Name: 마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 대식세포에서 RNA 간섭을 활용한 선천성 면역 반응 연구 방법을. Amaxa Nucleofector 시스템으로 siRNA 전달 후 LPS 자극 및 사이토카인 분석을 수행합니다.

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이 원고에 설명된 몇 가지 기술을 최적화하는 데 도움을 준 Brad Lackford에게 감사드립니다.

대 식세포 세포주 1. 유지 보수 <ol><li> RAW264.7 성장 및 DMEM에서 J774A.1 세포주 5 % CO 2 존재하에 37 ºC에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. , 불임을 유지하는 데 도움이 (이 반드시 필요한 것은 아니지만) 미디어에 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / 연쇄상 구균)를 추가합니다. </li><li> 중요한 단계 : 대 식세포는 효율적인 형질과의 siRNA에 의한 유전자 최저의 건강한 상태로 성장하고 있는지 확인합니다. 이들 대 식세포 라인 가장 형질 효율을 발휘하고,이 단계에서의 강력한 후 형질 생존을 유지하는 것처럼, 신선한 해동 후 유로 (3) 및 (10) 사이의 세포를 사용하여; 양이 크게 감소 녹다운 형질 전환 효율과 유전자로서, 높은 통로 번호 (&gt; 20)을 사용하지 않는다. </li><li> 세포가 더 이상 80 % 합류점에 도달하지 않을 때까지 최적화 된 siRNA 형질 감염의 경우, 플레이트 20 % 컨 플루 언시 세포는 하루 또는 이틀 성장. 자란 세포는 effic 트랜하지 않습니다iently. </li></ol> 2. 형질의 96 웰 셔틀 시스템 프로그래밍 <ol><li> 셔틀 버스에 연결된 컴퓨터의 96 웰 셔틀 소프트웨어를 시작합니다. 왼쪽 상단의 파일 메뉴에서 새로운 매개 변수 파일을 선택합니다. </li><li> 표시 96 웰 플레이트 회로도에 형질 전환 될 우물을 강조 표시합니다. 녹색 상자가 선택되어있는 우물 표시됩니다. </li><li> 개념도 96 웰 플레이트 아래에있는 (J774A.1에 대한 RAW264.7 또는 DS-130 DS-136)를 사용하고 적용을 선택 대식 세포주에 해당하는 프로그램을 선택합니다. 프로그램을 선택한 후, 회로도 접시에 우물이 어두운 푸른 색이 될 것이라고합니다. 빈 동그라미는 프로그램이 할당되지 않았으며 충격되지 않습니다 우물을 나타냅니다. </li></ol> 3. 형질에 대한 시약 준비 <ol><li> SF 세포주 혼합하여 작업 Nucleofector ™ 솔루션을 준비 96 웰 Nucleofector ™ 솔루션동봉 보충 관의 전체 내용. 혼합 시약은 사용하기 전에 실온에서 평형을 허용합니다. 나중에 사용하기 위해 최대 3 개월까지 4 ºC에서 초과 완전한 Nucleofector ™ 솔루션을 저장합니다. </li><li> 사전 따뜻한 형질 대한 대 식세포를 제조하기 전에 37 ºC에서 DMEM, RPMI-1640, 0.25 % 트립신 / EDTA, 인산염 완충 식염수 (PBS). </li><li> 얼음에 해동에 의해 형질 전환에 대한 siRNA를 준비. 된 siRNA의 동결 녹아서의 수를 최소화하기 위해, 분취 그들이 사용되는 처음 새로운 siRNA를 동결. </li><li> 초기 실험에서, (20 μM 종목에서 1:10 희석) 2 μM의 비교적 높은 투여 량의 siRNA를 사용한다. 일반적으로 더 높은 투여 량은 다른 세포 유형에 비해 대 식세포에서 효율적인 유전자 녹다운 필요한되지만이어서, 저용량까지 넉다운 강력한 유전자 유도 된 siRNA를 적정한다. 참고 : siRNA를 여러 소스에서 사용할 수 있습니다; 매우 강력한 유전자 녹다운을 얻을 수있다각각의 유전자를 대상으로 네 개의 siRNA를 풀을 수 있습니다 siGenome의 SMARTPOOLs를 사용. 음성 대조군으로, 다양한 비 대상으로 s​​iRNA를 풀 또는 siRNA를의 사용. </li><li> , 형질 전환 효율을 모니터링 siRNA를 실험에 평행 pmaxGFP 제어 (Amaxa 키트에서 제공) 플라스미드 또는 형광 표지 된 siRNA를 형질한다. GFP 플라스미드의 30 % ~ 50 %의 형질 전환 (현미경으로 분석 또는 형질 전환 후 하루 유동 세포 계측법)과 (형질 전환 및 복구 후 세포 계측법 즉시 흐름에 의해 분석) 형광 표지 된 siRNA의&gt; 99 %의 형질 전환을 기대합니다. </li></ol> 4. 형질의 대 식세포를 준비 <ol><li> 트립신으로 세포 배양 접시에서 대 식세포를 분리합니다. 미디어를 대기음 10 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. PBS를 제거한 후, 함께 세포 배양 세포를 분리하기 시작 때까지 1-2 분 동안 0.25 % 트립신 / EDTA (1 ㎖ / 10cm 플레이트를) 미리 예열. 조심스럽게 접시를 누르고 SOLU 이동배양시 기는 트립신을 극대화한다. </li><li> 배양 후, 멸균 튜브에 피펫 팅하여 세포를, 9 ml의 DMEM + FBS 미디어를 추가 위아래로 부드럽게 혼합하고 수집합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 고립 된 대 식세포의 수를 계산합니다. 10cm 접시 당 약 1000 만 대 식세포를 기대합니다. 필요한 식세포의 총 수를 계산; 잘 96 - 웰 셔틀에 각각 20 만 셀을 필요로한다. 피펫 손실을 허용하는 세포의 몇 가지 추가 우물 &#39;의 가치를 추가해야합니다. </li><li> 원심 분리 튜브에 세포의 수를 계산 피펫. 실온에서 150 XG에서 10 분 동안 세포를 원심 분리기. 이 대 식세포의 건강과 형질 전환 효율을 감소하므로 너무 빨리 원심 분리하지 마십시오. </li></ol> siRNA의와 대 식세포의 5 Nucleofection <ol><li> (시약 손실을 최소화하면서 혼합을 용이) 멸균 96- 웰 둥근 바닥 플레이트를 사용하여 각 웰 될 TRANSF 각각의 siRNA의 2 μl를 추가반사 된. 주 : siRNA를 수에 따라, 이것은 식세포 원심 분리 단계 동안 달성 될 수있다. </li><li> 원심 분리하여 세포에서 미디어를 대기음. 부드럽게 펠렛 200,000 세포 당 20 μl를 이용하여, (보충 용액 함유) Nucleofector ™ 솔루션 SF에서 세포를 재현 탁. 