마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 RNA 간섭을 사용하여 선천성 면역 반응에 대한 후보 유전자의 영향을 조사하는 것입니다. 이를 수행하기 위해 마우스 대식세포에서, 마우스 대식세포 세포주를 트립화하고 형질주입 용액 및 관심있는 SI RNA와 결합하고, 혼합물을 96 well nucleo VETE 플레이트로 옮기고, Maxa 96 Well 형질주입 시스템을 사용하여 siRNA를 대식세포로 형질주입하고, 세포 배양으로 배양한 후, 매체, LPS 또는 기타 선천성 면역 활성화 인자를 형질주입된 대식세포에 적용하여 대식세포를 자극합니다. 마지막으로, 사이토카인 생성을 모니터링하고 선천성 면역 반응에 대한 siRNA 처리의 효과를 평가하기 위해 Eliza's를 수행합니다.

지질 매개 transfection에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 분석법이 견고하고 고처리량 직업의 많은 유전자에 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법의 핵심은 건강한 세포와 함께 작업하고, 부드럽게 치료하고, transfection 과정에서 효율적으로 작동하는 것입니다. 우리가 설명하겠지만, 이 프로토콜은 첨부 문서에 설명된 대로 배양된 원시 2 64 0.7 마우스 대식세포 세포주를 사용합니다.

INA transfection plate를 준비하기 위해 세포는 20% co의 유창성으로 세포가 80% 이상 융합되지 않을 때까지 하루나 이틀 동안 성장합니다. 3 번과 10 번 사이의 셀을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 해동 후 transfection에 사용할 96웰 셔틀 시스템을 프로그래밍하여 이 절차를 시작합니다.

이렇게하려면 왼쪽 상단 파일 메뉴에서 셔틀에 연결된 컴퓨터에서 96 웰 셔틀 소프트웨어를 시작하십시오. 새 매개변수 파일을 선택합니다. 표시된 96웰 플레이트 회로도에서 transfection될 웰을 강조 표시합니다.

녹색 상자는 선택한 우물을 나타냅니다. raw 2 64 0.7 cell에 사용되는 대식세포 세포주에 해당하는 프로그램을 선택합니다. DS 1 36을 선택하고 적용을 선택합니다.

프로그램을 선택하면 회로도 플레이트의 웰이 색상이 지정됩니다. 진한 파란색의 빈 원은 프로그램이 할당되지 않았고 충격을 받지 않을 우물을 나타냅니다. 다음으로, SF 세포주 96웰 뉴클레오 이펙터 용액을 포함된 보충 튜브의 전체 내용물과 혼합하여 작동하는 뉴클레오 이펙터 용액을 준비합니다.

혼합 시약이 실온에서 평형을 이루도록 합니다. D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25% 트립인 EDTA 및 PBS를 섭씨 37도에서 가열합니다. 실험용 S-I-R-N-A-P max GFP 대조군 플라스미드 또는 형광 표지된 siRNA를 얼음에서 해동하여 세포 배양 접시에서 부착성 대식세포를 분리하여 준비합니다.

배지를 흡인하고 10ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS를 제거한 후 세포가 분리되기 시작할 때까지 플레이트당 사전 경고된 0.25% 트립신 EDTA 1ml로 세포를 배양합니다. 이 작업은 1-2분 정도 걸립니다.

플레이트를 부드럽게 두드리고 배양 중에 용액을 움직여 트립신 화를 최대화합니다. 세포가 분리된 후 위아래로 피펫팅하여 9ml의 DMEM과 FBS 혼합물을 부드럽게 첨가한 다음 멸균 튜브에 피펫팅하여 세포를 수집합니다. Hema Cytometer를 사용하여 분리된 대식세포의 수를 계산합니다.

10cm 플레이트당 약 1,000만 개의 대식세포가 있을 것으로 예상됩니다. 96 웰 셔틀에 각 웰에 필요한 대식 세포의 총 수를 계산하려면 200, 000 개의 세포가 필요합니다. 계산된 수의 세포를 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.

실온에서 150G으로 10분 동안 셀을 멸균 96웰 원형 바닥 플레이트로 회전시켜 시약 손실을 최소화하면서 혼합을 용이하게 합니다. transfection할 각 well에 각 IRNA를 2마이크로리터씩 추가합니다. siRNA의 수에 따라 이는 대식세포 원심분리 단계에서 수행될 수 있습니다.

이 절차의 가장 어려운 측면은 세포를 매우 부드럽게 다루고 매우 빠르게 작동하는 열쇠인 전기천공법입니다. 세포가 독성 transfection 용액에 들어가면 원심분리 세포에서 배지를 흡인한 다음 nucleo effector 용액에 부드럽게 재현탁합니다. 보충 용액을 함유한 SF.

