Name: 셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 식물 조직의 기계적 특성을 원자력 현미경으로 매핑하는 방법을. 세포벽의 탄성을 조직, 세포 및 세포 이하 해상도에서 분석하여 식물 발달과 형태 발생을 연구할 수 있습니다.

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우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 &#39;&#39; &#39;&#39; Growpec, &#39;&#39;과 &#39;&#39; Mechastem를 투영합니다.

1. 샘플 장착 용 유리 슬라이드를 준비합니다 <ol><li> 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA 준비 : 10 % 만니톨 (물)의 0.7 % 저 융점 아가. </li><li> 강한 금속기구 (예를 들면 드릴 팁, 라임)을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중심에 0.5 × 0.5 cm의 영역을 에칭. 또는 그 대신, 아랄 다이 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 유리 라멜라 (약 20 × 200 ㎛)의 작은 조각을 접착제. NOTE :이되도록하여 아가로의 부착을 용이하게하기 위해 표면을 거칠게하는 슬라이드 아가 미디어 스틱 또는 수정. 이 슬라이드는 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 유리 슬라이드의 에칭 지역에 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA의 약 20 μL의 방울을 배치합니다. 따라서, 아가 로스의 박막을 준다. </li><li> 습기가 상자에 유리 슬라이드를 저장하고 아가 로스 미디어가 응고 될 때까지 기다립니다. </li></ol> 2. 분열 조직 샘플을 해부 및 설치 <ol><li> 공 초점 이마 기위한 Microdissect 분열 조직NG : 초 미세 핀셋을 아래로 당겨서 줄기에서 꽃 봉오리 하나 하나를 제거합니다. 그것은 (P1 원기 14 즉) 꽃받침 잎을 나타내지 않는 꽃 봉오리에 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 면도날이나 핀셋의 끝 부분을 사용하여, 멀리 줄기에서 분열 조직을 잘라. 컷은 AFM으로 측정한다 분열 조직 표면의 영역에 평행해야한다. 얻어진 정점은 300 μm의 AFM 팁 아래에 맞게 높은 600 μm의 사이에 있어야한다. </li><li> 단계 1.1.4에서 준비 아가로 오스 미디어의 영화로 정점을 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 / 아가로 오스의 위치를​​ 선택하고 분열 조직은 유리 슬라이드에 접촉 직접적이며, 아가로 오스에서 밖으로 돌출 부드럽게 등을 밀어 넣습니다. 그것은 줄기에서의 컷을 따라 몇 초 내에 아가로 오스의 분열 조직의 위치를​​ 매우 중요합니다. NOTE :이 건조로부터 분열을 방지하기 위해서이다. 이 단계에서, 분열 조직은 CRAC 서한다아가로 오스는 압력의인가시 골절 때문에 K. </li><li> 그들은 같은 높이의이고 하나의 슬라이드에 서로 미만 500 μm의 위치하도록 제공하고, 여러 분열 조직에게 일괄 이미징이 방법을 준비합니다. 추가 샘플을 해부하는 동안 습기 상자에 준비 분열 조직을 유지. 참고 : 교정에서 오는 변화를 제한합니다. 각 조건의 적 2 샘플을 준비하고 무작위로 측정 할 수있다. 지금까지 측정 (스트레스 유발 응답)에 배치 영상의 더 관찰 된 효과가 없습니다. 이 한천 및 / 또는 설치 솔루션 스트레스 신호 전달 분자의 희석에 대한 감사가 될 수 있습니다. 대안 적 스트레스 반응에 관계없이 제조 된 샘플의 양과 동일하다. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 분열과 꽃 봉오리의 경계가 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과잉의 물을 제거한다. 이것은 녹은 다음 단계에 방지해야아가로 인해 모세관 힘에 샘플을 홍수. </li><li> 20 μL 피펫으로 충분히 추가 단계 1.2.3에서 생성 된 균열을 채우기 위해 아가로 오스 장착 녹아있다. 각 분열 조직을 둘러싸. 아가로 오스가 제거 된 꽃 봉오리 (primordium)의 흉터의 수준에 도달해야한다. 이것을 달성하기 위해서는, 균열의 각 단부에 아가 로스를 첨가 할 필요가있을 수도있다. </li><li> 아가 로스를 첨가되면 신속 균열로 범람 할 것이다; 피펫을 사용하여, 분열 조직 슬라이드의 가장 높은 지점에 있는지 확인하는 아가로 오스 장착 용융의 일부를 빨아. 이 영상 중에 이동할 수 있도록이 분열을 해결합니다. </li></ol> 3. 설치 루트 또는 배축 샘플 <ol><li> 뿌리와 배축의 경우, 절개가 필요하지 않습니다. 제조 된 유리 슬라이드에 아가로 오스의 박막에서 직접 유리에 에칭 위 또는 유리의 얇은 판을 따라 하나 홈을합니다. 그것과 접촉하는 것을 보장이 홈에 루트 또는 배축을 놓고그것의 전체 길이를 따라 유리. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 샘플 표면에 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과량의 물을 제거한다. </li><li> 추가 단계 1.2.6에서와 같이 시료의 주위에 아가로 오스 장착 녹아있다. </li></ol> 4. AFM 준비 및 감도 교정 (JPK Nanowizard AFM 용) <ol><li> AFM의 캔틸레버를 탑재합니다. 캔틸레버는 둥근 모양 인 덴터에 장착해야합니다. 반경은 X, Y, Z의 해상도와 정확한 측정이 보관 될 수있는에 압입 깊이를 결정합니다. <ol><li> 표피의 표면에서 메조 나노 측정을 수행하려면, 50 nm의 반경 라운드 압자를 사용; , 중규모 측정을 0.