해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

우리의 해마 CA1 영역과 슬라이스 tetanized 영역으로부터 핵 농축 분획의 분리 이후에 장기간 상승 작용의 유도에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 활성보기 학습 및 기억의 세포 모델에 의존하는 핵 단백질 수입을 결정하기 위해 사용될 수있다.

이 실험의 전반적인 목표는 뉴런 연결성과 기능이 잘 보존된 급성 해마 절편을 사용하여 단백질의 활성 의존적 핵 세포질 셔틀을 연구하는 것입니다.이 목표를 달성하기 위해 성인 수컷 쥐의 해마를 먼저 분리하고 두 번째 단계로 급성 횡단 절편을 준비합니다. 해마 절편은 기록 챔버로 전달되고 후기 형태의 LTP는 CA 1층 방사선 원자에서 유도됩니다. 다음으로, potentiated 및 control slice를 snap frozen하고, 추가 immuno blott 분석을 위해 nuclear enriched fraction을 분리하기 위해 자극된 ca one 영역을 절부합니다.

웨스턴 블로팅 분석(western blotting analysis)에 기초한 결과는 LTP 유도 후 30분 후에 강화된 슬라이스와 대조군 슬라이스 사이의 핵 인단백질 수치 차이를 보여줍니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 두 가지 이유로 어려움을 겪을 것입니다. 첫째, 조직 샘플의 양이 적다는 점, 둘째, 저장성 용해 완충액에서 샘플의 용해를 위해 반복되는 임계 기간으로 인해 핵이 방출될 수 있습니다.해마 생명 준비 및 C one 영역의 격리에는 빠르고 매우 정확한 해부가 필요하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요하지만 특정 트릭이 있습니다.

더 쉽게 하려면 해마의 C 한 영역에서 핵 농축 분획을 준비하기 위해 서면 및 시각화 지침을 모두 따라야 합니다. Lysis 절차 시연은 pinon Postal Laboratory에서 수행합니다. 그녀는 급성 해마 용해를 준비하고 LTP를 유도하는 방법을 보여줄 것입니다.

C를 해부한 후, 베라를 통해 한 지역 우리 연구실의 학생이 핵과 파괴를 분리하는 방법을 보여줄 것입니다. 쥐의 뇌를 분리하고 사전 탄산 얼음 콜드 게이즈 용액에 담그는 것으로 이 절차를 시작합니다. 다음으로 소뇌와 경장 피질의 일부를 제거합니다.

피질 반구를 중간 시상 절단으로 분리합니다. 그런 다음 각 반구의 등쪽 가장자리를 따라 50-70도로 자릅니다. 그런 다음 각 반구를 내측 표면에 놓고 각 반구를 비브라토의 슬라이싱 플랫폼에 새로 자른 표면으로 붙입니다.

그 후 pre carbogen ated ice cold gaze 솔루션으로 플랫폼을 덮습니다. 해마 형성, 하부 및 경장 피질을 포함하는 350 마이크로 미터 슬라이스를 vibram으로 앞쪽에서 뒤쪽으로 자릅니다. 그 후, 슬라이스를 U자형의 수중 유형 인큐베이터로 옮기고 섭씨 32도에서 탄산 A CSF로 최소 2시간 동안 배양합니다.

이제 해마 절편을 현미경에 장착된 수중 유형의 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스에 탄산 A CSF를 섭씨 32도에서 최소 30분 동안 분당 6밀리리터로 관류했습니다. 30분 후 유리 모세관 마이크로 전극에 CSF를 채웁니다.

자극을 위해 CA 1 Schaefer 담보 섬유에 마이크로 전극을 배치하고, 300 마이크로미터 거리에서 필드 EPSP를 기록하기 위해 ca 1 stratum ready atom에 다른 전극을 배치합니다. 그런 다음 위상 직사각형 전류 펄스로 3-4V를 Schafer 보조 파이버에 전달하여 필드 EP SSP를 불러옵니다. 입력 출력 관계를 측정하여 최대 자극 테스트를 수행하고 자극 강도를 최대 필드 EPSP 기울기 값의 40%로 정의합니다.

다음으로, 실험 전반에 걸쳐 1분마다 테스트 자극에 대한 반응을 측정하여 최소 15분 동안 기준선을 기록합니다. 후기 LTP를 유도하려면 고주파 테인을 적용하여 ca one region에서 유발된 필드 EPSP를 증가시킵니다. 테틴 2분 전에 A CSF에 COE로 5마이크로몰을 바르고 마지막 파상풍 직후에 씻어냅니다.