즉시 다중 채널 피펫을 사용하여 세포를 멸균 트로프로 옮기고, 재현탁 세포 혼합물 20마이크로리터를 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합된 siRNA가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 다음으로, 20 μl의 세포 INA 혼합물을 96 well nucleo vete plate로 옮깁니다. 이 단계에서 기포를 생성하지 않는 것이 중요한데, 이는 핵 애정 형성 중에 오류를 유발할 수 있기 때문입니다.

모든 실험 샘플을 transfection 플레이트에 넣은 후 제공된 뚜껑으로 덮고 단단한 표면을 매우 부드럽게 두드립니다. 기포를 제거하려면 96웰 플레이트를 96웰 뉴클레오 이펙터 셔틀에 넣고 프로그램 화면 오른쪽 하단에서 업로드 및 시작을 선택합니다. 그런 다음 프로그램 프롬프트에 따라 핵 애정 프로세스 웰 동안 결과를 성공적으로 저장합니다.

Transfected는 화면의 96 웰 회로도에서 더하기 기호가 있는 녹색 원으로 표시됩니다. 마이너스 기호가 있는 빨간색 원은 뉴클레오 애정 직후 기포 또는 잘못된 시약 부피 파이펫팅으로 인한 오류일 가능성이 가장 높음을 나타냅니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 80마이크로리터의 예열 RPMI 1640을 추가합니다.

중간을 각각의 측면에 배치합니다. 배지가 이 단계에서 매우 섬세한 형질주입된 세포와 천천히 혼합되도록 합니다. 매체를 너무 빨리 추가하면 생존 가능성이 크게 떨어집니다.

형질주입된 샘플과 RPMI 1640이 포함된 96웰 플레이트를 5%CO2가 포함된 섭씨 37도의 인큐베이터에 2분 이상 넣습니다. 추가 조작 전에 세포가 회복되도록 하는 것이 중요합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰의 혼합물을 96웰 조직 배양 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.

그런 다음 다시 멀티채널 파이펫을 사용하여 FBS가 있는 DMEM 100마이크로리터를 각각에 추가합니다. transfection 및 recovery 직후 24-36시간 동안 배양하고 유세포 분석을 수행합니다. 형광 표지된 SI irna의 transfection efficiency를 평가하기 위해서는, transfection assay 다음날 세포의 99% 이상을 transfection해야 합니다 GFP 플라스미드의 transfection efficiency를 위해서는 세포의 30 - 50%가 GFP를 발현해야 합니다 24 - 36시간 배양 후, 새로운 배지에서 LPS 또는 기타 선천성 면역 활성제를 준비하고 FBS를 사용하여 DMEM에서 밀리리터당 20나노그램의 최종 농도로 LPS를 희석합니다.

그런 다음 96 웰 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡인하고 LPS를 포함하는 새로운 배지를 세포에 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣어 자극 후 다양한 시간에 LPS 또는 기타 선천성 면역 자극제에 대한 반응을 모니터링합니다. Eliza의 분석을 위해 세포의 상등액을 96웰 저장 플레이트에 피펫으로 넣습니다.

세포 생존력을 모니터링하기 위해 상층액을 제거한 후, PBS에 1-100 플루오레세인 디 아세테이트 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가하여 실온에서 1-5분 동안 배양합니다. 살아있는 세포에서 세포 에스테라아제에 의해 절단될 때 플레이트 리더를 사용하여 세포의 형광을 모니터링합니다. 이 화합물은 선천성 면역 반응을 모니터링하기 위한 이 접근법의 유용성을 설명하기 위해 형광이 됩니다.

알려진 선천성 면역 조절 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 RAW 2 64 0.7 대식세포 세포주에 transfection했습니다. 그런 다음 세포에 LPS와 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 생성하도록 자극했습니다. IL 6 및 TNF 알파는 여기에 표시된 바와 같이 Eliza에 의해 모니터링되었습니다.

톨 유사 수용체 4, LPS에 대한 수용체의 억제, 그러나 다른 TLR은 억제하지 않습니다. SIR을 사용하여 LPS의 생산이 크게 감소하여 IL 6 및 TNF 알파를 유도했습니다. irna에 의한 IL 6의 억제는 IL 6 생산을 감소시켰지만, TNF 알파 생산에는 영향을 미치지 않았다.

이러한 데이터는 선천성 면역의 후보 조절자에 대한 siRNA 매개 녹다운의 우수한 효능과 우수한 특이성을 시사합니다. 우수한 transfection과 우수한 세포 회수의 핵심은 매우 건강한 세포와 함께 작업하고, transfection 및 recovery 과정 중에 부드럽게 처리하고, 세포가 nucleo effector 용액에 들어가면 신속하게 작업하는 것임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 넉다운을 모니터링하기 위한 QPCR과 선천성 면역 반응을 조사하기 위한 다른 많은 분석을 포함하여 많은 다른 분석을 수행할 수 있습니다.