> 막 O-링 사이에 두 개의 필터로 둘러싸인 막 압출기 외부 케이스에 지원 놓습니다. 케이스 내부에 테프론 베어링을 배치하고 고정 너트를 부착하고 손으로 조입니다. </li></ol></li><li> 두 주사기를 씻어 18.2 MΩ 물을 채운다. 작은 시간에 주사기 바늘을 삽입압출기 어셈블리의 양쪽 끝에 테프론 oles. 바늘은 쉽게 미끄러 져한다 바늘을 강요하지 않습니다. 압출기 하우징과 착용에 주사기와 압출기를 고정합니다. </li><li> 천천히 한 주사기의 출력 및 기타에 물을 밀어 압출기를 통해 물을 전달합니다. 이것은 하나의 흐름을 나타냅니다. 현재의 누출이없는 것을 보장 세 구절의 총 반복합니다. 물이 주사기를 제거하고 물을 폐기하십시오. </li><li> 샘플 하나의 주사기를 작성하여 압출기에 연결하고 위의 단계 4.3에서 설명한대로 천천히 세포막을 통해 소포 솔루션을 전달합니다. 11 구절의 총 배 반복합니다. 압출 공정의 진행으로, 샘플은 덜 혼탁하고 막을 가로 질러 밀어 쉽게 될 것입니다. 저항의 급격한 감소는, 그러나, 일반적으로 막의 파열을 나타냅니다. </li><li> 압출 소포 솔루션을 전송하고의 microcentrifuge 튜브에 소포의 40 μL 분주합니다.플래시 드라이 아이스하거나 또는 액체 질소에 각각 나누어지는을 동결. </li><li> 30에서 하룻밤 원심 증발기 ° C. 각 나누어지는 냉동 건조 -20 ℃에서 동결 건조 된 빈 소포를 저장 </li></ol> 5. 전사 - 번역 기계 캡슐 <ol><li> 전사 - 번역 반응의 구성 요소를 믹스의 RNase 억제제의 20 단위를 추가합니다. 얼음에 품어. </li><li> DNA 템플릿을 추가합니다. 제어 반응, 250 플라스미드 인코딩 mVenus의 NG 또는 T7 전사 프로모터 뒤에 비슷한 형광 단백질과 강한 E. 대장균 리보솜 결합 부위가 권장됩니다. </li><li> RNase가없는 물과 최종 부피 25 μL를 가져옵니다. </li><li> 단계 5.3에서 조립 반응 10 μL와 동결 건조 된 소포의 수화물 나누어지는 (단계 4.6). 간단히 소용돌이는 혼합물은 소포가 재현 탁 할 때까지. 이 미만 30 초를 취해야한다. </li><li> 3 얼음에 반응을 품다0 분 소포가 팽창 할 수 있도록합니다. </li><li> 50 MM 트리스 - 염산, 50 mM의 NaCl을, 산도 7.4의 27.0 μL 20.2 밀리그램 / ML proteinase를 K. DNase의와 RNA 분해 효소 1.5 μL로 소포의 1.5 μl를 추가하여 30 μL의 최종 볼륨 20 배 소포 혼합물을 희석 단백질 분해 효소 K에 대한 대안 extravesicular 자료를 저하로이 단계에서 추가 할 수 있습니다. </li><li> 37 적어도 2.5 시간 동안 품어 ° C. </li></ol> 6. 현미경 사용 <ol><li> 서로 다른 시간 지점에서 소포와 형광 단백질 생산의 진행 상황을 검사합니다. 소포는 400 nm의 소포 압출에 사용되는 분리막의 기공 크기보다 큰 직경을해야합니다. <ol><li> 표준 현미경 슬라이드에 20 X 5mm 실리콘 스페이서를 배치하여 샘플 챔버를 준비합니다. 샘플 챔버에 소포의 피펫 10 μL. 챔버에 실리콘 처리 된 유리 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 63X 오일 분산 O로 소포를 관찰악용 형광 단백질에 대한 적절한 필터 세트를 사용하여 시야 및 형광 현미경에 의한 연구와 유사한 목적. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

