에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석

이 실험 절차의 전체적인 목적은 신속하고 정량적인 인비트로(in vitro) 방법을 사용하여 혈관 신생에 관여하는 유전자 또는 경로를 결정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 분석 전날 일차 배양 또는 불멸화된 혈관 내피 세포를 혈청 기아 상태로 만듭니다. 두 번째 단계는 혈관 내피 세포를 calcine과 함께 30분 동안 배양한 후, PBS로 세포를 세척하는 것입니다.

다음으로, 혈관 내피세포를 트립신 처리하고 필터링하여 덩어리를 제거한 뒤 세포 수를 측정합니다. 마지막 단계는 가능한 혈관 형성 인자가 포함된 조건 배지와 혈관 내피세포를 혼합하여 응고된 기저막 추출물 위에 분주하는 것입니다. 최종적으로 광학 또는 형광 현미경을 사용하여 튜브 네트워크를 시각화하며, 이는 전문 컴퓨터 프로그램을 통해 정량화할 수 있습니다.

혈관 신생을 분석하는 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 설정이 쉽고 비용이 상대적으로 저렴하며, 수 시간 내에 관 구조를 형성하여 정량화가 가능하다는 점입니다. 이 기술을 시연하는 사람은 American University 생물학과 대학원생인 Erica Bullwinkle입니다. 최적의 결과를 얻기 위해, 분석 시작 2일 전에 적절한 배지를 사용하여 three B 11 세포를 새 플라스크로 옮기십시오. 세포는 계대 배양 2~6대 사이일 때 사용하는 것이 좋습니다.

다음으로, 보충된 dmm에서 세포를 24시간 동안 배양합니다. 세포가 준비되면 혈청 기아 상태로 만듭니다. 배지를 저혈청 배지로 교체하여 혈청 기아 세포를 추가로 24시간 동안 더 배양합니다.

최상의 결과를 얻으려면 BME 스톡 솔루션의 농도가 10 mg/mL인지 제조업체를 통해 확인하는 것이 중요합니다. 환원 성장 인자 BME를 냉장고에서 해동하십시오. BME는 온도가 높아지면 응고되므로, 사용 전까지 차갑게 보관해야 합니다.

다음으로 형광 또는 공초점 현미경 시각화 분석에 필요한 배지를 해동하고, 최종 농도가 2 µg/mL가 되도록 Calcein AM을 배지에 첨가합니다. Calcein AM이 표지된 세포를 약 30분에서 45분 동안 암소에 둡니다. 이 시간이 지나면 배지를 제거하고 3B11 세포를 DPBS로 세척합니다. 다음으로 1 mL의 Trypsin-EDTA를 첨가하여 세포를 트립신 처리합니다. 트립신 처리가 완료되면.

세포를 최종 부피 10 milliliters가 되도록 재현탁합니다. 보충제가 첨가된 dmm에서 100 micrometer 세포 스트레이너로 여과하여 세포 덩어리를 제거합니다. 세포 수를 측정한 후, 튜브 형성 분석을 시작하기 위해 세포를 정확한 최종 농도로 재현탁하여 냉각합니다.

로딩 20~30분 전에 24웰 플레이트와 1mL 팁을 준비합니다. 이는 파이펫팅을 시작할 때 BME가 조기에 응고되는 것을 방지하기 위함입니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 환원 성장 인자가 포함된 BME 250 µL를 파이펫으로 분주합니다. 이때 파이펫을 끝까지 누르지 않도록 하여 기포가 생기지 않게 주의하십시오.

피펫팅을 할 때, 웰에 시료를 채운 후 웰 중앙에 충분한 양의 BME가 남아 있는지 확인하십시오. 메니스커스가 형성될 때 매트릭스가 너무 얇으면 세포가 단층으로만 형성됩니다. 그런 다음, BME를 응고시키기 위해 플레이트를 30분 동안 배양하십시오.

BME가 응고되면, 조건 배지 약 300 µL와 재현탁된 three B 11 세포 10 µL를 혼합하고, 이 세포 현탁액을 플레이트의 웰에 분주합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣으면 2~4시간 이내에 튜브가 형성되기 시작합니다. 조건 배지 내의 혈관신생 인자 농도에 따라 최대 튜브 형성은 3~12시간 사이에 일어날 수 있습니다. 분석 시점은 개별 연구 조건에 맞게 최적화해야 합니다.

튜브는 대개 18시간 이내에 퇴화하기 시작하며, 튜브 형성의 정점 단계에서 내피세포의 세포사멸(apoptosis)이 일어납니다. 튜브 네트워크가 파괴되지 않도록 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오. 그다음, 즉각적인 시각화를 위해 각 웰을 1 mL의 DPBS로 세척하십시오.

각 웰에 신선한 DPBS 1 mL를 추가하고, 이후 시각화를 위해 관 네트워크를 고정하고자 공초점 현미경으로 관 네트워크를 촬영합니다. 흡입된 각 웰에 4% 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 파라포름알데히드를 제거한 후 DPBS로 2회 세척하고, 다시 각 웰에 신선한 DPBS 1 mL를 추가합니다. 이 이미지들은 마우스 각질 형성 세포 또는 섬유아세포에서 분비된 혈관 형성 인자가 관 형성을 유도할 수 있음을 보여줍니다.

시간이 지남에 따라, 내피세포는 플레이팅 후 1~2시간 이내에 이동하여 작은 분지들을 형성하기 시작합니다. 최대 관 형성(tube formation)은 4~6시간 후에 도달하였습니다. 24시간이 지나자 일부 분지는 남아 있었으나, 많은 세포가 세포사멸(apoptotic) 상태가 되었고 관들이 끊어지기 시작했습니다.

세포 수는 관 형성(tube formation)에 지대한 영향을 미칩니다. 충분하지 않은 수의 세포를 분주하면 관이 거의 형성되지 않고 네트워크가 최소화되는 반면, 더 많은 세포를 분주할수록 관 네트워크가 더 광범위해집니다. 하지만 농도가 너무 높으면 세포가 뭉치거나 단층(monolayers)을 형성하기 시작하여 처리군 간의 차이가 가려질 수 있으므로, 적절한 관 형성을 보장하기 위해 세포는 최소 2회 이상의 계대 배양을 거쳐야 합니다.

B 11의 성장 속도는 매우 빨라, 세포의 25%를 계대 배양한 다음 날이면 플라스크가 완전히 충전(confluent)됩니다. 여기서는 calcine AM 염색된 관 네트워크에서 전체 노드, 망 형태의 결합 튜브 및 네트워크 상의 병합된 부분을 검출하기 위해 angiogenesis 플러그인이 설치된 image J를 사용합니다. 또한, 이 프로그램을 사용하여 노드, 튜브 또는 망을 개별적으로 검출하고 정량화할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 일반적인 실수들을 방지하면서 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 in vitro 혈관 신생 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.