Name: 시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 시상 하부 뉴런에서 카스파-3/7 다중 분석을 이용한 세포 사멸 평가 방법을. 형광 및 발광 측정으로 산화 스트레스 유발 세포 사멸 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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여기에 설명 된 작업은 재향 군인의 업무의 미국학과 생물 의학 연구소 연구 개발 BX001686-1A1와 VA 재활 연구 및 개발에 의해 투자되었다.

세포 배양 1. 도금 및 유지 <ol><li> 따뜻한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신) 37 ° C까지 </li><li> -80 ° C.에서 냉동 A12 세포의 주식을 확보 </li><li> 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동; 한 번 해동, 부드럽게 피펫 세포는 75cm 2 배출 문화 플라스크에 전송하고 배양 배지 10 ㎖를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 플라스크 하룻밤을 품어 미디어를 대기음 24 시간 후 신선한 용지로 교체합니다. 70-80% 합류는 (2 ~ 3 일 성장)을 얻을 때까지 세포 성장을 계속합니다. </li></ol> 2. 계수 및 도금 세포 <ol><li> 따뜻한 DMEM 37 ° C.에 1X-트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 </li><li> 세포와 미디어를 대기음은 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 2 회 세척한다. </li><li> 트립신 용액 500 μl를 추가하고 2-5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 분리스크레이퍼를 사용하여 미디어의 5 ML에있는 세포를 일시 중단 플라스크의 세포. 스트레이너를 통해 세포에 전달하고 깨끗한 50 ㎖ 튜브에 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 한 번 이상 스트레이너를 통해 세포를 통과 할 필요가 있습니다 만, 3 회 이상 반복하지 않습니다. </li><li> 미디어 100 μL의 최종 볼륨의 96 - 웰 분명 바닥 검은 색이나 흰색 벽으로 둘러싸인 플레이트에 6,000 세포 / 웰 시드 문화에 세포의 양을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어. </li></ol> 3. 세포 생존과 카스파 3 / 7 활동을 결정 <ol><li> 살균 5 ㎖의 유리제 바이알에 PA를 전송하고 100 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 용해. DMSO의 주식 PA 솔루션 1:10 희석하고 0.1 ㎜ PA의 최종 작업 농도를 얻기 위해 DMEM을 데워진에 추가합니다. 제어 매체의 경우, PA를 포함하는 미디어에 추가됩니다 DMSO의 동일한 농도를 추가합니다. </li><li> 물론 각각의 용지를 제거하고로 교체 50 μL 미디어 + / -PA. 37 ° C에서 5 % CO 2에서 2 시간 동안 접시를 품어 이어서 5 μL의 레사 주린 시약을 추가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 세포 생존 능력을 측정하기 위해 멀티 모드 마이크로 플레이트 판독기, 형광 기록 (560 EX / 590 EM) 사용. 결과는 상대 형광 단위 (RFU)으로 표시하고 있습니다. </li><li> 같은 판에, 카스파 시약의 5​​5 μl를 추가하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 다시 카스파 3 / 7 활성을 측정하기 위해 마이크로 플레이트 리더, 기록 발광을 사용. 결과는 카스파 3 / 7 활동에 직접적으로 비례 발광으로, 상대의 발광 장치 (RLU)로 표현된다. </li><li> , 세포 수에 카스파 제 3 / 7 활동을 정상화 카스파 3 / 7 활동 (RLU)에 의해 세포 생존 능력 (RFU)를 나눕니다. </li></ol>

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멀티 플렉스 분석은 PCR 마이크로 어레이, 면역 및 기타 단백질 기반 검출 방법 13, 14 등 다양한 응용 프로그램에서 과학자들에 의해 사용 된 잘 받아 기술이다. 최근, 다중 분석이 점점 체외 플레이트 기반의 실험에 이용하고 세포 독성을 평가하는 정확한 방법으로 검증하고 12 생존 한되었다. 위의 프로토콜에서는, 우리는 PA의 반칙으로 A12 세포에서 카스파 제 3 / 7 활동과 세포 생존을 결정하는 다중 형광 및 발광 분석법의 효과를 보여줍니다. 세포 생존이 가능한 세포의 신속하고 신뢰할 수있는 표현을 허용, 초기 PA 모욕의 10 분 이내에 결정 하였다. 그것은 rezasurin 기반 시약 측정 할 상기 끝점을 허용 생균 분석법임을 주목해야한다; 그러나, 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 배양 시간을 최적화 된 essentia입니다유용한 결과 15를 얻기 위해 L. 아폽토시스는 외부 자극,...