재현 탁하면, 최적의 형질 즉시 세포를 사용합니다. </li><li> 멸균 구유에 재현 탁 세포로 이동; siRNA가 들어있는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 전사 재 부유 세포 혼합액 20 μL를, 멀티 채널 피펫을 사용. 부드럽게 피펫 아래로 섞는다. </li><li> 이전 96 웰 Nucleocuvette ™ 플레이트에 세포 / siRNA의 혼합물의 20 μl의 중요한 단계 :.이 Nucleofection 동안 오류를 유도 할 수있는 전송 단계에서 기포가 발생하지 않도록. </li><li> 형질 전환 플레이트에서 실험 모든 샘플을 배치 한 후, 제공된 뚜껑과 수직로드 96- 웰 플레이트 커버Y는 부드럽게 샘플에서 모든 거품을 제거하기 위해 딱딱한 표면에 누릅니다. </li><li> 프로그램 화면의 오른쪽 아래에 &#39;업로드 시작&#39;96 웰 Nucleofector 셔틀에 뚜껑이있는 96 웰 플레이트를 놓고 선택합니다. Nucleofection 이전에 결과를 저장하기 위해 프로그램의 프롬프트를 따르십시오. 참고 : Nucleofection 과정에서 성공적으로 tranfected 우물 더하기 기호가있는 녹색 원으로 화면의 96 웰 회로도에 묘사됩니다. 마이너스 (-) 기호가있는 빨간색 원으로 인해 기포 나 잘못 피펫 팅 시약의 올바른 볼륨을, 가장 가능성이 오류를 나타냅니다. </li></ol> 6. 복구 및 대 식세포의 도금 <ol><li> 즉시 Nucleofection 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각 웰에 RMP1-1640 미디어를 예열 (37 ° C)의 80 μl를 추가합니다. 미디어가 천천히이 단계에서 매우 섬세하고있는 형질 전환 된 세포와 혼합 할 수 있도록, 각 웰의 측면에 미디어를 추가합니다. 이 같이, 너무 빨리 미디어를 추가하지 마십시오크게 가능성을 감소시킨다. </li><li> 2 분 5 % CO 2와 37 ºC 배양기로 형질 전환 된 샘플 및 RPMI-1640 96 웰 플레이트를 놓고; 이 세포가 조작을 발전하기 전에 복구 할 수 있도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 신중 멀티 채널 피펫을 이용하여 96- 웰 조직 배양 플레이트에 각 웰로부터 혼합물을 전송. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각 웰에 예열 (37 ° C) DMEM + FBS 배지 100 μl를 추가합니다. </li><li> 24 ~ 36 시간 동안 5 % CO 2 37 ºC 배양기에서 샘플을 96- 웰 조직 배양 플레이트 (이 시간 범위는 일반적으로 잘 작동하지만, 개개의 siRNA를위한 정확한 타이밍을 최적화) 부화. </li></ol> LPS와 대 식세포의 7 자극 <ol><li> 24 ~ 36 시간 후 Nucleofection 배양 한 다음, 새로운 미디어에 LPS (또는 다른 PAMPs가)를 준비합니다. 모든 우물에 대한 충분한 신선한 매체를 준비합니다 (200 μL의 media / 웰의 96 웰 플레이트 플러스 피펫에 대한 약간의 추가). DMEM + FBS 20 ng를 / ml의 최종 농도 LPS를 희석. </li><li> 96- 웰 플레이트에서 조심 흡 미디어는 세포에 LPS를 함유하는 신선한 미디어를 추가. </li><li> 자극 후 여러 번 LPS 또는 다른 PAMPs가에 대한 응답을 모니터링합니다. 6 시간에는 IL-6, TNFα와 같은 사이토 카인에 대한 강력한 염증성 사이토 카인 응답을 생성하기에 충분하다. </li></ol> 8 대 식세포에서 유도 타고난 면역 반응, 유전자 넉다운,과 생존을 모니터링 <ol><li> LPS 유도 된 사이토 카인 생성을 모니터하기 위해, 96- 웰 저장 플레이트에 세포로부터 상등액을 피펫. 사이토 카인 생성 후 ELISA에 의해 측정 될 수있다. </li><li> 상등액을 제거한 후에, 형광 디 아세테이트를 사용하여 세포 생존을 모니터 (생균 셀룰러 에스 테라 제에 의해 절단 될 때,이 화합물은 형광성된다). T를 사용하여 세포 생존을 조절하는 유전자를 대상으로 s​​iRNA가를 확인그의 접근 방식. 주 : 제대로 수행 한 경우 형질 전환 과정 자체가 생존에 영향을 거의 미치지 않는다. <ol><li> (: PBS 100 최종 희석 1) 각 웰에 플루오 레세 인 디 아세테이트 (아세톤 5 ㎎ / ㎖ 주식을)를 추가합니다. </li><li> 다섯 분에 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션 한 후, 플레이트 판독기 (460 nm의 여기, 515 nm의 발광)를 사용하여 세포 내의 형광을 모니터링한다. </li><li> 선택 사항 : 우물의 형광 균일 성을 확보하기 위해, 예를 RIPA로 버퍼를 사용하여를 Lyse 세포; 일부 플레이트 판독기가 웰의 작은 부분만을 모니터링하도록 구성되므로 이것은 잘 균일 한 형광 신호를 제공한다; 세포가 균일하게 도금되어 있지 않은 경우, 플루오 레세 인 디 아세테이트는 부정확 한 판독을 줄 수 있습니다. </li></ol></li><li> 세포 생존을 모니터링하는 대신에, 부착 세포로부터 유래 된 RNA를 사용하여 넉다운 qPCR의 siRNA에 의한 유전자를 모니터링. <ol><li> 상등액을 세포로부터 제거 된 후, 광고 (상기 단계 8.1)를 용해에 직접 부착 세포 (용해 및 RNA의 보존에 사용되는) D RLT 버퍼. </li><li> 이러한 RNeasy 미니 키트로서 RNA 조제 키트를 사용하여 RNA를 분리하고, 유전자를 siRNA의 처리를 제어하는​​ 넉다운 대해 모니터링하는 유전자 특이 적 프라이머를 사용 qPCR에. 정상화 Βactin에 프라이머 또는 GAPDH를 사용합니다. </li></ol></li><li> 다른 대안은 선천성 면역 반응의 다른 측면을 모니터링 할 때, FITC 표지 된 E. 추가하여 대 식세포의 탐식 기능을 모니터링 직접 키트를 사용하여 접착 세포 상 대장균 입자. 몇 시간 밖에 소요 제조자의 프로토콜을 따라, 플레이트 판독기 또는 현미경을 사용하여 식균 흡수를 모니터링. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 문서는 론자, Inc.에서 후원