녹음을 중지합니다. 후기 LTP 유도 후 2분 또는 30분 후에 전극을 제거하고 슬라이스를 드라이아이스에 놓인 미리 냉각된 금속 플랫폼으로 빠르게 옮깁니다. 그런 다음 각 조각을 1.5 밀리리터 엔드 오브 튜브에 모아 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

이 단계에서는 섭씨 영하 80도의 냉동 조각을 꺼내 얼음 위에 보관합니다. 프로테아제와 인산가수분해효소 억제제가 함유된 0.5ml의 신선한 저온 TBS 완충액을 튜브에 추가합니다. 실체 현미경으로 옮기기 전에 2-3분 동안 배양합니다.

다음으로, 한 바늘로 절편을 잡고 다른 바늘로 CA 한 부위를 절단하여 해마의 CA 한 층을 해부합니다. 그런 다음, 그룹당 5개 슬라이스에서 절개된 ca one 영역을 50마이크로리터의 용해 완충액이 들어 있는 새로운 1포인트 밀리리터 튜브에 수집합니다. 그런 다음 200마이크로리터 피펫으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 수집된 조직을 균질화합니다.

세포가 부풀어 오를 수 있도록 얼음 위에서 5-7분 동안 용해물을 배양합니다. 그 후, 2 마이크로 리터의 용해물을 가져 와서 현미경 슬라이드에 떨어 뜨립니다. 명시야 현미경으로 세포의 팽창을 시각화합니다.

핵은 적절하게 팽창 된 둥글고 손상되지 않은 구조로 나타납니다. 이제 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 20 마이크로리터의 시료를 균질화 분획으로 수집합니다. 8마이크로리터의 변성 4개의 XSDS 샘플 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 1100 RCF에서 1분 동안 남은 용해물을 원심분리합니다. 1분 후 위에서 상층액을 조심스럽게 모아 새 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 20마이크로리터의 4개 x 샘플 버퍼를 추가합니다.

그런 다음 펠릿을 60마이크로리터의 저장성 완충액에 재현탁시키고 20마이크로리터의 4개 x 샘플 완충액을 추가합니다. 이 분획을 핵 농축 분획이라고 합니다. homogenate, cytosolic 및 nuclear 농축 분획을 섭씨 음의 20도 또는 섭씨 음의 80도에서 보관하십시오.

나중에 면역 블롯팅을 위해 이 절차에서 샘플을 해동하고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓인 후 균질화, 세포질 및 핵 농축 분획에서 동일한 양의 단백질 샘플을 AM 미토 블랙 테스트 또는 BCA 테스트 부하로 단백질 농도를 측정합니다. SDS 페이지에서 대조군 및 LTP 슬라이스의 겔 샘플을 웨스턴 블롯에서 직접 비교하기 위해 동일한 겔에 배치해야 합니다. 이 그림은 cytosolic 및 nuclear marker로 조사된 ca one lysate의 homogenate, cytosolic 및 nuclear enriched fraction에 대한 면역 블롯을 보여줍니다.

본 검사는 테인 유도 후 2분 및 30분 후 균질산염 내 PJS 180 수치에 대한 면역 블롯 분석이며, 핵 농축 분획 내 PJS 180 수치에 대한 면역 혈액 분석입니다. 주입 2분 및 30분 후, phospho Jacob 수치는 총 CA 1 단백질 균질화와 핵 농축 분획에서 2분 후에 변경되지 않은 상태로 유지되었습니다. 그러나 LTP 유도 30분 후 p Jacob, S 180 면역 반응성에서 상당한 증가가 발견되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 적절한 양의 저장성 용해 판막을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 샘플의 용해를 위한 중요한 시간 프레임을 표준화해야 합니다. 특히, 해마 이외의 쥐 또는 쥐 뇌 조직 샘플에서 핵 및 분획을 분리하기 위해 이 방법을 적용하는 경우 이 절차에 따라 OTP 유도 후 핵으로 가져온 후보 단백질에 대한 항체를 이용한 상보적 면역 염색과 같은 다른 방법이나 활성 형태의 키나아제 또는 인산가수분해효소와 같은 신호 분자가 이러한 결과를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

추가 질문에 답하기 위해 약물 치료를 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 시냅스 핵 단백질 meers의 전좌에 어떤 신호 캐스케이드가 관여하는지 또는 핵 기능에 어떤 영향을 미치는지. 또한, 해마와 관련된 질병에서 시냅 핵 메신저 단백질의 역할을 연구할 수 있습니다.

예를 들어, 알츠하이머병이 있습니다.