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용하는; (2 ~ 3 세포를 통해) 마이크로 측정을 위해, 2.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용합니다. </li></ol></li><li> 캔틸레버의 끝에서 레이저의 위치. 중간에 레이저를 맞 춥니 다미러를 사용한 포획의. </li><li> AFM에서 깨끗한 유리를 배치합니다. NOTE : 다음은 캔틸레버의 변형에 AFM 수용체에 레이저의 위치 신호를 변환하도록 설정하고, 강제로 번역하기 위해, 캔틸레버의 스프링 정수를 평가하는 것이다. </li><li> 1 V.의 목표 힘 &quot;세트 포인트&quot;로 접근 </li><li> &quot;힘 분광&quot;를 선택합니다. 2 V에 최대 &quot;상대 세트 포인트&quot;를 설정하여 들여 쓰기를 수행, 40 μm의 / 초에 &quot;속도를 확장&quot;, 5 μm의 &quot;Z 길이&quot;. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 &quot;적합 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 감도에 맞게 앞으로 곡선의 선형 부분을 선택합니다. &quot;상대 세트 포인트&quot;는 &quot;m&quot;에 &quot;볼트&quot;에서 변형되어야한다. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 엘에게 평가하는 &quot;스프링 상수&quot;를 선택열적 변동을 이용하여 캔틸레버의 asticity. 캔틸레버의 스펙트럼 밀도 플롯을 얻기를 눌러 &quot;실행&quot;. 가장 낮은 주파수와 공진 피크를 찾을 수 있습니다. &quot;맞는 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 장착합니다. 주 1 :. 열 변동 조정에 대한 자세한 내용은 쿡 등 15 읽기 NOTE 2 : 이것은 (알려진 또는 강성 소재) 참조 캔틸레버를 이용하여 캔틸레버의 탄성을 평가하는 직접적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용 된 하나 친절하게 테프 Asnacios (16)에 의해 기증되었다. </li><li> 캔틸레버 끝에서 10 % 만니톨 용액 200 μl를 추가합니다. 미러를 사용한 포획의 중앙에 레이저를 재조정. </li><li> 감도를 재 보정 : &quot;교정 관리&quot;메뉴에서, &quot;알 수없는&quot;버튼을 클릭; 반복 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다. </li></ol> . 5 데이터 수집 : 명백한 영률지도 제작 <ol&gt; <li> AFM 아래에 장착 된 샘플의 위치를​​ 샘플에 10 % 만니톨 용액 500 μL 방울을 추가합니다. 만니톨 용액 분 이내에 세포를 plasmolyzes. </li><li> 20 윈의 목표 힘 ( &quot;지점을 설정&quot;)에 접근 ( &quot;설정 포인트는&quot;3 개 이상 V이어야한다) </li><li> 200 윈의 &quot;상대 세트 포인트&quot;와 들여 쓰기, 40 μm의 / 초 &quot;속도를 확장&quot;, 5 ㎛, &quot;Z 길이&quot;. </li><li> 캔틸레버 또는 1 μm의 / 5 μm의 장착 캔틸레버 0.5 μm의 장착 뉴 멕시코 200 100 ㎚의 들여 쓰기를 얻기 위해 &quot;상대 설정치를&quot;조정합니다. </li><li> , 분열 조직을 위해, 해상도 64 X 64 ( &quot;픽셀&quot;)와 70 μm의 X 70 μm의 &quot;힘 매핑&quot;모드에서 스캔 할 영역을 선택 배축과 뿌리, 64 X 64의 해상도와 100 μm의 × 100 μm의. </li><li> 를 눌러 실험을 시작하기 위해 검사합니다. 출력을 저장합니다. </리&gt; </ol> . 6 데이​​터 분석 : 명백한 영의 계수 계산 <ol><li> 데이터 분석 소프트웨어로 데이터 파일을 연다. </li><li> 단일 맵의 모든 곡선에 같은 분석을 적용하는 &quot;일괄 처리&quot;를 선택합니다. </li><li> 그래서 압입 깊이를 추출하는 &quot;캔틸레버의 휨의 높이를 수정&quot;을 선택합니다. </li><li> 힘이 들여 쓰기의 영역에 비례 가정합니다 &quot;탄성 계수 맞는 기능&quot;을 선택합니다. 들여 쓰기 형태가 포물선이라고 가정 할 포물선하기 위해 &quot;팁 모양&quot;을 설정합니다. </li><li> 팁의 반경을 나타냅니다. </li><li> 는 &quot;확장&quot;곡선보다 지형에 덜 민감하기 때문에 우선적으로 분석을위한 &quot;후퇴&quot;커브를 선택합니다. 프로브의 중요한 고집이 동안이 경우, &quot;후퇴&quot;고집에 민감하다 &quot;확장&quot;곡선을 사용합니다. </li><li> 세트0.5 포아송 비. 눌러에서 분석하고 결과를 저장합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는​​ 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에​​ 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과학자에 강한 관심을 끌 수있을 것입니다. 우리는 지금 문제 및 제한 방법, 그리고 미래의 전망을 요약합니다. 프로토콜에서 가장 어려운 단계는 샘플 준비입니다. 이 샘플은 단단히 아가로 오스와 유리 슬라이드에 고정해야하지만,이 아가 로스를 측정 할 수있는 샘플의 모든 영역을 커버하지 않아야합니다. 미묘 건조를 방지하기 위하여 조직의 손상을 방지하기 위해 한층 제제 (분 이내) 충분히 빠르게 완료 할 수있다 : 부상차 가뭄은 셀 벽 (18)의 기계적 특성에 돌이킬 수없는 변화로 이어질 것으...