수많은 연구하는 개별 유전자가 쥐의 대 식세포에 siRNA를 표적이되어 발표되었다. 지질 - 매개 형질 감염이 개별적으로 대 식세포 세포주에 siRNA를 전달하기 위해 사용되었지만, 이러한 방법은 유전자의 유전자 생존 제한된 유전자 녹다운 및 변동에 미치는 잠재적 영향 겪는다. 중간 또는 높은 처리량 방식으로 유전자를 대상으로 사용할 수있는보다 강력한 분석을 개발하기 위해, 우리는 유전자 최저에 더 일관성과 생존에 제한 효과 (이보다 강력한 전시 Amaxa nucleofector 96 웰 셔틀 시스템을 사용하여, 기술을 최적화 시스템) 지질 중재 방법보다 더 비싸다. 많은 변수가이 절차를 최적화하기 위해 시험 하였다. 우리는 효율적으로 많은 다른 1 차 대 식세포로의 siRNA를 전달하기 위해 이러한 시스템을 사용할 수 있었다 대식 세포주 불멸 (이 Amaxa 96 웰 세포주 최적화 키트를 사용하여 필요로 경우에 따라). 내가N이 다른 마우스 대식 세포주 (RAW264.7, J774A.1 및 MH-S) 및 일차 전지와 예비 시...

