Name: 사전 mRNA의 기판의 3 끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석 시험관 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 전사 활성 핵 추출물과 방사성 표지 RNA 기판을 사용하여 시험관 내 mRNA 3' 말단 절단 반응을 분석하는 방법을. 이 기술은 RNA 성숙 메커니즘 연구에 필수적입니다.

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SV는 NIH K22AI077353 및 Landenberger 재단의 자금 지원을위한 감사합니다. KR은 기꺼이 NIH (5SC1GM083754)에서 자금을 인정합니다.

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

헬라 세포 핵 추출물 또는이 추출물로부터 분획 분열의 요인으로 수행 체외 사전 mRNA의 3 &#39;분열 반응은, 핵심 분열 요인과 그들의 주요 단지 16-21의 식별을 가능하게했다. 이러한 요인과 관련된 더 많은 단백질은 최근 22 확인 된, 그리고 생체 반응은이 단백질이 반응에 기여하는 방법에 있나을 계속할 수있다. 생체 내에서의 반응은 23 cotranscriptional 것처럼 보이거나, 몇몇 요인은 추출 및 투석 중에 손실 될 수 있기 때문에, 효율성은 종종별로없고, 거의 30 % 이상 분열이 달성 아마도 때문이다. 또한, 반응 효율이​​ 갑자기 아무 이유없이 매일 같이 떨어질 수 있습니다. 따라서, 단계 변경됨 또는 바이러스 성 감염 헬라 CEL에 대한 반응에 적응하려고 시도 할 때, 특히, 가장 중요한되는 감사하는 중요LS, 다른 종류의 세포 또는 새로운 기판에. <p class="jove_conte...

가장 성숙한 진핵 메시지 RNA를 (의 mRNA)의 생합성은 모자를 씌우는, 접합 및 폴리아 데 닐화 등 여러 가지 전사 후 수정이 필요합니다. 이러한 수정은 일반적으로 올바른 처리 한되도록 강하게의 mRNA의 안정성을 증가시키기 위해 결합된다. 3 &#39;포유류 사전의 mRNA의 최종 형성을 5 아데 닐 잔기 첨가하여 초기 RNA endonucleolytic의 절단에 의해 생성 된&#39;폴리 (A) 중합 효소 (PAP) 2-4해서 제품을 절단. 포유 동물에서, 분열 특정 사전 RNA 서열에 조립 약 800 kDa의,의, 다 성분 단백질 복합체에 의해 달성된다. 폴리 (A) 신호 순서, 고도 보존 정식 hexanucleotide 시퀀스 AAUAAA은 약 10 ~ 30 NT 하류의 절단 부위를 지시합니다. 이 사이트는 특히 절단 및 폴리아 데 닐화 특이 요인 (CPSF) 및 73 kD의 서브 유닛에 의해 인식CSPF는 효소의 활동이 포함되어 있습니다. 분열 자극 인자 (인 CstF)는 다운 스트림 폴리 (A) 사이트의 더 퇴화 GU-또는 U 풍부한 요소 순서를 결합한다. 또한 포유류의 분열 인자 I (CFIm), 및 포유류의 분열 요인 II (CFII)을 절단입니다이 필요합니다. CFIm 유전자의 수에 대해 정의하고 중요한 생리적 과정 5-8에 관여하는 것으로 보인다 된 상류 시퀀스 요소 (사용)에서 특정 UGUA (N) 사이트를 바인딩합니다. 시험관 내에서, RNA 프로세싱 반응은 일반적으로 방사성 표지 된 RNA 9-12 기판의 사용에 의해 분석된다. 이들은 박테리오파지 프로모터 T7 또는 SP6에서 실행 오프 전사에 의해 합성 될 수있다. 이전 특징으로되지 않은 폴리아 데 닐화 사이트를 연구 할 때, 중요한 하류 서열의 cDNA에 존재하지 않을 수도로서, RNA 기질을 생성하는 게놈 DNA가 아닌하는 cDNA를 사용하는 것이 필요하다. 적어도 150 NT를 upstrea를 포함하도록 설계 기판m 50 NT 하류 성숙한 mRNA의의 분열 사이트 / 끝에서. 분열 생성물은 기판보다 빠르게 마이그레이션; 다른 단편은 비특이적 핵산 분해 효소 작용에 의해 생성 될 수 있기 때문에, 반응의 특이성은 올바른 처리 신호 계열에 대한 의존도에 의해 확인되어야한다. 따라서, AAUAAA 순서 (예를 들면 AAGAAA)에 점 돌연변이를 가진 RNA의 기판 절단 반응에 대한 부정적인 제어 역할을합니다. 방사성 표지 된 RNA의 소량의 절단 반응에 사용되는 것을 감안할 때, 대부분의 핵 추출물에서 높은 풍부 본 RNases 문제가 될하고 추출물 제조를위한 출발 물질의 선택을 제한 할 수있다. 헬라 세포는 내생 RNases의 낮은 수준을 포함​​, 따라서 이러한 분석에서 잘 수행하는 경향이있다. 생체 내 및 시험 관내에서 RNA 기판의 endonucleolytic 분열은 바로 폴리 (A)뿐만 아니라, 목 뒤에있다의 쪼개진 중간이 검출 수량에 존재하지 않습니다. 따라서, 특정 RNA 서열 또는 절단 반응에 관여하는 단백질 중 하나를 연구하기 위해 실험을 발생 폴리아 데 닐화를 방지 조건에서 수행됩니다. 하나는 분열 반응을 해치지 않고 폴리아 데 닐화를 중지 할 수 있도록 더 폴리아 데 닐화에 분열의 의존성, 또는 그 반대는 없다. 따라서, ATP는 단일 염기는 폴리 (A) 위치에서 통합 될 수 있으며, 단지 절단 RNA를 검출 할 수 있도록 3 &#39;히드록시기 결여 사슬 종결 유사체로 대체된다. 복잡성과 분석이 유형의 특수성 높은 수준을 감안할 때, 우리는 체외에서 mRNA의 전구체의 절단 / 폴리 (A) 기계에 의해 endonucleolytic 분열을 공부 자세한 설명을 동영상 프로토콜을 설명합니다. 우리는, 관할 핵 추출물을 제조 방사성 표지 RNA 기질을 생성, 분열 반응을 수행하고, 그 결과를 분석하고 해석하는 방법을 설명보내고 제품.도 1은 분해 분석에 사용되는 HIV-1 이전의 mRNA의 3 &#39;말단에 대해 코딩하는 RNA를 기판의 일례를 나타낸다. HIV의 RNA 게놈의 3 &#39;말단은 예컨대 폴리 (A)의 사이트, G+ U 리치 영역 및 모든 바이러스의 mRNA 전 사체 (13)의 효율적인 숙성에 필요한 USE 소자 등 많은 중요한 조절 서열로 구성된다 . 이 예에서 우리는 입력 RNA 기판은 338 NT 및 분열 237에 NT 것으로 기대합니다. 폴리아 데 닐화이 발생하도록 허용 된 경우, 제품의 얼룩은 237과 437 NT 사이에서 관찰된다.