팔 미트 산 (PA) 등의 포화 지방산이 풍부한 다이어트는 비만과 심장 혈관 질환과 당뇨병 1, 2 등 다른 동반 질환에 연결되어있다. 고지방 사료 또한 산화 스트레스, 아폽토시스 및 시상 하부 신경 변성, 식욕 및 에너지 비용 3-7의 중요한 레귤레이터를 증가하는 것으로 나타났다. 높은 지방 다이어트 노출 시상 하부 조절 장애를 유발 통해 메커니즘을 이해하는 것은 비만에 대한 약물 치료의 발전을 위해 이렇게 중요합니다. 그러나,식이 지방이 신경 세포의 기능에 영향을 미치는 통해 세포 메커니즘은 불분명하다. 이러한 PA 등의 지방이 시상 하부의 세포 사멸 경로의 발병을 유발하는 방법의 더 나은 이해는이 목표를 향해 필요한 첫 번째 단계입니다. 이 문서의 목적은 시간의 연구에 사용하기 위해 개발 PA 노출에 신경 반응의 시험관 테스트를위한 다중 분석을 설명하는 것입니다ypothalamic 신경 퇴행. 우리는 PA 8 산화 공격 후 (A12)의 이용 차별화 된 불후의 성인 마우스 시상 하부 세포주에서 세포의 총 수 당 3 / 7 활동 카스파를 측정하기위한 시험 관내 96 - 웰 형식의 멀티 플렉스 분석에 대한 자세한 설명을 제공한다. 간단히, 세포 생존 능력은 레사 주린 기반 분석을 통해 PA의 반칙으로 결정된다. 레사 주린은 대사 활성 세포에있는 효소의 감소를 겪는 세포 투과성 화합물, 생각 프로세스는 미토콘드리아 (9)를 통해 발생합니다. 생존 세포는 지속적으로 생존 세포의 수에 비례하여 형광 신호를 생성하는, 레조 루핀 (resorufin) 레사 주린하는 변환. 카스파 제 3 / 7 활성은 다음 DEVD lumogenic 기반 분석을 사용하여 분석된다. DEVD는 카스파 제 -3에 의해 절단 아미노산 서열 (ASP-글루 - 발-ASP)이다. 이 서열은 세포 내 카스파 3 / 7의 활성화 및 후속 절단시 lumogenic 물질에 결합되면DEVD 기판으로, 발광 제품이 해제됩니다. 이 반응은 카스파 제 활성에 따라서 세포 자멸사의 유도에 비례한다. 사균은 카스파 제를 생산할 수 없기 때문에, 카스파 제 3 / 7 활성은 천연 과도로이고; 따라서 분석은 세포 스트레스의 효과에 따라, 4 시간 후 - 도전 30 분 사이에 완료되어야한다. 세포 생존율은 카스파 제 3 / 7 활성에 반비례하고 세포 사멸의 메카니즘을 결정하는데 사용될 수있다. 예를 들어,이 방법은 이전에 오렉신이 처리에 의해 영향을받는 메커니즘이 산화 손상 (10)에 대한 보호에 중요하다는 것을 시사 과산화수소 도전 시상 세포에서 세포 사멸을 감소 펩타이드 호르몬이 전처리를 표시하는 데 사용되었다. 그것은 그들이 분석 시약을 줄이기 위해 미토콘드리아 활성에 의존하는 이러한 어 세이는 세포주 및 조직 의존하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 시상 하부 (A12) 셀에 최적화되어 있습니다; 그러나,기재된 방법은 유사한 연구의 범위에 맞도록 변경 될 수있다. 단일 문화권에서 다중화 분석법 확실히 여러 가지 이유로 개별 분석을 수행하는 기존의 방법보다 이점을 제공한다. 시간, 세포 샘플 및 배양 시약을 저장하는 것 외에도, 다중화 분석법은 또한, 세포의 생존 및 사망의 지식을 제공 내부 제어를 제공하고, 반복적 인 실험 11, 12에 대한 필요성을 제거 할 수있다. 다른 방법은 96 - 웰 형식을 사용하여 특히, 신뢰할 수있는 분석이다 서양 말이나 ELISA를,에 의존하지만, 비용과 시간이 많이 소요 (1-2 일간)입니다있다. 이 다중화 분석을위한 세포 배양에 소요되는 시간을 제외하고, 전체 시간은 3 시간 미만이다. 이 프로토콜은 A12 세포와 함께 사용하기 위해 최적화되어 있지만 셀의 무결성에 영향을 미칠 수있는 요인 염두에 유지하면서, 다른 모델에서 사용하기 위해 변경 될 수있다. 제지이 프로토콜은 일련의 실험을 위해 일하면 마이닝은 샘플이나 실험 조건의 수에 계획된 다운 스트림 실험에 따라 달라집니다.