이 프로토콜에서, 우리는를 사용하여 siRNA를 마우스 대식 세포주에서 유전자를 억제하고 선천성 면역 반응에 대한 이러한 치료의 효과를 모니터링하는 효율적인 방법을 설명한다. 이러한 절차는 중간 또는 높은 처리량 방식 RNAi의 스크린을 허용 96- 웰 포맷에서 수행된다. 감염에 응답하여, 인간은 즉각적인 선천성 면역 반응과 더 느리지 만 특정 적응성 면역 반응을 탑재. 이 빠른 선천성 면역 반응은 대 식세포 (1)을 포함하여 식세포 선천성 면역 세포의 모집 및 활성화를 포함한다. 클래식 활성화 대 식세포는 급성 염증 반응에 관여하는 항균 단백질과 화합물, 사이토 카인과 케모카인 및 현재 항원 2,3를 생산하고 있습니다. 또는 활성화 된 대 식세포는 허용 오차, 조직 복구를 유지, 면역 조절에 중요한 역할을하고, 4-8 상처 치유. 때문에 기능의 그들의 다양한의대 식세포는 죽상 동맥 경화증, 관절염, 암 (9)을 포함하여 다수의 질병에서 역할을 할 수있다. 따라서, 대 식세포의 연구는 질병 다양한 분야에서 오랫동안 연구의 핵심 영역이었다. 선천성 면역 반응에서 그 중요성에도 불구하고, 대 식세포와 함께 작동하도록 세포를 도전 할 수 있습니다. 특히, 관련된 독성 10,11없이 식세포 지질 시약을 사용하여 형질 전환을 효율적으로 얻는 것이 곤란하다. 또한, siRNA를 효율적 식세포로 전달되는 경우에도, 종종 넉다운 RNAi를 유도 유전자의 견고성 상당히 온건 할 수 있고, 유전자로 유전자로부터 변할 수있다. 이러한 기술적 과제를 극복하기 위해, 우리는 두 마우스 대식 세포주 RAW264.7 17 J774A.1 18 형질 감염 및 녹다운 기술 12-16을 최적화했다. 이 방법은 형질 전환을위한 Amaxa Nucleofector 96 웰 셔틀 시스템을 사용합니다; 이 시스템96- 웰 포맷 (19)에서 세포를 형질 감염 할 특수 시약 및 전기의 조합을 사용한다. 형질 전환에 따라, 우리는 방법 세포 복구 및 생존 능력을 극대화하기 위해 이후의 siRNA에 의한 유전자 최저을 극대화하기 위해 설명합니다. 이 접근 방법의 유용성을 설명하기 위해 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)로 이들 세포를 자극하고, 여러 가지 전 염증성 사이토 카인의 생산 수준에서의 선천성 면역 반응을 모니터링, 이들 대 식세포 세포주에 대한 siRNA의 전달을위한 프로토콜을 기술한다. 우리는 우리가 회원 LPS와 다른 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가)를 감지, 선천성 면역을 조절하는 수신자 같은 수용체 (TLR) 가족을 대상으로하는 샘플 데이터를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF 세포주 96-well nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 마우스 대식세포 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 마우스 대식세포 세포주</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon은</td><td>다양합니다. 유전자</td><td></td></tr><tr><td>비표적 대조군 siRNA 풀</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>전기천공을 위한 Block-iT 형광 올리고</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96웰 원형 바닥 멸균 플레이트(코팅되지 않음)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-6 듀오셋 ELISA 키트</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>마우스 TNF&알파; 듀오셋 ELISA 키트</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 디아세테이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>RLT 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant 식세포작용 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 rna 간섭을 사용하여