무 세포 합성 생물학은 아직 초기 단계에 있지만, 진보는 점점 더 복잡 해지는 세포와 같은 시스템을 만들 수있는 토대를 마련했다. 소포 28의 완전히 정의 구성 요소 9 내부에서 전사 번역 기계의 재구성은 환경에 반응하는 인공 cells17, 18 건설의 뒷부분에 노력을 촉진 특히 중요했습니다. 마찬가지로, 인공 세포 연구는 진화 과정에게 4,29,30을 검사하는 데 사용되었습니다, 기계적인 RNA의 내용과 단백질 합성 22,31, 신진 대사 load32, 33의 영향, 그리고 바이러스 입자 (34)의 조립. 중요한 것은 충분한 지식은 이제 기본적인 세포 기능이 이전 보고서와 문서에 설명 된 프로토콜에 따라 실험실에서 소포 내부 재구성 할 수 존재합니다. , 설명 캡슐화 홍보 쉽다고에 추가ocedure 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 많은 빈, 동결 건조 소포 분주은 사전에 할 수 있으며, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. 프로토콜은 유기 용제, 급격한 온도 변화, 또는 투석 오랜 기간에 적용되지 생물학적 분자 않습니다. 우리는 필요에 따라 절차의​​ 상냥함 추가 구성 요소의 결합을 촉진 할 것으로 기대합니다. 우리는 또한 캡슐 또는 전사 변환 효율 막 지질 성분의 변화에​​ 악영향을 관찰하지 않았습니다. 따라서, 막 단백질, 특정 형태학, 또는 시각화의 설립에 더 순종 지질 생각할 악용 될 수 있습니다. 설명 방법의 주요 한계는 결과 소포가 크기 또는 lamellarity에서 동질하지 않은 것입니다. 많은 애플리케이션의 경우, 이러한 어려움은 데이터의 해석을 방해하지 않습니다. 그러나 필요한 경우 추가 단계가 좁은 일에 통합 할 수 있습니다전자 크기 분포 및 캡슐화 후 같은 압출의 추가 라운드로 세포막의 층을, 감소는, 동결 해동, 또는 투석 35. 이들과 다른 문제를 회피 의심 할 여지없이 더 나은 방법이 개발 될 것이다. 그때까지 우리는 프로토콜이 아니라 세포의 모방의 건설에 적합하도록 여기에서 설명하는 찾을 수 있습니다.