식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는​​ 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는​​ 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다. 원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다. 우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다. 영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 &quot;명백한 젊은 계수&quot;의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>모든 3 세대는 동일한 사전 설정으로 작업을 수행 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>AFM 스테이지</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>낮은 지형(11 &마이크로; 힘 스캐닝 영역에서 가장 낮은 지점과 가장 높은 지점 사이의 m).</td></tr><tr><td>AFM 광학</td><td>JPK</td><td>평면도 광학 샘플을</td><td>배치하는 데 매우 중요합니다. 장거리 쌍안경이나 현미경으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>모든 유형의 실체 현미경이 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>150nm 장착 캔틸레버</td><td>나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>R150-NCL-10</td><td>표피 표면의 세포벽만 측정합니다.</td></tr><tr><td>1 &마이크로; m 장착 캔틸레버</td><td>나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>표피 표면에 직교하는 세포벽의 역학을 측정합니다.</td></tr><tr><td>팁리스 캔틸레버</td><td>나노 센서 Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland</td><td>TL-NCH-20</td><td>조직의 국소 역학을 측정하려면 (2-3 세포 넓이) 5 &micro를 사용하십시오. M 장착 캔틸레버. 우리는 5 &micro를 부착했습니다. m 붕규산 비드를 팁리스 캔틸레버로.</td></tr><tr><td>5 &마이크로; m 실리콘 미세구</td><td>미립자</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, France</td><td></td><td>팁이 없는 캔틸레버에 비드를 고정하기 위한 Araldite.</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>피셔 사이언티픽 페어 잔디밭, 뉴저지 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176; C 겔화 온도</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 스테인레스 스틸 No. 5 핀셋</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