<table><tbody><tr><td>1L Celstir 플라스크</td><td>, Wheaton</td><td>356884</td><td>다양한 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>, 4단계 저속 교반기</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra x-15R(SX4500 로터</td></tr> 포함) <tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Optima L-100 XP Ultra(SW41 로터 포함)</td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Refridgerated</td></tr><tr><td>Thermomixer incubator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml 코니컬 튜브</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 코니컬 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ultraclear centrifuge 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK modified MEM</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>열 비활성화</td></tr><tr><td>L-glut:pen:strep</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>MP Biomedicals</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>: Alexis Biomedicals,</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr>, <tr><td>글리세롤</td><td>Fisher</td>, <td>BP229-4</td><td></td></tr>, <tr><td>5M 염화나트륨 용액</td>, <td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr>, <tr><td>EDTA 0.5M 용액</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr>, <tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr>, <tr><td>PMSF</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄</td><td>Fisher</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일 정제</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 투석 카세트 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>66372</td><td>MWCO 7,000 0.5 ml-3 ml</td></tr><tr><td>15 ml Dounce 티슈 그라인더 세트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td><td>다양한 크기 사용 가능</td></tr><tr><td>고충실도 PCR 키트 확장</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>10 mM 각 뉴클레오티드</td></tr><tr><td>MaxiScript SP6/T7 키트</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5') G RNA 캡</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Century Marker Template Plus</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&알파;-32P] 250 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 버퍼 II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Ameresco Life Sciences</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>Fisher</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40 % 19 : 1 아크릴 아미드 : 비스-아크릴 아미드</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐</td><td>Roche</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>100 % 절대 에탄올 200 증거</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>산성 페놀 : 클로로포름</td><td>Ambion</td><td>9720</td><td>RNA</td></tr><tr><td>섬광 유체</td><td>용 Fisher</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Rnase 억제제</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>폴리 비닐 알코올 - PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 인산</td><td>염 Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>조정 가능한 시퀀싱 장치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>바인더 클립</td><td>Office Depot</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20cm x 42cm 유리판</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>20cm x 22cm 유리판</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>20cm x 42cm 알루미늄 냉각판</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1</td></tr>개 <tr><td>0.4mm x 22cm 스페이서</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>0.4mm x 42cm 스페이서</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>8웰 빗</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1</td></tr><tr><td>개16-웰 콤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>32-웰 콤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>젤 반발 코팅</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>또는 SGR-0101 개별 병용</td></tr><tr><td>젤 로딩 팁</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0.1-10 &mu; l</td></tr><tr><td>시퀀싱 PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5,000 V / 500 mA / 400 W</td></tr><tr><td>젤 건조기 모델 583</td><td>Bio-Rad</td><td>모델 583</td><td></td></tr><tr><td>젤 건조기 용 Hydrotech 진공 펌프</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II 야광 마커</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>필름 8 x 10</td><td>Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>필름 14 x 17</td><td>Phoenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>자동 방사선 촬영 카세트</td><td>Fisher</td><td>FBCA 1417</td><td>8 x 10 크기 사용 가능</td></tr></tbody></table>