셀 무료, 체외에서 전사 번역 반응과 합성 지질의 소포의 생성은 새로운 아무것도 없습니다. 그러나 모방 세포에 두 가지를 결합하는 challenging1-6 훨씬 더있다. E.는 T7 RNA 중합 효소의 유무에 관계없이 대장균 세포 추출물은 전사 번역 기계 7,8의 소스로 사용할 수 있습니다. 단백질 발현 및 폴딩을 촉진 할 수있는 추가 세포 구성 요소의 존재에서 세포 추출물 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 개별적으로 정제 된 RNA와 단백질 분자의 혼합은, PURE 시스템 9 즉 intravesicular 단백질 합성에게 4,10-14을 중재하는 데 사용할 수 있습니다. PURE 시스템은 완전히 정의 세포 모방의 건설을 허용하고 세포 추출물에서 발견되는 핵산 활동에서 고통을하지 않습니다. 실제로, 이것은 그로 인하여 낮은 캡슐화 효율을 11로 프로세스를 용이 훨씬 적은 DNA 템플릿이 필요하다는 것을 의미합니다 </sup&gt;. 자주 사용하지만, 휴대 모방은 진핵 cells15에서 파생 된 세포 추출물로 구축 할 수 있습니다. 지금까지 환경을 감지 유전자 코드 캡슐화 폭포 및 세포 모방은 16-18보고되었습니다. 전사 - 번역 반응을 모니터링하는 간단한 방법은 유전자 인코딩 된 요소의 형광 또는 발광을 측정하는 것입니다. 체외에서 반응이 자주 방사선 물질에 의해 측정하고 있지만 일반적으로, 반딧불 루시 페라 제 19 또는 GFP가 사용됩니다. 형광 감지 추가하여 생물학적 같은 과정의 확률 적 특성에 몇 가지 통찰력을 제공하고, 세포 계측법 기반 방법을 통해 소포 20,21의 인구를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 모니터링 방법은 I과 호환되는 형광 단백질의 컬렉션을 포함 설계 규칙의 작은 세트와있는에서 빌드하는 부품의 라이브러리를 정의하는 데 사용되었습니다N 시험관 전사 번역 22 식 22 유전자 조직의 영향, 시그마 요인 16의 활동과 전사 터미네이터 (23)의 효율성이다. 그럼에도 불구하고, 많은 체외에서 예측 건물의 기능, 유전자 인코딩 장치를 높이기 위해 수행해야하는 남아있다. 소포를 만들기 위해 사용할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다. 가장 일반적인 방법은 수성 solution24에있는 부유 뒤에 유리 표면에 얇은 지질막의 생성에 따라 다릅니다. 수용액 전사 번역 기계가 포함되어있는 경우, 예를 들어, 다음 소포의 일부를 형성 단백질 생산에 필요한 구성 요소가 포함됩니다. 그러나, 이러한 방법의 캡슐화 효율은 소포의 단지 작은 비율이 활성화되어 있다는 것을 의미 낮다. 다른 방법의 대부분은 매우 높은 캡슐화 EFF의 특징iciency는 소포를 물에 기름 에멀젼 방울의 변환을 악용. 이 같은 방법은 미래에 일반화 될 가능성이 있지만, 현재 이러한 방법은 전문 장비의 필요성 고통 변경된 막 조성에 25 소포를 제공합니다. 소포 메소드에 물에있는 기름의 독특한 장점은 막 lamellarity을 제어 할 가능성이있다. 여기에 설명 된 방법은 추가 균질화 단계를 포함하여 약간의 수정과 함께 사방 연구소 (11)에 의해 설명 된 얇은 지질막 프로토콜을 기반으로합니다. 이 방법은 쉽고 싸고, 잘 전사 번역 기계 캡슐에 적합한 강력한 소포를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>퀵 스핀 미니 준비 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>NanoDrop 1000</td><td>NDB767ND</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>770557</td><td>MW 760 g/mol 전이 온도 -2 > C CAS# 26853-31-6</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>459836</td><td>무수, >99.5%</td></tr><tr><td>페놀-콜로포름-이소아밀 알코올 25:24:1, 분자 생물학용</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803-100mL</td><td>10mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>생명공학 등급 Fluka</td><td>496189-1L</td><td>안정제로 0.5-1.0% v/v의 에탄올 함유</td></tr><tr><td>갈색 호박색 유리병</td><td>VWR</td><td>89043-518</td><td>55X 48mm</td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td><td>Z563846EU-1EA</td><td>잭 및 수조 포함, 29/32 조인트 240V</td></tr><tr><td>아날로그 와류 믹서</td><td>VWR</td><td>945300</td><td>속도 1,000-3,200rpm</td></tr><tr><td>균질화기</td><td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td><td>3420000</td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>압출기 필터</td><td>Whatman</td><td>610014</td><td>드레인 디스크 10 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>압출기 폴리카보네이트 멤브레인 400 nm</td><td>Whatman</td><td>61007</td><td>핵포어 폴리카보네이트&nbsp;</td></tr><tr><td>스피드 진공</td><td>Labconco</td><td>7970011</td><td>Centritrap DNA 농축기</td></tr><tr><td>PURExpress kit</td><td>New England Biolabs</td><td>NRM #E6800S</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (20.2 mg/ml)</td><td>Fermentas</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Observer Z1with AxioCam MRm 카메라</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RealTime</td><td>CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Biorad)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 프레스를 밀봉&nbsp; &nbsp;-Molecular Probe</td><td>Life Technologies</td><td>P18174</td><td>저항성&nbsp; -25-30 &deg; C</td></tr><tr><td>실리콘화 유리 원형 커버 슬라이드</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>&nbsp; &nbsp; 직경 = 22mm</td></tr><tr><td>이미지J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