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

대식세포는 중요한 식세포 선천성 면역 세포입니다. 대식세포는 병원체를 만나면 항균 단백질과 화합물을 생산하여 병원체를 죽이고, 다양한 사이토카인과 케모카인을 생성하여 다른 면역세포를 모집하고 자극하며, 항원을 제시하여 적응면역 반응을 자극합니다. 따라서 RNA 간섭(RNAi)과 같은 기술로 대식세포를 효율적으로 조작할 수 있는 능력은 이 중요한 선천성 면역 세포를 조사하는 능력에 매우 중요합니다. 그러나 대식세포는 기술적으로 transfection이 어려울 수 있으며 비효율적인 RNAi 유도 유전자 knockdown을 나타낼 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 두 개의 마우스 대식세포 세포주(RAW264.7 및 J774A.1)를 siRNA로 효율적으로 transfection하는 방법을 설명하고 유전자 knockdown에 대한 siRNA의 효과를 극대화하는 절차를 설명합니다. 또한 설명된 방법은 96웰 형식으로 작동하도록 조정되어 중간 및 고처리량 연구가 가능합니다. 이 접근법의 유용성을 입증하기 위해 RNAi를 활용하여 리포다당류(LPS) 유도 사이토카인 생성을 조절하는 유전자를 억제하는 실험에 대해 설명합니다.

이 방법을 사용하여 형질 감염 효율을 입증하기 위해, 우리는 플로우 사이토 미터 (도 1)를 사용하여 FITC 표지 된 siRNA에의 흡수를 모니터링. 선천성 면역 반응을 모니터링하는 우리의 접근 방법의 유용성을 설명하기 위해, RAW264.7 대식 세포주에 공지 선천성 면역 조절 유전자를 타겟팅 된 siRNA를 형질 LPS로 세포를 자극 한 다음 - 염증성 사이토 카인의 생산을 모니터링 IL- 6, TNFα. TLR3 (22, 23)에 의해 인식 (C I) 다른 TLR에는 TLR4 (20)에 의해 인식 그람 음성균의 LPS와 같은 PAM3CSK4 등의 리포 펩타이드는 모방 폴리으로 바이러스로부터 TLR2 (21), 및 dsRNA에 의해 인식, 다른 PAMPs가 인식하고 있습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, TLR4 (그러나의 siRNA를 사용하지 다른 ...

