Name: 배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 배우세요 배양 세포의 세포내 및 세포외 아스코르빈산 수준을 측정하는 중간처리량 마이크로플레이트 분석법을 통해 세포 대사 연구에 활용할 수 있는 비용 효율적인 방법을 확인하세요.

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우리는 성상 세포 배양의 관대 한 공급 박사 스티븐 로빈슨과 미스 하니아 Czerwinska (모나 쉬 대학)에 감사드립니다.

1. 배양 세포에서 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 <ol><li> 세포 배양 및 수확 <ol><li> 표준 배양 절차 19-21,32,38를 사용하여 현탁액 (예를 들어 인간의 백혈병, K562) 또는 부착 세포 (예를 들어, 기본 성상 세포)를 성장. 참고 : 세포, 아스코르브 산염을 포함하는 아스 코르 빈산 하나 아스코르브 산염 또는 DHA 33,39 등으로 배양 된 세포를로드 할 수 있도록. </li></ol></li><li> 아스코르브 산염 함유 세포 추출물을 만들기 <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 세척 정지 또는 얼음처럼 차가운 휴대 Permeabilization 버퍼 [CPB의 450 μL와 자기편 세포의 적절한 수를 품어; PBS에 0.​​1 % (W / V) 사포닌; 4 °의 C]. 주 : 경험적으로 최종 사용자 (아래 참조) 분석의 선형 범위 내의 흡광도 값을 획득하는데 필요한 세포의 수를 결정한다. 참고 : 조직 추출물도 (자세한 내용은 설명을 참조)을 사용할 수 있습니다. </li><li> AGITA10 분 동안 얼음에 테 세포는 완전한 세포 용해를 보장합니다. </li><li> 냉장 마이크로 원심 (4 ℃)에서 5 분간 16,000 × g에서 원유 해물의 원심 분리하여 세포 파편을 제거하여 정화 된 아스코르브 산염 함유 세포 추출물을 만듭니다. </li><li> 조심스럽게 각 샘플에서 4 × 100 ㎕의 분취 액을 제거하고도 만 25 μL / 웰 45.5 U의 PBS ( &quot;-AO&quot;)의 25 μL / 하나를 포함하는 96 - 웰 평면 바닥 판 우물의 수평 순서에 추가 / ㎖ PBS ( &quot;+ AO&quot;)에서 L-아스 코르 빈산-산화 효소 (AO)의 원액. 참고 :이 (아래 참조) 표준의 준비와 병렬로 수행해야합니다. </li></ol></li><li> 아스 코르 빈산 표준 곡선 건설 (각 분석을 위해 새롭게 구성해야합니다) <ol><li> 얼음처럼 차가운 PBS에서 10 mM의 아스 코르 빈산의 재고 솔루션을 준비합니다. 주 : 분광 광도계로 한 석영 큐벳을 이용하여 아스코르브의 농도를 확인265 나노 미터 (흡광 계수 = 14.5 밀리미터 -1 cm -1) 40에서 CM 경로 길이. </li><li> 조심스럽게 0과 20 μM 사이 아스 코르 빈산의 일련의 표준을 준비합니다. </li><li> 1.2.4 단계와 병행하여, 신중하게 각각의 표준에서 4 × 100 ㎕의 분취 액을 제거하고 PBS ( &quot;-AO&quot;) 또는 25 μL / 잘 들어있는 96 - 웰 평면 바닥 판에있는 우물의 수평 순서에 추가 PBS의 AO ( &quot;+ AO&quot;)의 45.5 U / ㎖의 원액. 참고 : 위의 아스 코르 빈산 기준의 100 μL는 아스 코르 빈산의 0-2 nmol을 포함됩니다. 참고하시기 바랍니다, AO의 목적은 감소 페리 시안화 비 아스 코르 빈산 환원제의 기여에 대해 제어하는​​ 것입니다. </li></ol></li><li> 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 - 1 단계 : 선택적 아스 코르 베이트를 제거하고 정량적 페리 시안화와 아스 코르 빈산 산화 <ol><li> 공전 호일 접시를 덮음으로써 다크에서 5 분 동안 실온에서 550 rpm에서 96 - 웰 플레이트를 섞는다. 주 : T그의 단계는 DHA에 &quot;+ AO&quot;우물의 모든 아스 코르 빈산을 산화한다. &quot;-AO&quot;우물은 영향을받지 않습니다. </li><li> 모든 웰에 PBS에 (이하 &quot;페리 시안화&quot;이라한다)의 3.5 mM의 페리 시안화 칼륨의 50 μl를 추가합니다. 마지막으로 [페리 시안화] = 1 ㎜. 참고 : multipipettor를 사용합니다. </li><li> 궤도 다크 또 다른 5 분 동안 실온에서 550 rpm에서 플레이트를 섞는다. 