셀 벽의 탄성 특성의 afm 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여. 다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 <em&gt; 세포 이하의 해상도에서와 조직을 포함하는 수백 개의 셀에 걸쳐 즉. 이 때문에 공간적, 시간적으로 성장 및 분화와 상관되는 이러한 변경을 가능하게 개발 중에 셀 벽의 기계적 특성에서 일어나는 변화를 특성화하는 것이 가능하다는 것을 의미. 이 조정 미세한 세포 변화가 거시적 인 형태 발생 이벤트를 가져올 방법을 이해하는 중요한 단계를 나타냅니다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.

그림 1에서 우리는 꽃 분열 조직의 전형적인 젊은 계수 맵 (그림 1A 및 1B), 젊은이와 노인 배축 (그림 1C-F), 및 루트 분열 조직 (그림 1G 및 1H)를 제시. 모든 실험에서 압자는 반구형이지만, 다른 공간 해상도를 달성 할 수 있도록 그 반경이 다른 1C 및 1D는 메조 나노 압입 (50 nm의 깊이)과 메조 나노 인 덴터 (50 nm의 반경)에 대한 전형적인 결과를 보여준다.; . cartographs이 배축 표피 세포의 표면 세포 벽에있는 마이크로 이질성을 공개 1A, 1E, 그리고 1G 피규어 꽃 분열 조직, 배축 및 루트 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 중규모 압자 (5...