<table><tbody><tr><td>성체 쥐 Hypothalamus 세포주 mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc. (셀루션스 바이오시스템즈)</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' 의 변형된 독수리' s 미디엄</td><td>인비트로젠</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>소태아 세럼&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>팔미트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>디메시 설폭사이드&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue 세포 생존도 시약</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W 광학 바닥 플레이트, 검은색 폴리스티렌, 세포 배양 처리, 뚜껑 포함, 멸균</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

복잡한 세포 메커니즘의 연구에서 분석을 다중화하는 능력은, 반복적 인 실험의 필요성을 없애 내부 제어를 제공하고, 비용 및 시약에 폐기물을 감소시킨다. 여기에서 우리는 96 - 웰에서 생존 세포 수와 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 위해 기반 분석법을 형광체 및 발광을 모두 사용하여, 시험 관내 시상 모델의 팔 미트 산 (PA)의 반칙 아폽토시스를 평가하기 위해 멀티 플렉스 분석의 최적화를 설명 마이크로 플레이트 형식입니다. PA의 반칙으로, 가능한 세포는 레사 주린 기반의 형광 분석에 의해 결정되었다. 카스파 제 3 / 7 활성은 luminogenic 기판 DEVD 및 세포 수로 정규화를 사용하여 측정 한 다음이었다. 이 다중 분석법은 포화 지방산 도전으로 사멸 자극, 다음 카스파 제 활성의 변화를 결정하기위한 유용한 기술이다. 포화 지방산 PA는 잠재적 importa을 나타내는 시상 산화 스트레스 및 세포 사멸을 증가시킬 수있다예컨대 그와 같은 분석법의 NCE은 포화 지방산과의 연결 기능 사이의 관계를 연구하는 기재.

프로토콜은 위 세포 죽음의 메커니즘을 결정하는 다중 두 개의 분석 결과를 설명합니다. 그림 1 세포 생존 및 카스파 제 3 / 7 활동을 결정하는 프로토콜에 대한 개요를 보여줍니다. 카스파의 활동은 크게 2 시간 배양 (그림 2A 표 1) 후 PA에 도전 세포에서 증가했다. 세포막의 무결성의 손실은 PA (그림 2B)에 2 시간 노출 후 세포에서 명백한 세포 사멸 유도와 관련된 형태 학적 변화이다. 그림 3은 PA가 세포 사멸을 유도 배양 최적화의 중요성을 설명하는 잠재적 인 경로를 설명 DEVD 시약의 시간. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51305/51305fig1highres.jpg" width="600" ...

멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

이 비디오의 전반적인 목표는 caspase-3/7로 측정되는 세포 사멸의 시작을 결정하기 위한 고출력 다중 분석법을 시연하는 것입니다. 먼저, 시상하부 뉴런에 세포 사멸을 유도하는 포화 지방산인 palmitic acid를 처리하여 자극을 줍니다.그런 다음, 세포 사멸(apoptosis)이 시작된 후 형광 기반 시약과 마이크로플레이트 리더를 사용하여 뉴런의 세포 생존율을 측정합니다. 카스파제-3(caspase three)에 의해 절단되는 아미노산 서열인 발광 기질 DEVD를 세포에 첨가합니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 발광도를 측정함으로써, 세포 사멸이 진행 중인 세포에서 증가하는 카스파제 활성도를 결정하는 것입니다.결과적으로, 96-웰 포맷에서 생존 세포당 caspase 활성 비율을 5~6시간 이내에 얻을 수 있습니다. 웨스턴 블롯이나 용해와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 다양한 웰 포맷에서 caspase 3, 7 활성을 직접 측정할 수 있는 신속하고 저렴한 분석법이라는 점입니다.이 방법은 세포 사멸의 주요 조절 인자를 결정하는 것과 같이 해당 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 유용성은 이러한 다중 분석(multiplexing)을 세포 독성과 생존력을 평가하는 정확한 방법으로 사용할 수 있다는 점입니다. 분석 과정은 상당히 간단하지만, 분석을 성공적으로 완료하기 위해서는 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.이 방법은 신경 퇴행에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 암 연구 등에 사용되는 다른 질병 및 in vitro 모델에도 적용될 수 있습니다. 이 방법을 처음 사용하는 연구자는 종점(endpoint)이 세포주와 작용제(agonist)에 따라 달라지므로 해당 기술을 최적화해야 합니다. Caspase 3/7 활성은 일시적으로 나타납니다.따라서 세포 스트레스 요인의 효과에 따라, caspase 활성을 분석하기 위한 적절한 시점을 결정하는 데 어느 정도의 노력이 필요할 수 있습니다. 우선, 냉동된 A12 세포를 37 °C 항온수조에서 빠르게 해동하십시오. 해동 후, 세포를 75 cm² 통기성 배양 플라스크에 조심스럽게 파이펫팅하여 옮기고 10 mL의 따뜻한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 첨가한 다음, 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오.24시간

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연구

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신경과학

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를...

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

이 동영상은 세포 사멸 또는 세포사멸을 정량화하기 위한 체외 Caspase-3/7 발광 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 pro-luminescent DEVD 기질의 caspase-3/7 절단 후 생성된 발광을 측정합니다. 생성된 발광은 caspase-3/7 활성에 비례합니다.

Caspase-3/7 Assay: 개구리 피부 이식에서 Caspase-3/7 활성을 측정하여 세포사멸을 정량화하는 발광 기반 분석

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

카스파 제 활성의 낮은 농도를 포함하는 전체 동물의 건강한 세포를 검출하기 위해, CaspaseTracker 지정된 고감도 바이오 센서 초파리에 대해 생성 하였다. 카스파 따라 바이오 활성 데스 자극의 부재 하에서 최적 조건 하에서 사육 성인 동물의 내부 장기에 걸쳐 긴 수명이 건강한 세포에서 검출된다.

생체 내에서 바이오 센서는 초파리에서 비 세포 사멸 카스파 활동을 추적

Anastasis는 vivo에서 감지 하는 세포 죽음 프로세스를 반대로 세포 형태학 상으로 정상적인 건강 한 세포와 구별할 수 있기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 여기 우리는 감지 하 고 우리의 새로 개발 된 vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서 시스템을 사용 하 여 라이브 동물에서 anastasis 받아야 하는 셀 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Anastasis에서 Vivo에서 CaspaseTracker 바이오 센서에 의해 감지

이 프로토콜 설명 caspase 분자 형광 보완성 (BiFC); 그들의 활성화에 있는 첫걸음은 초기자 caspases의 유도 근접을 시각화 하는 데 사용할 수는 영상 기반 방법입니다.

Caspase 활성화 분자 형광 보완성을 사용 하 여 경로를 조명

여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.

이 단지에서 CD95 사망 유도 신호 복합체 및 프로카스파스-8의 처리 구성 측정

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

학습하세요 시상 하부 뉴런에서 카스파-3/7 다중 분석을 이용한 세포 사멸 평가 방법을. 형광 및 발광 측정으로 산화 스트레스 유발 세포 사멸 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

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