사전 mrna의 기판의 3 &#39;끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 rna 가공 반응 분석<em&gt; 시험관</em

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

포유 동물의 mRNA의 3 &#39;끝은 RNA 중합 효소 II (RNPII)에 의해 전사의 갑작스러운 종료에 의해 형성되지 않는다. 대신 RNPII 성숙 RNA를 끝 뒤 전구체의 mRNA를 합성하고, 효소 활성의 활성 프로세스가 특정 사이트에서 요구된다. 전구체 RNA의 절단은 일반적으로 CA 디 뉴클레오티드 후 합의 폴리 A 사이트 (AAUAAA)에서 다운 스트림 NT 10-30을 발생합니다. 절단 단지, 약 800 kDa의의 인성 단백질 복합체의 단백질이 특정 핵산 분해 효소의 활동을 수행. 특정 RNA 서열은 상류와 폴리 A 사이트의 하류 절단 단지의 모집을 제어 할 수 있습니다. 즉시 절단 후, 사전의 mRNA는 성숙 안정 RNA 메시지를 생산하는 폴리 A 중합 효소 (PAP)에 의해 폴리아 데 닐화됩니다. RNA 전 사체의 3 &#39;말단의 처리는 특정 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 기판으로 세포의 핵 추출물을 사용하여 연구 할 수있다. 요컨대, 긴 32 &lt;/ SUP&gt; P-표지 uncleaved 전구체 RNA는 시험 관내에서 핵 추출물과 함께 배양하고, 절단은 겔 전기 영동 및 오토 라디오 그래피에 의해 평가된다. 적절한 분열이 발생하면 &#39;5 짧은 제품이 감지 및 정량화 절단. 여기서는, 예를 들어, 사용 상세히 HIV-1의 mRNA의 3 &#39;말단 처리를 절단 분석을 기술한다.

RNA 폴리 (A) HIV-1의 사이트 (그림 2)의 분해 분석의 대표 결과. 우리는 젤의 상단에 가장 느린 이주 밴드 uncleaved RNA 기판을 관찰 할 수 있습니다. 구체적인 절단 된 제품은 빠른 예상 크기의 겔에서 실행 가장 강렬한 짧은 단편 밴드이며, 폴리 A 서열 (mutPolyA) RNA의 점 돌연변이를 포함 mutpoly (A) 제어의 분열 분석에서 특히 결석 기판. 입력 기판의 분해 생성물이 때때로 관찰된다. 분열 활성의 정량화는 uncleaved RNA의 100 %로 표준화 RNA 절단에 uncleaved의 비의 플롯 농도계에 의해 결정될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51309/51309fig1highres.jpg" width="600" /...

RNA 중합 효소 II는 성숙의 mRNA의 3 &#39;말단 확장되는 전구체 RNA를 합성한다. 성숙한 RNA의 끝은 절단 복합체의 효소 활동을 통해 RNA 염기 서열에 의해 결정 사이트에서 cotranscriptionally 생성됩니다. 여기에 세부 사항에게 체외에서 분열 반응을 연구하는 방법을 우리는.