원자력 현미경(AFM)을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 방법을 설명합니다. 우리는 식물 발달 중 세포벽에서 발생하는 기계적 변화를 광시야 중간 규모로 기록하여 이러한 변화가 성장 및 형태 형성과 상관 관계가 있을 수 있도록 하는 방법에 중점을 둡니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 원자 힘 현미경을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 것입니다. 먼저, 슬라이드의 에칭된 영역에 저융점 aros 한 방울을 피펫팅하여 얇은 aros 필름을 형성함으로써 유리 슬라이드를 준비합니다. 두 번째 단계는 샘플을 절개하여 고정하는 것입니다.줄기에서 꽃눈을 제거하고, 줄기에서 marris stem을 절단한 후, 절단된 me stem을 유리 위의 얇은 Agros 필름에 즉시 매립합니다. 다음으로, Maris stem이 Aros 필름에 매립될 때 발생한 틈을 메울 수 있도록 충분한 양의 녹은 mounting agros를 추가합니다. 마지막 단계는 데이터 수집을 위해 원자 힘 현미경(atomic force microscope)을 설정하는 것입니다.궁극적으로, 데이터 분석과 세포벽의 겉보기 영률(Young's modulus) 측정은 세포하 해상도와 조직의 전체 영역에서 동시에 세포벽 특성의 기계적 지도를 생성합니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포하 해상도와 조직의 전체 영역에서 세포벽의 기계적 특성을 동시에 측정할 수 있다는 점입니다. 시료 임베딩을 위한 Aros 배지는 증류수에 10% mannitol과 0.7% 저융점 aros를 혼합하여 준비합니다.드릴 팁과 같은 강한 금속 도구를 사용하여 현미경 유리 슬라이드 중앙에 0.5 by 0.5 centimeter 영역을 식각합니다. 이렇게 하면 표면이 거칠어져 agros media가 슬라이드에 잘 부착되거나 고정될 수 있도록 agros의 접착력을 높여줍니다. 식각된 유리 슬라이드 영역 위에 임베딩 agros media 약 20 microliters를 피펫으로 한 방울 떨어뜨립니다.이렇게 하면 Agros의 얇은 막이 형성됩니다. 슬라이드 글라스를 습윤 상자에 보관하고 Agros 배지가 응고될 때까지 기다린 후 Arabidopsis 샘플을 준비합니다. 분열조직 샘플을 준비하기 위해 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 분석을 수행할 것입니다.초미세 핀셋으로 꽃눈을 아래로 당겨 줄기에서 하나씩 제거합니다. P1 단계 원기(primordia)로 알려진, 후속 발달이 나타나지 않는 눈이 나올 때까지 모든 꽃눈을 제거하는 것이 중요합니다. 면도날이나 핀셋 끝을 사용하여 분열조직을 줄기에서 잘라냅니다.절단면은 원자 힘 현미경(AFM) 또는 FM으로 측정할 분열 조직 표면 영역과 평행해야 합니다. 얻어진 정단부는 실험 중에 뭉개지지 않도록 높이가 300 microns에서 600 microns 사이여야 합니다. 즉시 정단부를 이전에 준비한 aros 배지 얇은 막 속으로 밀어 넣으십시오. 유리 슬라이드 또는 aros 위의 위치를 선택하고, 분열 조직이 유리 슬라이드에 직접 접촉하면서 동시에 aros 밖으로 돌출되도록 부드럽게 밀어 넣으십시오.압력을 가하면 agros가 파손되므로, 이제 mari 줄기가 틈새에 세워지게 됩니다. 줄기를 절단한 후 몇 초 이내에 marit 줄기를 aros 내에 배치하는 것이 매우 중요합니다. 이는 MA 줄기가 마르는 것을 방지하기 위함입니다.배치 이미징을 위해 동일한 높이의 MA 줄기를 500 microns 미만의 간격으로 배치하여 여러 개를 이와 같은 방식으로 준비할 수 있습니다. 슬라이드 위에 준비된 MA 줄기를 습윤 박스에 보관하면서 추가 샘플을 해부하십시오. 다음 단계로 넘어가기 전에 필터 페이퍼를 사용하여 분열 조직과 꽃눈 사이 경계에 있는 과잉 수분을 조심스럽게 제거하십시오.이는 모세관 현상으로 인해 녹은 agar가 샘플을 침수시키는 것을 방지하기 위함입니다. 이후 20 µL 피펫을 사용하여 이전에 생성한 틈새를 채우고 각 분열조직을 둘러쌀 만큼 충분한 양의 녹은 마운팅 agar를 가합니다. agar는 제거된 꽃눈 또는 원기(primordium)의 흉터 높이까지 도달해야 합니다. 이를 위해 틈새의 양 끝에 agar를 추가해야 할 수도 있습니다.Agros를 추가하면 틈새로 빠르게 흘러 들어갑니다. 피펫을 사용하여 녹은 마운팅 Agros의 일부를 흡입함으로써 me stem이 슬라이드에서 가장 높은 지점이 되도록 합니다. 이렇게 하면 뿌리와 hypo coddles를 촬영하는 동안 me stem이 움직이지 않도록 고정됩니다.한천 박막에서는 별도의 해부가 필요하지 않습니다. 준비된 유리 슬라이드 위에서 마이크로 핀셋을 사용하여 유리의 식각 부위 바로 위나 유리 라멜라 위치를 따라 홈을 만듭니다. 뿌리 또는 하배축을 이 홈에 배치하여 전체 길이가 유리와 접촉하도록 합니다. 