사전 mRNA의 기판의 3 '끝 분열 : 휴대폰 무료 시스템을 사용하여 RNA 가공 반응 분석 시험관

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro에서 3개의 프라임 mRNA 절단을 성공적으로 검사하는 것입니다. 이것은 먼저 현탁액에서 성장한 세포에서 전사 활성 핵 추출물을 만들어 달성합니다. 절차의 두 번째 단계는 체외 전사를 통해 무선 표지된 RNA 기질을 만드는 것입니다.

세 번째 단계는 표지된 RNA 기질을 겔화하는 것입니다. 마지막 단계는 핵 추출물 및 표지된 RNA 기질을 포함한 절단 반응을 조립하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 수직 방사성 겔 전기영동을 통해 3개의 프라임 mRNA, UNC 절단 기질 및 절단 산물을 보여줄 수 있습니다.

이 방법의 시각적 시연은 1980년대부터 수행되어 왔지만 절차 전반에 걸쳐 어려운 특정 단계가 많기 때문에 쉽게 실행되지 않습니다. 세포를 씻고 펠릿화하여 용해할 준비를 합니다. 셀 펠릿에 이 프로토콜을 시작하려면 새로운 DTT로 버퍼를 추가합니다.

추정 CPV를 5부피 추가하고 피펫을 사용하여 펠릿을 분해하고 현탁액을 얼음 위에서 식힙니다. 10분 후, 스윙 버킷에서 셀을 섭씨 4도에서 회전시킵니다. 원심분리기는 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.

펠릿은 일부 용액을 흡수하고 크기가 팽창했을 것입니다. 그런 다음 버퍼 A의 CPV 1개를 추가하고 피펫 팁으로 펠릿을 부드럽게 분해합니다. 현탁액을 식힌 균질화기에 붓고 5-12번의 스트로크로 단단한 절굿공이를 통해 세포를 만듭니다.

작은 부분 표본을 제거하고 트리안 블루를 바르고 세포를 검사하여 용해의 완전성을 확인합니다. 필요한 경우 90%가 용해될 때까지 세포를 계속 균질화하되 과도하게 사용하지 마십시오. 이제 용해물을 매우 투명한 초원심분리기 튜브로 옮깁니다.

총 볼륨을 기록하고 이전과 같이 회전합니다. 탁한 상층액을 흡인하여 얼음 위에 저장합니다. 그리고 세포질 분석의 경우 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.

그것은 핵을 포함합니다. 다음으로, 펠릿을 15분 동안 고속으로 회전시킵니다. 소량의 잔류 상층액을 제거하고 세포질 컬렉션과 함께 풀링합니다.

그런 다음 PACT 핵 부피를 결정합니다. 버퍼 C에 해당하는 부피를 펠릿에 추가합니다. 그런 다음 깨끗한 다운 균질화기에서 피펫을 사용하여 펠릿을 제거합니다.

유봉을 5-10회 꽉 조여 소생시킵니다. 펠릿을 현탁시킵니다. 균질산염을 냉각된 튜브로 옮기고 30분 동안 반전으로 혼합합니다.

섭씨 4도에서는 교반 플레이트를 사용할 수 있습니다. 부피가 충분히 크면 용해물을 UltraClear 초원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 스핀다운합니다. 대략 25, 000 gs에, 상등액은 핵 추출물이다.

텍스트 프로토콜에 따라 1마이크로그램의 템플릿으로 투석을 완료합니다. SP six 또는 T seven 호환 promoter가 포함된 키트를 사용하여 in vitro transcription을 통해 프로브를 준비합니다. 페이지를 로드할 때 각 RNA 기질에 대해 3마이크로리터의 마커와 25마이크로리터의 반응을 모두 사용합니다.

또한 유사한 크기의 전사체의 레인을 간격을 두어 교차 오염을 방지합니다. 600 뉴클레오티드 프로브가 약 2시간 후 25와트에서 실행되도록 겔을 실행합니다. 젤 밴드의 위치를 표시하려면 라이트 박스로 노출된 필름을 비추고 그 위에 감싼 젤을 얹습니다.

필름의 자동 rad 마커와 노출된 마커를 정렬합니다. 그런 다음 밴드 위치를 검은색 마커로 표시하여 밴드를 제거하고 젤을 풉니다. 그리고 깨끗한 칼날로 겔의 밴드 부분을 절제하고 각 섹션을 자체 튜브로 옮기고 표준 절차에 따라 RNA를 용리합니다.

모든 시약이 준비된 후 라벨링된 RNA를 섭씨 80도에서 2분 동안 가열합니다. 그런 다음 RNA를 10%PVA인 얼음 소용돌이로 옮긴 다음 몇 분 동안 고속으로 스핀다운하여 기포를 제거한 다음 각 반응에 대한 마스터 믹스를 만듭니다. 각 반응에 대해 5.25마이크로리터의 마스터 믹스 1개를 분배합니다.

다음으로, 6.25 마이크로 리터의 핵 추출물 혼합물을 첨가하십시오. 그런 다음 모두 50 아노 어금니로 희석된 표지된 RNA 기질의 마이크로리터를 추가합니다. 각 반응은 5개 미만의 아노 어금니 표지 RNA를 사용합니다.

이제 부드럽게 와류를 일으키고 반응 혼합물을 빠르게 회전시킵니다. 섭씨 30도에서 최대 2시간 동안 반응이 일어나도록 합니다. 반응의 시간 과정을 가지고 가는 것은 반응에 있는 단백질을 소화하고 그 후에 반응을 정제하기 위하여 proteinAse K를 사용한 후에 페놀 클로로포름 방법을 사용하여 제일 결과를 제공할 것입니다, 마커의 6%page 짐, 감적의 3 마이크로리터 또는 차선 당 반응 제품 당 5 마이크로리터에 제품을 밖으로 실행하십시오.

그런 다음 젤을 실행하고 나중에 젤 장치를 조심스럽게 분해하십시오. 젤을 모으려면 여과지를 단단히 누르고 뒤집습니다. 젤이 종이에 완전히 잡히도록 유리를 단단히 누릅니다.

그런 다음 젤이 부착된 여과지를 천천히 떼어냅니다. 젤의 노출된 면을 비닐로 감싸고 다른 면의 여과지에 테이프를 붙입니다. 젤을 건조기에 15분 동안 넣고 여과지가 진공을 향하도록 하여 마무리합니다.

나중에 겔을 필름이나 인광 이미저에 노출시켜 분석합니다. 쪼개진 자. RNA 기질은 겔 상단에서 가장 느린 이동 밴드입니다.

굵은 화살표로 표시된 특정 절단 제품은 예상 크기로 겔에서 더 빠르게 실행됩니다. 이 생성물은 pollier sequence에 점 돌연변이가 있는 대조군에 없습니다. 분할 활성의 정량화는 DS 메트릭 플롯으로 결정되었습니다.

된 RNA 대조군과 정규화된 RNA에 대한 절단된 RNA의 비율을 비교합니다. 이 절차에 따라 폴리아데닐화 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 polyA 중합효소의 활성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 분석은 마그네슘 첨가 및 EDTA 제거와 같은 반응 조건을 변경하여 수행됩니다.