사전 mRNA의 기판의 3 &#39;끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석<em&gt; 시험관</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 세 가지 주요 mRNA 절단을 인 비트로(in vitro)에서 성공적으로 조사하는 것입니다. 이를 위해 우선 부유 배양된 세포로부터 전사 활성이 있는 핵 추출물을 제조합니다. 절차의 두 번째 단계는 인 비트로 전사를 통해 방사성 표지된 RNA 기질을 만드는 것입니다.세 번째 단계는 표지된 RNA 기질을 겔 정제하는 것입니다. 마지막 단계는 핵 추출물과 표지된 RNA 기질을 포함하여 절단 반응을 조립하는 것입니다. 최종적으로 수직 방사성 겔 전기영동을 통해 세 가지 프라임 mRNA, 절단되지 않은 기질 및 절단된 생성물을 확인할 수 있습니다.이 방법은 1980년대부터 수행되어 왔음에도 불구하고, 절차 전반에 걸쳐 까다로운 세부 단계가 많아 실행이 쉽지 않으므로 시각적 시연이 중요합니다. 세척 및 원심분리 후 펠렛 상태가 된 세포를 준비하여 용해할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜을 시작하려면 세포 펠렛에 신선한 DTT가 포함된 버퍼를 첨가하십시오.추정된 CPV의 5배 부피를 추가하고 파이펫을 사용하여 펠렛을 분쇄한 후 현탁액을 얼음 위에서 냉각시킵니다. 10분 후, 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 세포를 침전시킵니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.펠렛은 일부 용액을 흡수하여 크기가 팽창했을 것입니다. 그다음 버퍼 A를 1 CPV 추가하고, 피펫 팁으로 펠렛을 부드럽게 풀어줍니다. 현탁액을 냉각된 균질기에 붓고, 밀착된 페스틀을 이용하여 5~12회 스트로크로 세포를 용해합니다.소량의 분취액을 덜어 tripan blue를 처리하고 세포를 관찰하여 용해 정도를 확인합니다. 필요한 경우 세포의 90%가 용해될 때까지 균질화를 계속하되, 과도하게 처리하지 않도록 주의합니다. 이제 용해물을 초투명 초원심분리기 튜브로 옮깁니다.총 부피를 기록하고 이전과 동일하게 원심 분리합니다. 탁한 상층액을 흡입하여 얼음 위에 보관하십시오. 세포질 분석을 위해 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하십시오.여기에 핵이 포함되어 있습니다. 다음으로, 펠릿을 고속에서 15분 동안 원심 분리합니다. 소량으로 남아 있는 상층액을 제거하고 이를 세포질 수집액과 합칩니다.그런 다음 PACT 핵 부피를 결정합니다. 펠렛에 버퍼 C를 동일한 부피만큼 추가합니다. 그 후 깨끗한 다운 호모게나이저에서 피펫을 사용하여 펠렛을 분산시킵니다.페스틀로 5~10회 강하게 갈아 펠렛을 재현탁합니다. 균질액을 냉

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 c​​rRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.

CRISPR / 카스 시스템의 Endonucleases을위한 기판 생성

여기에서는 자동화된 겔 시퀀서를 사용하여 생체 내에서 박테리아 전사체 및 RNA 처리에서 전사 시작점을 결정하기 위한 형광 기반 프라이머 확장 방법을 설명합니다.

형광 기반 프라이머 확장 기술은 전사 시작 포인트 및 RNases의 쪼개짐 사이트를 확인하는 생체

이 프로토콜 매핑 사전 mRNA 3' 최종 사이트를 처리 하는 방법을 설명 합니다.

3' 끝 시퀀싱 A seq2 라이브러리 준비

CDNA 끝 (3' 경주)의 두 개의 서로 다른 3' 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3' UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Botin streptavidin 전략을 사용 하 여 정화 RNA 또는 단백질 복합물은 eluted 더 정화와 기능 분석에 대 한 부적 절 한 형태로 변성 조건에서 솔루션. 여기, 우리가 네이티브 및 완전 한 기능 RNA 또는 단백질 복합물 저조한 RNA와 부드러운 UV 차입 단계 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여이 전략의 설명.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

여기서, 우리는 짧은 합성 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드 및 정제된 Pol II를 필요로 하는 RNA 폴리머라제 II(Pol II) 신장 복합체의 조립을 기술한다. 이들 복합체는 Pol II 신장 복합체와 관련된 전사체의 기본 공동 전사 처리를 연구하는 데 유용하다.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

우리는 13C/ 15N 라벨 및 1 H R1θ  이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.

Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석

배우세요 전사 활성 핵 추출물과 방사성 표지 RNA 기판을 사용하여 시험관 내 mRNA 3' 말단 절단 반응을 분석하는 방법을. 이 기술은 RNA 성숙 메커니즘 연구에 필수적입니다.

사전 mRNA의 기판의 3 '끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석

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