셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

이 절차의 전반적인 목표는 원자력 현미경을 사용하여 식물 조직의 기계적 특성을 매핑하는 것입니다. 먼저 낮은 용융 온도의 aros의 한 방울을 슬라이드의 에칭된 영역에 피펫팅하여 얇은 aros 필름을 형성하여 유리 슬라이드를 준비합니다. 두 번째 단계는 샘플을 해부하고 장착하는 것입니다.

줄기에서 꽃봉오리를 제거하고 마리스 줄기를 줄기에서 잘라낸 다음 즉시 유리의 얇은 Agros 필름에 자른 줄기를 삽입하십시오. 다음으로 슬라이드하고 Maris 줄기가 Aros 필름에 내장되었을 때 생성된 균열을 채우기에 충분한 용융된 마운팅 아그로스를 추가합니다. 마지막 단계는 데이터 수집을 위해 원자력 현미경을 설정하는 것입니다.

궁극적으로, 세포벽의 겉보기 영률(Young's modulus)에 대한 데이터 분석 및 측정은 세포벽의 특성에 대한 기계적 지도를 세포 내 해상도와 조직의 전체 영역에 걸쳐 동시에 생성합니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 내 해상도와 조직의 전체 영역에 걸쳐 세포벽의 기계적 특성을 동시에 측정할 수 있다는 것입니다. 시료 매립을 위한 Aros 매체는 0.7%의 낮은 용융 온도, 물에 10%의 만니톨로 제조됩니다.

드릴 팁과 같은 강력한 금속 기구를 사용하여 현미경 유리 중앙의 0.5 x 0.5cm 영역을 에칭합니다. 슬라이드: 이것은 아그로스의 접착을 용이하게 하기 위해 표면을 거칠게 하여 아그로스 미디어가 슬라이드에 달라붙거나 고정되도록 합니다. 약 20마이크로리터의 임베딩 아그로스 미디어의 피페다 방울이 유리 슬라이드의 에칭된 영역에 있습니다.

이것은 아그로스의 박막을 생성합니다. 유리 슬라이드를 습한 상자에 보관하고 Agros 배지가 애기장대에서 샘플을 응고시킬 때까지 기다립니다. Ana는 분열 샘플을 준비하기 위해 원자력 현미경에 사용됩니다.

꽃봉오리를 초미세 핀셋으로 잡아당겨 줄기에서 하나씩 제거합니다. P 1 단계 primor로 알려진 속편을 나타내지 않는 새싹까지 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다. 면도날이나 핀셋 끝을 사용하여 분열선을 줄기에서 잘라냅니다.

절단은 원자력 현미경 또는 FM으로 측정할 분열 표면의 영역과 평행해야 합니다. 얻어진 정점은 실험 중에 부서지지 않도록 높이가 300미크론에서 600미크론 사이여야 합니다. 즉시 정점을 이전에 준비된 aros 매체의 박막에 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 또는 아로스의 위치를 선택하고 분열체가 유리 슬라이드와 직접 접촉하고 아로스에서 돌출되도록 부드럽게 밉니다.

아그로스는 압력이 가해지면 골절되기 때문에 마리 줄기는 이제 균열에 서 있을 것입니다. 줄기에서 자른 부분을 따라 몇 초 이내에 마릿 줄기를 아로스에 배치하는 것이 중요합니다. 이것은 MA 줄기가 건조되는 것을 방지합니다.

배치 이미징을 위해 여러 MA 스템을 이러한 방식으로 준비할 수 있으며, 높이가 같고 서로 500미크론 미만으로 떨어져 있는 경우 배치할 수 있습니다. 슬라이드에서 준비된 ma 줄기를 습기가 많은 상자에 보관하고 추가 샘플을 해부합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 여과지를 사용하여 분열체와 꽃봉오리 사이의 경계에 있는 과도한 물을 부드럽게 제거합니다.

이는 용융된 아그로스가 모세혈관의 힘으로 인해 샘플에 넘쳐나는 것을 방지하기 위한 것입니다. 나중에 20 마이크로 리터 피펫으로 이전에 생성 된 균열을 메우고 각 분열을 둘러싸기에 충분할 정도로 용융 된 장착 아그로스에서 aros는 제거 된 꽃 봉오리 또는 primor 체육관의 흉터 수준에 도달해야합니다. 이를 달성하기 위해 균열의 각 끝에 아그로스를 추가해야 할 수도 있습니다.

아그로스가 추가되면 빠르게 균열로 범람합니다. 피펫을 사용하여 용융된 마운팅 아그로스 중 일부를 흡인하여 me 스템이 슬라이드에서 가장 높은 지점이 되도록 합니다. 이것은 me stem을 고정하여 뿌리 및 hypo coddles를 이미징하는 동안 움직일 수 없도록 합니다.

아그로스의 박막에는 해부가 필요하지 않습니다. 준비된 유리 슬라이드에서 마이크로 핀셋을 사용하여 유리의 에칭 바로 위 또는 유리 라멜라를 따라 홈을 만들고 이 홈에 뿌리 또는 하이포 코들을 배치하여 홀드 길이를 따라 유리와 접촉하도록 합니다. me stem 샘플에 대해 입증된 것과 동일한 방식으로 샘플 주위에 용융된 마운팅 아그로스를 추가합니다.