개별 분자에서 분자 시스템에 관심을 교대로, 실험실의 증가는 더 나은 세포의 삶의 복잡성을 나타내는 세포 모방 아래에서 위로 빌드 모색하고있다. 물에 기름 에멀젼, 마이크로 유체 장치 및 소포의 착취 등 구획화 된 세포의 모방을 구축하기 위해 수행 할 수있는 경로의 수, 거기 주기적합니다. 사용할 수있는 각 옵션에 특정 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, 물에서 기름 유화액 높은 캡슐화 효율을 제공하지만, 잘 살아있는 세포의 투과성 장벽을 모방하지 않습니다. 여기에 설명 된 방법의 주요 장점은 모두 간단하고 구현하는 싼 것입니다. 전사 번역 기계는 같은 원심 증발기 및 압출기와 같은 일반적인 기기를 활용 과정을 통해 인지질 소포의 내부에 캡슐화됩니다. 반응은 형광 분광법에 의해 모니터링됩니다. 프로토콜의 재조합 단백질 발현, 세포의 모방의 건설, 세포 수명의 최소 요구 사항의 탐사, 또는 유전 적 회로의 조립에 적용 할 수 있습니다.

형광 현미경 extravesicular 물질이 효소 저하 때문 형광 만 (그림 3), 소포의 내부 관찰 보여준다. mVenus의 표현, intravesicular 형광 37 ° C에서 1.5 시간 후 관찰되기 시작하고 6 시간 내에 최대의 형광 강도에 도달합니다. 최적 배양 온도와 시간은 사용되는 특정 구조에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 형광 단백질은 온도에 의존 방식에서 확실히 다르게 성숙. 즉, 단백질 생산의 관찰은 단백질 합성과 폴딩시뿐만 아니라 발색단 형성에 전적으로 의존하지 않습니다. 전체적인 단백질 합성은 전사 및 번역 27에 필요한 소모 부품의 유입을 허용하는 막 단백질 모공을 통합하여 증가시킬 수 있습니다. 그것은 유사한 전사 transla을 수행하는 것이 좋습니다악용 유전자 구조가 작동하는지 확인하는 소포의 부​​재 TION 반응. 이 컨트롤 반응이 더 쉽게 형광 분광법보다 현미경으로 모니터링합니다. 그림 4는 구조 인코딩 mVenus의 시험관 전사 - 번역 반응을 보여줍니다. 캡슐화 반응은 유사 intravesicular 반응보다 훨씬 높은 총 형광 강도를 제공합니다. 총 intravesicular 볼륨이 extravesicular 볼륨 (즉, 희석 효과)보다 훨씬 작으므로이 캡슐화 효율로 인해입니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. 회전하는 증발기, 진공 펌프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 2. 주택 압출기 부품은 별도로 표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 주사기, 고정 너트, 테프론 베어링, 내부 막은 서로를 마주 검은 색 O-링, 압출기 외부 케이싱, 그리고 두 번째 주사기를 지원합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . 리포솜의 mVenus 단백질 생산의 그림 3 형광 이미지와 C :.. multilamellar 소포의 시야 이미지 1.5 시간과 2.5 시간 후 B와 &amp;# 160, D : mVenus의 생산은 형광 (녹색으로 표시) 1.5 및 2.5 시간 후에, 각각에 의해 시각입니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> 그림 4. mVenus의 시험 관내 전사 및 번역 nonencapsulated의 생체 조절 반응합니다. 형광 강도는 4 시간 동안 5 분마다 측정 하였다. 데이터는 실시간 PCR 장비로 획득 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다.