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 RNA 간섭을 이용하여 후보 유전자가 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이를 위해 마우스 대식세포주를 트립신 처리한 후 transfection 용액 및 목적 siRNA와 혼합합니다. 이 혼합물을 96-well NucleoVet 플레이트로 옮긴 후, Maxa 96-Well transfection 시스템을 사용하여 대식세포에 siRNA를 도입합니다. 세포 배양 배지로 배양한 후, LPS 또는 기타 선천성 면역 활성화제를 transfection된 대식세포에 처리하여 자극을 줍니다. 마지막으로, ELISA를 수행하여 사이토카인 생성을 모니터링함으로써 siRNA 처리가 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 평가합니다.지질 매개 형질전환에 비해 이 기술의 주요 장점은 분석법이 견고하여 많은 유전자에 대해 고효율로 적용할 수 있다는 점입니다. 이 방법의 핵심은 건강한 세포를 사용하고, 세포를 조심스럽게 다루며, 형질전환 과정 동안 효율적으로 작업하는 것입니다. 시연할 내용과 같이, 본 프로토콜에서는 동봉된 문서에 설명된 방식대로 배양된 raw 2 64 0.7 마우스 대식세포 세포주를 사용합니다.INA 형질전환 플레이어를 준비하기 위해, 세포를 20% 밀도로 파종하고 세포 밀도가 80%를 넘지 않을 때까지 1~2일 동안 배양합니다. 계대 배양이 3회에서 10회 사이인 세포를 사용해야 한다는 점에 유의하십시오. 해동 후, 형질전환에 사용할 96-웰 셔틀 시스템을 프로그래밍하여 이 절차를 시작하십시오.이를 위해, 셔틀과 연결된 컴퓨터의 왼쪽 상단 파일 메뉴에서 96-웰 셔틀 소프트웨어를 실행하십시오. 새 파라미터 파일(new parameter file)을 선택하십시오. 화면에 표시된 96-웰 플레이트 도식에서 트랜스펙션할 웰들을 강조 표시하십시오.선택된 웰은 녹색 상자로 표시됩니다. Raw 264.7 세포에 사용되는 대식세포 세포주에 해당하는 프로그램을 선택하십시오. DS 1 36을 선택한 후 apply를 누르십시오.프로그램을 선택하면 도식화된 플레이트의 웰에 색상이 표시됩니다. 진한 파란색의 빈 원은 프로그램이 할당되지 않아 전기 충격이 가해지지 않는 웰을 나타냅니다. 다음으로, SF 세포주 96-웰 뉴클레오 이펙터 용액과 동봉된 보충제 튜브의 전체 내용을 혼합하여 작동 뉴클레오 이펙터 용액을 준비하십시오.혼합된 시약이 실온에서 평형을 이루도록 둡니다. D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTA와 PBS를 37 °C에서 가온합니다. 세포 배양 접시에서 부착성 대식세포를 떼어내기 위해, 실험용 S-I-R-N-A-P max GFP 대조군 플라스미드 또는 형광 표지된 siRNA를 얼음 위에서 해동하여 준비합니다.배지를 흡입하여 제거하고 10 milliliters의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그 다음 PBS를 제거하고, 세포가 떨어지기 시작할 때까지 플레이트당 1 milliliter의 예열된 0.25%trypsin EDTA를 넣어 세포를 배양합니다. 이 과정은 1분에서 2분 정도 소요됩니다.트립신화를 최대화하기 위해 배양 중에 플레이트를 가볍게 두드리고 용액을 움직여 줍니다. 세포가 탈착되면 DMEM 및 FBS 혼합액 9 mL를 파이펫팅으로 부드럽게 가감한 후, 멸균 튜브에 파이펫팅하여 세포를 수집합니다. Hema Cytometer를 사용하여 분리된 대식세포의 수를 측정합니다.10 centimeter 플레이트당 약 1,000만 개의 대식세포가 생성될 것으로 예상됩니다. 96-well 셔틀의 각 웰에 200,000개의 세포가 필요하므로, 필요한 대식세포의 총 수를 계산하십시오. 계산된 수의 세포를 원심분리 튜브에 피펫팅하여 옮깁니다.시약 손실을 최소화하면서 혼합을 용이하게 하는 멸균된 96-well 라운드 바텀 플레이트에 세포를 실온에서 150 G로 10분 동안 원심 분리합니다. 트랜스펙션할 각 웰에 각 siRNA를 2 µL씩 첨가합니다. siRNA의 수에 따라 이 과정은 대식세포 원심 분리 단계 중에 수행할 수 있습니다.이 실험 과정에서 가장 까다로운 부분은 전기천공법으로, 세포를 매우 조심스럽게 다루고 신속하게 작업하는 것이 핵심입니다. 세포가 독성이 있는 트랜스펙션 용액에 노출되면 영향을 받을 수 있으므로, 원심분리한 세포에서 배지를 흡입하여 제거한 다음 보충 용액이 포함된 nucleo effector solution SF에 세포를 부드럽게 재현탁하십시오.멀티채널 파이펫을 사용하여 세포를 즉시 멸균 트로프(trough)로 옮긴 후, 재부유된 세포 혼합물 20 µL를 siRNA가 들어 있는 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 파이펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 세포-INA 혼합물 20 µL를 96 웰 뉴클레오펙트(nucleofect) 플레이트로 옮깁니다. 이 단계에서 기포가 발생하면 뉴클레오펙션 과정 중 오류가 발생할 수 있으므로 기포가 생기지 않도록 주의하는 것이 매우 중요합니다.