시상 하부 세포 모델에서 세포 사멸을 결정하는 카스파 다중 분석의 사용

이 비디오의 전반적인 목표는 카스파제에 의해 측정된 세포사멸의 발병을 결정하기 위한 고출력 멀티플렉스 분석을 시연하는 것입니다. 쓰리 세븐. 첫째, 시상하부(hypothalamic neuron)는 세포사멸(apoptotic)을 유도하는 포화 지방산인 팔미트산(palmitic acid)에 도전합니다.

그런 다음 세포사멸이 시작된 후 형광 기반 시약과 마이크로플레이트 리더를 사용하여 뉴런의 세포 생존력을 측정합니다. 카스파제 3에 의해 절단된 아미노산 서열인 루미노 기질(lumino substrate, DEVD)이 세포에 추가됩니다. 절차의 마지막 단계는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정하여 세포사멸을 겪고 있는 세포에서 증가하는 카스파아제 활성을 측정하는 것입니다.

궁극적으로, 생존 가능한 세포당 카스파제 활성의 비율은 5-6시간 이내에 얻을 수 있습니다. 96웰 형식입니다. 웨스턴 블롯 또는 용해와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 여러 웰 형식에서 caspase three seven 활성을 직접 측정할 수 있는 빠르고 저렴한 분석법이라는 것입니다.

이 방법은 세포사멸의 1차 조절인자 결정과 같은 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 유용성은 이 multiplexing이 세포 독성 및 생존력을 평가하는 정확한 방법으로 사용될 수 있다는 것입니다. 분석은 매우 간단하지만 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 분석이 성공적으로 완료될 수 있도록 하기 때문에 매우 중요합니다.

이 방법은 신경 퇴행에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 질병 및 암 연구에 사용되는 것과 같은 체외 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 방법을 처음 접하는 개인은 종말점이 세포주와 작용제에 의존하기 때문에 이 기술을 최적화해야 합니다. Caspase three seven 활동은 일시적입니다.

그러므로, 세포 스트레스 인자의 효과에 따라, 캐스트 염기 활성을 분석하기 위한 적절한 타이밍을 결정하는 것은 빠르게 시작하기 위해 약간의 노력이 필요할 수 있습니다. 해동은 섭씨 37도의 수조에서 12개의 셀을 얼렸습니다. 해동되면 세포를 75cm 제곱미터의 통풍 배양 플라스크에 부드럽게 파이프로 넣고 10ml의 따뜻한 델코, 변형 독수리, 중간 또는 DMEM을 추가하고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 플라스크를 배양합니다.

24 시간 후, 배지를 흡인하고 새로운 배지로 교체하십시오.70-80 % 사이의 세포가 계속 성장할 수 있습니다.합류는 2-3 일의 성장 후에 얻어집니다. 세포를 먼저 데우고 1 x 트립신을 세려면 EDTA 용액을 섭씨 37도까지 가열합니다. 플라스크에서 배지를 흡입하고 멸균 인산염 완충 식염수로 두 번 세척합니다.

500마이크로리터의 트리인 용액을 첨가한 후 섭씨 37도에서 2분에서 5분 동안 배양합니다. 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 분리하고 5ml의 배지에 세포를 현탁시킵니다. 세포 여과기를 통해 세포를 깨끗한 50ml 튜브에 통과시킵니다.

스트레이너를 통해서 세포를 두 번 이상 통과하는 것이 필요할지도 모르지만, hemo cytometer 씨를 사용하여 세포를 세는 후에 3 이상 반복하지 마십시오.6, 매체의 100 마이크로리터의 마지막 양에 있는 96 우물 명확한 바닥 까맣거나 백색 벽으로 막힌 판에 있는 우물 당 000의 세포, 플레이트를 5% 이산화탄소와 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 팔미트산을 멸균 5ml 유리 바이알에 옮기고 100% DMSO에 용해시킵니다.

DMSO에서 스톡 팔미트산 용액을 1 내지 10으로 희석한 후, PREWARM DMEM에 첨가하여 대조 매체에 대한 0.1 밀리몰 팔미트산의 최종 작업 농도를 얻고, 팔미트산을 포함하는 매체에 첨가된 것과 동일한 농도의 DMSO를 첨가합니다. 각 웰에서 매체를 제거하고 50마이크로리터의 중간 플러스 또는 마이너스 틱산으로 교체하고 플레이트를 5% 이산화탄소와 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 5마이크로리터 수지 시약을 추가하고 배양 후 실온에서 10분 동안 배양한 후 플레이트를 다중 모드 마이크로플레이트 리더에 로드하고 560나노미터의 여기 파장과 590나노미터의 방출 파장에서 형광을 기록합니다.

세포 부수(cell liability)를 측정하기 위해 결과는 동일한 플레이트에 대한 상대 형광 단위로 표시됩니다. 55마이크로리터의 DEVD 캐스트 시약을 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 다시 Microplate 리더 기록 발광을 사용하여 caspase 3 7 활성 결과를 측정하고, 발광이 caspase 3 7에 정비례하는 발광 단위로 표시되며, caspase 3 7 활성을 세포 수에 정규화하고 세포 생존력을 caspase three seven 활성으로 나눕니다.

이 프로토콜은 세포사멸에 의한 세포 사멸 메커니즘을 결정하기 위해 두 개의 개별 분석을 multiplexing하는 결과를 설명합니다. 카스파아제 활성은 팔미트산이 투여된 세포에서 현저하게 증가하였다. 2시간 배양 후, 세포막 무결성은 팔미트산의 존재 하에서 눈에 띄게 변화합니다.

다음은 팔미트산이 세포사멸을 유도하는 잠재적인 경로입니다. 세포사멸을 유도하는 데 사용되는 스트레스 요인의 기본 메커니즘을 이해하면 스트레스 요인의 잠복기를 결정하는 데 도움이 됩니다. 카스파제 효소는 DEVD 기질과 상호 작용하기 전에 활성화되어야 하기 때문에 일단 마스터하면 이 기술을 적절하게 수행하면 5-6시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 in vitro 시상하부 신경 세포 배양 모델을 사용하여 멀티플렉스 카스파제 쓰리 세븐 활성 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 잠복 시간은 사용되는 세포 유형과 스트레스 요인 또는 작용제에 따라 달라진다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발을 통해 신경 과학 분야의 연구자들은 세포사멸 연구에 신뢰할 수 있고 시간을 절약하는 기술을 사용할 수 있습니다.이 절차에 따라 퇴행성 질환을 시작하는 기본 메커니즘을 설명하기 위해 세포사멸 과정 내에서 특정 단백질을 표적으로 하는 추가 약리학적 분석을 수행할 수 있습니다.