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 소포 내에 전사 및 번역 기구를 캡슐화하여 세포 모사체를 처음부터 구축하는 것입니다. 이는 먼저 얇은 지질 막을 준비함으로써 달성됩니다. 그다음, 소포를 형성한 후, 시험관 내 전사 및 번역을 위한 구성 요소들을 조립합니다.마지막 단계는 전사 및 번역 기구를 소포 내부에 배치하는 것입니다. 최종적으로, 세포 모사체의 활성은 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 수중유 에멀젼, 미세 유체 장치 또는 수중유-소포 전환 공정과 같은 기존의 다른 캡슐화 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 방법이 간단하고 비용이 저렴하며, 유전적으로 암호화된 단백질 기능을 활용하는 세포 모사체 구축에 적합한 투과성을 가진 견고한 소포를 생성한다는 점입니다.본 방법은 생명의 최소 기초를 정의하고 비생물적 생명 유사 기술을 개발하는 것과 같이, 무세포 및 바텀업 합성 생물학의 핵심 영역을 탐구하는 데 도움이 되지 않습니다. 얇은 지질 막을 만들기 위해 먼저 POPC를 40 mg/mL 농도로 클로로포름에 녹인 다음, 12 µmol의 POPC를 5 mL 라운드 바닥 플라스크에 분주합니다. 그다음, 원형 클립을 사용하여 플라스크를 회전 증발기의 증류관에 단단히 고정합니다.그런 다음 6번 설정을 사용하여 플라스크를 강하고 일정하게 회전시키기 시작합니다. 다음으로, 응축기 코일을 통해 물을 순환시키십시오. 클로로포름은 61.2 °C의 낮은 끓는점을 가지고 있으므로 물을 가열할 필요는 없습니다.1기압에서 스톱콕이 열려 있어 시스템이 대기에 노출되어 있는지 확인하여, 시스템에 진공을 동시에 가할 수 있도록 합니다. 스톱콕을 천천히 닫으면서 진공 펌프를 켭니다. 클로로포름이 육안으로 더 이상 보이지 않게 된 후에도 0.5~2시간 동안 회전 증발을 계속합니다.과정을 중단하려면 진공 압력을 천천히 해제하고 회전을 멈춥니다. 플라스크를 제거하면 지질을 재현탁시키기 위해 플라스크 벽면에 불투명하고 얇은 지질 막이 형성된 것을 볼 수 있습니다. 먼저 라운드 바텀 플라스크 내의 얇은 지질 막에 18.2 mega ohm 탈이온수 1 mL를 첨가한 후, 지질 막이 유리벽에서 떨어질 때까지 약 3,200 RPM으로 용액을 격렬하게 볼텍싱합니다.이 과정은 약 1분 정도 소요됩니다. 다음으로, 지질 분산액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 5 mm 팁이 장착된 균질기를 고정하기 위해 링 스탠드를 설치하고 마이크로 원심분리 튜브를 배치합니다.지질 분산액을 안정적으로 고정하기 위해 호모게나이저 아래에 서십시오. 그런 다음 분산 요소를 지질 분산액에 직접 넣되, 팁이 튜브 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 지질 분산액을 1분 동안 균질화하십시오.전원 레벨 4에서, 외부 케이싱과 2개의 Teflon 내부 멤브레인 지지대, 2개의 O-링, 1개의 Teflon 베어링이 들어가는 리테이너 너트로 구성된 미니 압출기 부품을 조립합니다. 2개의 O-링을 내부 멤브레인의 홈에 끼웁니다. 이제 2개의 필터와 1개의 400 nanometer 컷오프 멤브레인을 미리 적신 후, 적신 필터들을 O-링 내부의 Teflon 면에 밀착시킵니다. 400 nanometer 컷오프 멤브레인은 두 필터 사이에 배치합니다.O-링 사이에 두 개의 필터로 멤브레인을 감싼 상태에서 멤브레인 지지대를 압출기의 외부 케이스에 넣습니다. 케이스 내부에 테플론 베어링을 배치하고 리테이너 너트를 사용하여 손으로 고정합니다. 다음으로, 두 개의 시린지를 헹구고 그 중 하나에 18.2 mega ohm 물을 채웁니다.압출기 어셈블리 양 끝의 테플론에 있는 작은 구멍에 주사기 바늘을 삽입하십시오. 바늘은 쉽게 미끄러져 들어가야 합니다. 바늘을 강제로 밀어 넣지 마십시오.그런 다음 어셈블리를 압출기 하우징에 고정합니다. 이제 한쪽 시린지에서 다른 쪽 시린지로 물을 천천히 밀어내어 압출기에 물을 통과시킵니다. 이것이 1회 통과 과정에 해당합니다.누출 여부를 확인하기 위해 세 번 통과시킨 후, 시린지를 제거하십시오. 새로운 시린지에 소낭 용액을 채웁니다. 이를 익스트루더에 연결하고 용액을 멤브레인에 천천히 통과시키십시오.