줄기 시료에서 시연한 것과 동일한 방식으로 시료 주변에 녹인 고정용 한천을 추가합니다.JP PK 나노 위저드입니다. 본 시연에서는 FM이 사용됩니다. 이 절차를 시작하려면 라운드 형태의 인덴테이션이 있는 캔틸레버를 FM에 장착하십시오. 반경에 따라 X, Y, Z 해상도와 정확한 측정이 가능한 인덴테이션 깊이가 결정됩니다.표피 표면에서 메조(meso) 및 나노 스케일 측정을 수행하려면 반지름 50 nanometer의 원형 압입자를 사용하십시오. 메조 스케일 측정을 수행하려면 반지름 0.5 micron의 원형 압입자를 사용하고, 2~3개 세포에 걸쳐 마이크로 스케일 측정을 수행하려면 반지름 2.5 micron의 원형 압입자를 사용하여 캔틸레버 팁에 레이저를 위치시키십시오. 거울을 이용하여 레이저를 캡터의 중앙에 맞추십시오.설정값을 1 V로 하여 A FM 접근 방식 아래에 깨끗한 유리를 배치하고, 분광법(spectroscopy)을 선택합니다. 최대 상대 설정값을 2 V, 확장 속도를 40 µm/s, Z 길이를 5 µm로 설정하여 인덴테이션(indentation)을 수행합니다. 캘리브레이션 매니저 메뉴에서 전진 곡선의 선형 부분을 선택하여 감도를 피팅(fit)합니다.select fit range 버튼을 사용하여, 10% mannitol 용액 200 µL에서 상대 설정값을 vol에서 meter로 변환해야 합니다. 캔틸레버 팁 아래에서 거울을 이용해 레이저를 캡터의 중앙으로 다시 정렬하고, 리스펙터를 이동시켜 calibration manager 메뉴에서 감도를 재교정하십시오. unknown 버튼을 클릭하고 four spectroscopy를 선택한 후, 앞서 설명한 대로 압입을 수행합니다.범위 선택 버튼을 사용하여 감도를 맞추기 위한 전진 곡선의 선형 부분을 선택하여 이 절차를 시작하십시오. 장착된 샘플을 AFM 아래에 배치하고 샘플 위에 10% manitol 용액 500 µL 한 방울을 추가합니다. manitol 용액은 수분 내에 세포를 플라스마화합니다. 압입 설정값 20 nN, 상대 설정값 200 nN, 확장 속도 40 µm/s, Z 길이 5 µm로 타겟에 접근하십시오. 200 nm 장착 캔틸레버의 경우 100 nm, 1 µm 캔틸레버의 경우 0.5 µm의 압입 깊이를 얻을 수 있도록 상대 설정값을 조정하십시오.5 µm 마운트 캔틸레버 힘 매핑 모드입니다. mar stems의 경우 70 × 70 µm 영역을 64 × 64 해상도로, hypo cos 및 roots의 경우 100 × 100 µm 영역을 64 × 64 해상도로 스캔할 영역을 선택하십시오. scan을 눌러 실험을 시작하고 결과물을 저장하십시오.먼저 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 파일을 엽니다. 그런 다음, 단일 맵의 모든 곡선에 동일한 분석을 적용하기 위해 일괄 처리(batch processing)를 선택하십시오.압입 깊이를 추출하기 위해 캔틸레버 굴곡의 적절한 높이를 선택하십시오. 영률(Young's modulus) 피팅 함수를 선택하십시오. 이는 힘이 압입 면적에 비례한다고 가정합니다.압입 형상이 포물선이라고 가정하려면 팁 모양을 parabolic으로 설정하십시오. 팁의 반지름을 입력하십시오. 다음으로, 분석에 사용할 후퇴 곡선을 선택하십시오.리트랙트 곡선은 지형의 영향을 덜 받기 때문에 익스텐드 곡선보다 선호됩니다. poso 비율을 0.5로 설정하십시오. 마지막으로, on을 누르고 출력 결과를 분석하여 저장하십시오.모든 실험에서 꽃의 Mars 줄기 어린 조직과 오래된 하이포 코들(hypo coddles) 및 뿌리 MA 줄기의 전형적인 AFM 청년 모듈러 맵이 여기에 표시되어 있습니다. 인덴테이션은 반구형이지만, 서로 다른 공간 해상도를 달성할 수 있도록 반지름이 다릅니다. 이 맵들은 반지름 50 nanometer, 깊이 50 nanometer의 인덴테이션을 이용한 메조에서 나노 스케일에 이르는 전형적인 결과를 보여줍니다.심전도 그래프(cardiograph)는 하배축 표피 세포의 표면 세포벽에서 마이크로 규모의 불균일성을 보여줍니다. 또한 화분 분열조직, 하배축 및 뿌리에 대해 반지름 500 nanometer, 깊이 500 nanometer인 메조 규모의 압입(indenture)에 대한 전형적인 결과가 함께 제시되어 있습니다. 반지름 2.5 micron, 깊이 500 nanometer인 마이크로 규모의 압입을 측정한 이 심전도 그래프는 가시적인 성장이 나타나기 전, 기관 형성 과정 중에 조직의 연화가 일어났음을 보여주었습니다.하지만 이 스캔은 샘플 높이의 범위가 AFM의 최대 Z 범위(maximum Z range)를 초과하여 중단되었습니다. 부적절한 고정으로 인해 실험 중 샘플이 이동하면 여기에서 보는 것과 같이 흐릿한 스캔 결과가 나타날 수 있습니다. 이 예시에서 보여주듯이 agros로 덮인 영역 또한 제대로 측정할 수 없습니다. 이 기술에 숙달되면, 올바르게 수행했을 때 한 시간 내에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

