배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 배양 또는 분리된 세포에서 세포 내 또는 세포 외 아스코르브산염 수준을 측정하는 것입니다. 이는 세포 추출물 또는 전체 세포를 score oxidase로 배양하여 후속 단계에서 score BA를 선택적으로 고갈시킴으로써 달성됩니다. 첫 번째 방법에서는 세포 추출물을 시안화물과 함께 배양하여 아스코르브산염 의존성 방식으로 페로 시안화물을 생성하며, 이는 추출물 내 아스코르브산염의 양을 직접 나타냅니다.

다음으로, 세포 추출물에 형성된 페로 시안화물의 양은 페로 시안화물을 첨가된 철로 정량적으로 산화시켜 페리스 철을 형성함으로써 측광으로 분광할 수 있는 발색성 철 2개의 고사리 S 복합체를 생성함으로써 결정된다. 두 번째 방법에서는 모든 세포를 철 2 개의 킬레이터 ferne S 및 구연산 철로 직접 배양합니다. 결과는 검출할 수 있는 세포 외 철 복합체의 정량적 및 특이적 감소에 따라 세포 내 또는 세포 외 아스코르브산염 수준의 차이를 보여줍니다.

Spectro 미터법으로. HBLC 기반 검출과 같이 이미 사용 중인 방법에 비해 현재 기술의 주요 장점은 이 매우 특이적인 마이크로플레이트 분석을 매우 빠르게 수행할 수 있고 모든 샘플과 표준물질을 이 절차를 시작하기 전에 직렬 방식이 아닌 병렬로 처리할 수 있다는 것입니다. K 5 62 현탁 세포를 배양하고 세포 추출물을 함유하는 점수 BA를 생성합니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 PBS에 10 밀리몰 아스코르브산의 원액을 준비합니다. 그런 다음 0에서 20 마이크로 몰 사이의 일련의 아스 코르 베이트 표준물을 조심스럽게 준비하십시오. 각 표준물질에서 100마이크로리터 분취량 4개를 조심스럽게 제거하고 수평 웰 배열에 추가합니다.

PBS 웰당 25마이크로리터 또는 밀리리터당 45.5단위를 포함하는 96웰 평면 바닥 플레이트에서. PBS에서 L 아스코르브산 산화효소 또는 AO의 원액은 96웰 플레이트를 호일과 궤도로 덮습니다. 실온에서 550RPM으로 5분 동안 혼합합니다.

완료되면 PBS의 3.5 밀리몰 칼륨 페리스 시안화물 50 마이크로 리터를 모든 웰에 첨가하여 이전과 동일한 조건을 사용하여 96 웰 플레이트를 궤도 혼합 한 후 1 밀리 몰의 최종 페리스 시안화물 농도를 제공합니다. 즉시 25%아세트산과 50%트리클로로아세트산을 함유한 새로 만들어진 용액 30마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 갓 준비된 Pharaoh 시안화물 측정 용액 100마이크로리터를 각 웰 오비탈에 추가합니다.

실온에서 550분 동안 550RPM으로 어두운 곳에서 플레이트를 혼합합니다. 그런 다음 593 나노 미터에서 우물의 흡광도 값을 읽습니다. 분석을 시작합니다.

먼저 밀리리터당 120단위의 50마이크로리터 AO 또는 HBSD를 쌍을 이룬 웰에 3회씩 추가하여 밀리리터당 10단위의 최종 AO 농도를 얻어 선택된 웰에서 세포외 아스코르브산염을 산화합니다. 이 레이블에 따라 쌍을 이룬 웰은 마이너스 AO 및 플러스 ao입니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 부드러운 궤도 혼합으로 플레이트를 혼합한 후 모든 웰에 50마이크로리터의 2.4밀리몰 Ferne S를 첨가하여 최종 Ferne s 농도가 200마이크로몰이 되도록 하고 섭씨 37도에서 5분 동안 위와 같이 플레이트를 혼합합니다.

다음으로, 갓 준비한 120마이크로몰 구연산철 50마이크로리터를 모든 웰에 첨가하여 각각 10마이크로몰 철과 50마이크로몰 구연산염의 최종 철 및 구연산염 농도를 제공합니다. 아스코르브산염 FLX 분석이 끝날 때 잘 섞습니다. 각 웰에서 위에 있는 매체를 빠르게 흡입하고 24웰 플레이트에서 적절하게 라벨링된 웰에 추가합니다.

그런 다음 상층액의 3마이크로리터 분취액을 96웰 플레이트에 추가하여 세포외 아스코르브산염을 측정합니다. 마이크로플레이트 분광 광도계에서 593나노미터에서 웰의 흡광도 값을 읽습니다. 마지막으로, 표시된 단백질 밀리그램당 m 아스코르브산으로 세포 외 아스코르브산의 양을 계산합니다.