이 과정을 총 11회 반복합니다. 샘플을 통과시키면서 샘플의 탁도가 점차 낮아지고 멤브레인을 통해 밀어내기가 더 쉬워집니다. 하지만 저항이 갑자기 감소하는 것은 보통 멤브레인이 파손되었음을 나타냅니다. 완료되면, 압출된 소포액을 40 µL씩 분주합니다.각 분주액을 드라이아이스 또는 액체 질소로 급속 동결시킵니다. 동결 후, 원심 분리 증발기를 사용하여 각 분주액을 30°C에서 하룻밤 동안 동결 건조합니다. 동결 건조된 빈 소낭은 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 전사-번역 반응 성분들을 혼합하고 20 units의 RNase 억제제를 첨가하여 캡슐화를 시작합니다.반응물을 얼음 위에서 배양한 다음, 대조군으로 DNA 템플릿을 추가합니다. 이때 T7 전사 프로모터와 강한 E. coli 리보솜 결합 부위 뒤에 m venous 또는 유사한 형광 단백질을 인코딩하는 플라스미드 250 nanograms를 사용하십시오. 반응액의 최종 부피를 25 microliters로 맞춥니다. RNase-free water를 사용하여 동결 건조된 소포 40 microliters를 반응 혼합물 10 microliters에 수화시키십시오.소포체가 재현탁될 때까지 혼합물을 짧게 볼텍싱합니다. 이 과정은 30초 미만으로 소요되어야 합니다. 소포체가 팽창할 수 있도록 반응물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 1.5 µL의 소포체와 27.0 µL의 tris chloride 용액 및 1.5 µL의 proteinase K 스톡 용액을 혼합하여 소포체 혼합물을 최종 부피 30 µL가 되도록 20배 희석합니다. 이제 희석된 소포체 혼합물을 37 °C에서 최소 2시간 30분 동안 배양합니다.표준 현미경 위에 20 x 5 mm 실리콘 스페이서를 배치하여 시료 챔버를 준비합니다. 파이펫을 사용하여 10 µL의 소포를 시료 챔버에 넣고, 챔버 위에 실리콘 처리된 유리 커버슬립을 덮습니다. 그런 다음 63x 오일 침수 렌즈 또는 이와 유사한 대물렌즈를 사용하여 명시야 및 형광 현미경으로 소포를 관찰합니다.사용된 형광 단백질에 적합한 필터 세트를 사용하여 형광 현미경으로 관찰하면 형광이 소포 내부에서만 관찰됨을 알 수 있습니다. 소포 외부에 존재하는 물질은 효소로 분해하여 소포 내부에만 형광이 나타나도록 합니다. 37 °C에서 1.5시간 후에 형광이 관찰되기 시작합니다.M Venus는 6시간 후에 최대 형광에 도달합니다. 여기서는 2.5시간 시점의 모습이 관찰됩니다. 이 단백질의 생성은 단백질 합성 및 접힘뿐만 아니라 발색단 형성에 따라 달라집니다.소포체 없이 벡터와 m Venus 코팅제의 유사한 인비트로(in vitro) 전사-번역 반응을 대조군으로 사용합니다. 이러한 반응은 캡슐화 효율 및 희석 효과로 인해 더 높은 형광 강도를 나타냅니다. 따라서 이들은 현미경이 아닌 분광법으로 모니터링합니다.이 절차는 인공 세포 활성에 미치는 재조절 및 대사 부하 효과와 관련된 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전사-번역 기구를 합성 소포에 직접 캡슐화하여 세포 모사체를 구축하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.

거대한 소포 내부의 단세포 수준에서 세균 세포 배양

여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 모델 막 단백질을 지질 이중층으로 합성하고 통합하는 연구를 위해 거대 단층 소포(GUV) 내에 CFE(cell-free expression) 시스템을 캡슐화하는 데 사용되는 역에멀젼 방법을 설명합니다.

Cell-Free Expression System의 캡슐화에 의한 박테리아 글루타메이트 수용체 채널의 재구성

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

배우세요 소포체 내 전사 및 번역 기계 캡슐화를 통한 세포 모방체 구축 방법을. 이 기술은 합성생물학 및 무세포 시스템 연구에 활용됩니다.

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

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