JP PK 나노 마법사. 이 데모에서는 FM이 사용됩니다. 이 절차를 시작하려면 A FM에 둥근 모양의 움푹 들어간 곳이 있는 캔틸레버를 장착합니다. 반경은 X, Y, Z 해상도와 정확한 측정을 보관할 수 있는 압흔 깊이를 결정합니다.

표피 표면에서 나노 단위로 meso를 측정하려면 50 나노미터 반경의 원형 압흔을 사용하십시오. 중간 규모 측정을 수행하려면 0.5 미크론 반경의 원형 압입 장치를 사용하고, 2-3 개의 셀에 걸쳐 마이크로 스케일 측정을 수행하려면 2.5 미크론 반경의 원형 압입 위치를 사용하여 캔틸레버 끝에 레이저를 배치합니다. 거울을 사용하여 레이저를 캡터의 중앙에 정렬합니다.

A FM 접근 방식 아래에 깨끗한 유리를 1볼트의 설정점에 대한 목표와 함께 배치하고 분광학을 선택합니다. 최대 상대 설정점을 2V로, 확장 속도를 초당 40미크론으로, Z 길이를 5미크론으로 설정하여 인덴테이션을 수행합니다. calibration manager 메뉴에서 민감도에 맞게 forward curve의 선형 부분을 선택합니다.

맞춤 범위 선택 버튼을 사용하여 상대 설정값을 200마이크로리터의 10% 매니톨 용액에서 부피에서 미터로 변환해야 합니다. 캔틸레버 팁 아래에서 미러를 사용하여 레이저를 캡터 중앙으로 재정렬하고 조절기를 이동하여 보정 관리자 메뉴에서 감도를 다시 보정합니다. 알 수 없는 버튼을 클릭하고 4개의 분광법을 선택한 다음 앞서 표시된 대로 들여쓰기를 수행합니다.

적합 범위 선택 버튼을 사용하여 감도에 맞게 순방향 곡선의 선형 부분을 선택하여 이 절차를 시작하고, 장착된 샘플을 A FM 아래에 배치하고 500%manitol 용액의 10마이크로리터 방울을 샘플에 추가합니다. 매니톨 용액은 몇 분 안에 세포를 플라즈마, 200 나노 뉴턴의 상대 설정점으로 함몰 20 나노 뉴턴의 설정 점에 대한 목표로 접근하고 초당 40 미크론의 속도와 5 미크론의 Z 길이를 확장합니다. 200나노미터 장착 캔틸레버의 경우 100나노미터 또는 1미크론의 경우 0.5미크론의 압흔을 얻기 위해 상대 설정점을 조정합니다.

5미크론 장착 캔틸레버 힘 매핑 모드. 저cos에 대해 64 x 64 해상도의 mar 줄기 70 x 70 미크론과 64 x 64 해상도의 100 x 100 미크론 뿌리를 스캔할 영역을 선택합니다. 스캔을 눌러 실험을 시작하고 출력을 저장합니다.

데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 파일을 열어 시작합니다. 그런 다음 일괄 처리를 선택합니다. 단일 맵의 모든 곡선에 동일한 분석을 적용합니다.

오목한 깊이를 추출하기 위해 캔틸레버의 굽힘 높이를 수정하도록 선택합니다. Young의 모듈러스 피팅 함수를 선택합니다. 그것은 힘이 들여 쓰기 영역에 비례한다고 가정합니다.

팁 쉐이프를 포물선으로 설정하여 들여쓰기 쉐이프가 포물선이라고 가정합니다. 팁의 반경을 표시합니다. 다음으로, 해석을 위한 리트랙트 곡선을 선택합니다.

후퇴 곡선은 지형에 덜 민감하기 때문에 xtend 곡선보다 선호됩니다. 포소 비율을 0.5로 설정합니다. 마지막으로 출력을 누르고 분석하고 저장합니다.

전형적인 A FM, 꽃, 화성 줄기, 젊고 늙은, 하이포 코들 및 뿌리 MA 줄기의 젊은 모듈 식 지도가 모든 실험에서 여기에 표시됩니다. indenture는 반구형이지만 반경이 다르므로 다른 공간 해상도를 얻을 수 있습니다. 이 맵은 50나노미터 깊이의 압흔이 있는 50나노미터 반경의 메소에서 나노 규모로의 압입에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다.

심전도는 저코달 표피 세포의 표면 세포벽에서 미세한 이질성을 보여줍니다. 또한 500 나노미터 반경을 가진 중규모 압입과 500 나노미터 깊이의 꽃분열, 하이포코들 및 뿌리에 대한 일반적인 결과가 표시됩니다. 500나노미터 깊이의 움푹 들어간 곳이 있는 2.5미크론 반경의 미세한 움푹 들어간 곳에 대한 이 심전도는 눈에 보이는 성장에 선행하는 장기 시작 중 조직이 연화되는 것을 보여주었습니다.

그러나 이 스캔은 샘플 높이의 범위가 A FM의 최대 Z 범위를 초과하여 중단되었습니다. 부적절한 고정으로 인한 실험 중 샘플 이동으로 인해 여기에 표시된 것처럼 스캔이 흐려질 수 있습니다. 아그로스로 덮인 영역도 이 예제에 표시된 것처럼 적절하게 측정할 수 없습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 1시간 안에 완료할 수 있습니다.