모든 실험 샘플을 transfection 플레이트에 넣은 후, 제공된 덮개로 덮고 단단한 표면 위에서 매우 가볍게 두드립니다. 기포를 제거하려면 96웰 플레이트를 96웰 nucleo effector 셔틀에 넣고, 프로그램 화면 우측 하단에서 upload 및 start를 선택하십시오. 그 후 프로그램 안내에 따라 nucleo affection 과정 중 성공적으로 완료된 웰의 결과를 저장하십시오.형질전환된 샘플은 화면의 96웰 도식에서 플러스 기호가 있는 녹색 원으로 표시됩니다. 마이너스 기호가 있는 빨간색 원은 핵산 도입 직후 기포가 발생했거나 시약을 잘못된 부피로 피펫팅하여 발생한 오류일 가능성이 높음을 나타냅니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 미리 데워둔 RPMI 1640 80 µL를 첨가하십시오.각 웰의 측면에 배지를 첨가합니다. 이 단계에서 형질전환된 세포는 매우 민감하므로, 배지가 세포와 천천히 섞이도록 합니다. 배지를 너무 빠르게 첨가하면 생존율이 크게 감소합니다.형질전환된 샘플과 RPMI 1640이 들어 있는 96-웰 플레이트를 5% CO2가 공급되는 37 °C 인큐베이터에 2분 이상 보관하십시오. 추가 조작을 하기 전에 세포가 회복될 수 있도록 하는 것이 매우 중요합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰의 혼합물을 96-웰 조직 배양 플레이트로 조심스럽게 옮기십시오.그 다음, 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 FBS가 포함된 DMEM 100 µL를 추가합니다. 형질전환 후 즉시 24~36시간 동안 배양하고, 회복 후 유세포 분석을 수행합니다. 형광 표지된 SI siRNA의 형질전환 효율을 평가할 때, 형질전환 다음 날 분석 시 세포의 99% 이상이 형질전환되어야 합니다. GFP 플라스미드의 형질전환 효율의 경우, 세포의 30~50%가 GFP를 발현해야 합니다. 24~36시간 배양 후, 신선한 배지에 LPS 또는 다른 선천 면역 활성제를 준비합니다. FBS가 포함된 DMEM에서 LPS를 최종 농도 20 ng/mL가 되도록 희석합니다.그 후 96-웰 플레이트에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하고, LPS가 포함된 신선한 배지를 세포에 첨가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 자극 후 다양한 시간대에서 LPS 또는 다른 선천 면역 자극제에 대한 반응을 모니터링합니다. 분석을 위해 세포의 상청액을 피펫으로 취하여 96-웰 보관 플레이트에 옮긴 후 Eliza로 분석합니다.세포 생존율을 모니터링하기 위해 상층액을 제거한 후, 각 웰에 PBS로 1:100 희석한 fluorescein diacetate 100 µL를 첨가하고 실온에서 1~5분 동안 배양합니다. 살아있는 세포 내의 세포 에스테라제(cellular esterases)에 의해 분해될 때 발생하는 세포의 형광을 플레이트 리더를 사용하여 모니터링합니다. 이 화합물은 형광을 띠게 되며, 이는 선천 면역 반응을 모니터링하는 데 있어 이 접근법의 유용성을 보여줍니다.알려진 선천성 면역 조절 유전자를 표적으로 하는 siRNAs를 raw 2 64 0.7 대식세포 세포주에 형질전환하였습니다. 그 후 세포를 LPS로 자극하고, 여기에 표시된 바와 같이 ELISA를 통해 전염증성 사이토카인인 IL six 및 TNF alpha의 생성을 모니터링하였습니다.LPS 수용체인 toll-like receptor four는 억제하지만, 다른 TLR은 억제하지 않습니다. SIR을 사용하여 LPS로 유도된 IL six 및 TNF alpha의 생성이 크게 감소했음을 확인했습니다. irna를 이용한 IL six 억제는 IL six 생성을 감소시켰으나, TNF alpha 생성에는 영향을 미치지 않았음에 유의하십시오.이러한 데이터는 선천 면역의 후보 조절 인자에 대한 siRNA 매개 넉다운의 우수한 효능과 특이성을 시사합니다. 성공적인 형질전환과 원활한 세포 회복을 위한 핵심은 매우 건강한 세포를 사용하는 것, 형질전환 및 회복 과정 동안 세포를 조심스럽게 다루는 것, 그리고 세포가 핵 작동 용액(nucleo effector solution)에 들어간 후 신속하게 작업을 진행하는 것임을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 따른 후, 유전자 넉다운을 모니터링하기 위한 QPCR 및 선천 면역 반응을 조사하기 위한 다양한 다른 분석들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 TLR(Toll-like receptor) 신호 전달을 억제하는 잠재적인 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하기 위한 리포터 세포 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 펩타이드-금 나노입자 하이브리드와 혼합된 지질다당류(LPS)를 리포터 단백질인 분비 배아 알칼리 인산가수분해효소(SEAP) 및 루시페라아제(luciferase)를 발현하는 리포터 대식세포에 도입하는 것을 포함합니다. 하이브리드에 의해 매개되는 LPS 유도 TLR 신호의 감소는 리포터 신호를 측정하여 결정됩니다.