여기에서, 우리는 세포와 조직에 나노 및 마이크로 들여 쓰기 공구로 작동하는 원자력 현미경 검사법 (AFM)를 제시합니다. 이 계측기는 시료의 3D 표면 지형과 세포벽 Young의 계수및 터거 압력을 포함한 기계적 특성을 동시에 수집할 수 있습니다.

식물 세포 및 식물 조직의 기계적 특성 및 터거 압력을 측정하기 위해 원자력 현미경 검사법 사용

이 프로토콜은 수백 개의 미생물 세포에 대한 AFM 측정을 자동화하는 것을 목표로합니다. 첫째, 미생물은 PDMS 스탬프 미세 구조로 고정된 다음 수백 개의 고정된 세포에서 분광법 측정이 자동으로 수행됩니다.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

원자력 현미경 압입 프로토콜은 정상 또는 제한된 성장 (즉, 물 부족 상태) 동안 조직 또는 기관의 특정 세포의 세포벽의 물리적 특성의 역할을 해부 할 수있는 가능성을 제공합니다.

살아있는 애기장대 뿌리의 표피 세포의 물리적 특성을 연구하기 위한 원자력 현미경

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

배우세요 식물 조직의 기계적 특성을 원자력 현미경으로 매핑하는 방법을. 세포벽의 탄성을 조직, 세포 및 세포 이하 해상도에서 분석하여 식물 발달과 형태 발생을 연구할 수 있습니다.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

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