다음은 아스코르브산염 표준물질 세트에 대한 일반적인 표준 곡선으로, 웰당 0 - 20 마이크로몰 또는 0 - 2 NMO 아스코르브산염입니다. 96 웰 플레이트 중에서, 여기에 도시되지는 않았지만, 선형성은 웰 당 최대 8 NMO 아스코르브산염으로 유지되며, 이는 약 80 마이크로몰의 샘플 아스코르브산염 농도에 해당한다. 이 분석은 웰당 0.25 ole 아스코르브산 미만의 아스코르브산염 수준을 성공적으로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

K 5 62 세포는 세포 외 탈수소 L 아스코르브산으로부터 세포 내 아스코르브산을 빠르게 축적하지만 아스코르브산은 축적하지 않습니다. 이 대표적인 실험에서, PBS는 K5 62 세포를 500 마이크로 몰의 아스코르브산염 dehydro L 아스코르브산, 아스코르브산 dehydro L, 아스코르브산과 50 마이크로몰 사이토 B 아스코르브산염과 5 밀리몰 시안화물 또는 아스코르브산염과 50 단위 AO를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하였다. 세포 내 아스코르브산염은 앞서 설명한 바와 같이 측정하였다.

K 5 62 세포에 의한 Dehydro L 아스코르브산 흡수는 촉진 포도당 수송체 둔근 매개 수송에 의해 발생하여 dehydro L 아스코르브산 흡수에 대한 둔근의 관여를 평가합니다. 이 대표적인 실험에서, K5 62 세포를 dehydro L 아스코르브산으로 배양하기 전에 cyto B 또는 dihydro cyto B의 농도를 증가시켜 배양하였다. cyto callin B와 dihydro cyto B는 모두 마이크로몰 농도에서 운동성 과정을 억제하는 반면, 단일 이중 결합의 존재로 인해 dihydro cyto B와 다른 cyto callin B는 낮은 마이크로몰 농도에서 둔근 의존 수송을 억제한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

따라서, dehydro L로서 아스코르브산은 2.5 micromolar 미만의 IC50을 가진 cyto B에 의해 흡수가 저해되었으나, dihydro cyto에 의해 저해되지 않았다. B 디하이드로. L 아스코르브산 흡수는 아마도 둔근 매개 수송에 의해 발생합니다.

대안적으로, 세척된 세포를 dehydro L 아스코르브산으로 배양하는 동안 둔근 수송 가능하지만 대사가 불가능한 글루코스 유사체 3O 메틸 D 글루코스 또는 비직근 수송 글루코스 스테레오 이성질체 L 글루코스의 농도 증가에 노출시켰다. 다시 말하지만, 결과는 세포 내 아스코르브산 축적의 억제가 둔근 수송 가능한 포도당 유사체의 존재 하에서만 발생하기 때문에 dehydro L 아스코르브산 수입에 대한 glu 관여를 나타냅니다. 두 번째 분석에서.

배양된 세포로부터의 아스코르브산 유출 속도를 측정할 수 있습니다. 이 특정 분석법은 세포에서 아스코르브산염의 방출이 세포에 의한 비트랜스페린 결합 철의 아스코르브산 조절 세포 흡수에 중요한 것으로 보이기 때문에 중요합니다. 비트랜스페린 결합 철의 흡수는 포유류 뇌의 성상세포 뉴런 철 교환 및 항상성뿐만 아니라 혈색소 침착증과 같은 철 과부하 장애의 병태생리학과 관련이 있는 것으로 간주됩니다.

실제로, 주요 흥분성 신경전달물질인 L 글루타메이트는 L 글루타메이트, 유리에 의한 흡수, 그리고 아마도 GLT 1 및 추정 VSO에 의한 아스코르브산염 방출을 유발하는 후속 세포 팽창에 의존하는 방식으로 성상세포에 대한 아스코르브산의 방출을 유발합니다. 비유하자면, A 점수 B가 적재된 성상세포로부터의 A 점수 베이트 방출은 흥분성 아미노산 L 아스파르테이트에 의해 자극될 수 있지만, 비흥분성 아미노산 L 글루타민에 의해 자극될 수 없다. 이 효과는 여기에 묘사되어 있으며, 이는 아스코르베이트가 적재된 마우스 성상세포의 1차 배양물로부터 아스파르테이트 및 글루타민에 의한 아스코르브산염 방출 자극에 대한 용량 반응 곡선을 보여줍니다.

이 기술은 올바르게 수행할 경우 2시간 이내에 수행할 수 있습니다.