톨 유사 수용체 신호 억제를 위해 생체 활성 나노 입자를 스크리닝하는 분석

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

피부 부상에 타고 난 면역 반응의 실시간 탐지 및 쥐의 포도 상 구 균 감염에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 비교 LysM EGFP 여 쥐 (형광 neutrophils 보유) LysM EGFP와 잡종 immunodeficient 마우스 스트레인, 우리가 미리 감염에 대 한 우리의 이해 및 감염을 방지 하는 방법의 개발.

마우스 모델을 평가 타고 난 면역 반응 포도 상 구 균 감염

대식세포, 특히 1차 대식세포는 비자기 기원의 분자를 검출하는 것을 전문으로 하기 때문에 트랜스펙트에 도전하고 있습니다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 능률적인 형질혈을 허용하는 프로토콜을 기술합니다.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

생체 내에서 대식세포 모집에 대한 케모카인의 효과를 시험하기 위해, 시투 혼성화에서 전체 마운트를 사용하여 케모카인의 자궁외 발현을 검출하고, 면역염색을 사용하여 대식세포에 라벨을 붙이도록 하였습니다. 라이브 이미징은 대식세포 이동의 실시간 관찰에 사용되었다.

생체내 대식세포 모집 테스트를 위한 자궁외 체모카인 발현 모델

이 프로토콜은 연구원에게 생체 재료 임플란트 미세 환경을 모델링하는 다양한 중합체 표면 및 흡착 단백질 층에 대응하여 뮤린 대식세포 세포주에서 TLR 의존적 NF-θB/AP-1 전사 인자 활성을 측정하는 신속하고 간접적인 방법을 제공합니다.

고분자 표면에 흡착 된 단백질 층에 유료 수용체 매개 NF-kB / AP-1 신호를 검사하는 대식 세포 분석

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

배우세요 마우스 대식세포에서 RNA 간섭을 활용한 선천성 면역 반응 연구 방법을. Amaxa Nucleofector 시스템으로 siRNA 전달 후 LPS 자극 및 사이토카인 분석을 수행합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

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