참고 :이 단계는 산화 아스코르브 산염의 1 분자 당 감소 페리 시안화 2 분자의 화학 양론 비에 아스 코르 빈산에 의해 페로 시안화 수의 감소가 발생한다. </li><li> 즉시 50 % (V / V) 아세트산 30 % (W / V) 트리클로로 아세트산 (TCA)를 포함하는 새로 구축 솔루션의 25 μl를 추가합니다. 참고 : multipipettor를 사용합니다. </li></ol></li><li> 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 - 2 단계 : 정량 페로의 양 (37)을 형성 <ol><li> 전자에 페로 시안화 결정 솔루션 (37)의 100 μl를 추가합니다잘 ACH. 참고 : 작업 솔루션은 사용하기 직전에해야한다 : 3 M 나 - 아세테이트 (산도 6.0) 2 ㎖를; 빙초산 (17.4 ~ M 아세트산) 0.5 ㎖; 0.2 M 구연산 2 ㎖; 0.1 M 아세트산 3.3 밀리미터에 FeCl 3 2 ㎖; 30 mM의 ferene-S 1 ㎖. 이 작업 용액의 최종 부피는 7.5 ㎖를해야한다. </li><li> 궤도 상을 실온에서 30 분 동안 550 rpm에서 어둠 속에서 플레이트를 섞는다. </li><li> 593 nm에서 웰의 흡광도 값을 읽고 (즉, 철 (II) (ferene-S) 3 착체의 흡광도 최대). </li><li> (단계 1.3 참조 각 샘플에 대한 - &#39;AO&#39;우물 후 아스코 표준 곡선으로부터 보간 초기 대응에서 &#39;+ AO&#39;웰의 593 nm의 값을 뺀 만 셀 당 나노 몰 아스 코르 빈산 등의 세포 내 아스 코르 빈산의 양을 계산 ). 표준 곡선을 생성 할 때, ascorb의 양에 대해 각 기본이 &#39;차분 값을 &quot;플롯물론 당 먹었다. </li></ol></li></ol> 배양 된 세포에서 아스 코르 빈산 - 유출의 2. 결정 <ol><li> 세포 배양 및 수확 <ol><li> (단계 1.1 참조) 위의 정지 또는 부착 세포를 성장. 참고 : 최상의 결과를 위해 서스펜션과 자기편 세포와 24 - 웰 플랫폼 형식으로 아래의 분석을 수행한다. </li><li> 재현 탁 서스펜션 세포, 또는 또는 칼슘과 마그네슘하지 않고, 미리 예열 HEPES 완충 생리 식염수 400 ㎕ 씩, 부착 세포를 오버레이, 5 ㎜ D-글루코스 포함, 우물 (HBS / D의 pH 7.3, 37 ° C)를 24 웰 플레이트. 검사 각 24 웰 플레이트에 지정된 셀이없는 우물에 HBS / D의 동일한 볼륨을 추가합니다. 참고 : 후자는 (아래 참조)의 기준 반응 세포가없는 컨트롤이 될 것입니다. </li></ol></li></ol> 3. 출시 아스 코르 빈산의 양을 결정 <ol><li> 다음 주식 솔루션은 사전에 준비를해야합니다 : 120U / ㎖ AO HBS / D (신선한 준비)에서; 2.4 mM의 Ferene-S HBS / D에; 120 μM에 FeCl 3 HBS / D (농축 된 원액에서 바로 준비)에 600 μM NA-구연산. </li><li> ferrireduction 반응 (물론 당 최종 부피가 600 ㎕를해야한다)을 시작하려면 이미 HBS / D 400 μl를 포함하는 각각의 우물에 시약의 다음 볼륨을 추가 : <ol><li> 세중 우물을 쌍으로하는 AO (120 U / ㎖) 또는 HBS / D의 50 μl를 추가합니다. 최종 AO 농도가 10 U / ㎖이어야한다. 참고 : 레이블로 우물을 쌍 &quot;- AO&quot;와 &quot;+ AO&quot;. </li><li> 37 ℃에서 5 분 동안 부드러운 궤도 믹싱 판을 혼합 </li><li> 모든 웰에 2.4 mM의 ferene-S의 50 μl를 추가합니다. 최종 ferene-S 농도가 200 μM해야한다. 37 ℃에서 5 분 이상으로 판을 혼합 </li><li> 새로 제조 된 120 μM 구연산 철의 50 μl를 추가합니다. 최종 철, 구연산 농도는 10 μM의 철과 50 μM 구연산해야한다. 잘 섞는다. </li></올&gt; </li><li> 세 세중 제어 웰스, 위에있는 매체를 대기음 및 0.1 %의 사포닌을 함유하는 600 ㎕의 HBS / D를 추가합니다. 참고 :이 (아래 참조)를 병행하는 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 시험은 &quot;100 % 세포 용해&quot;컨트롤이 될 것입니다. </li><li> 37 ° C에서 어둠 속에서 60 분 동안 품어 </li><li> 아스 코르 빈산 - 유출 분석의 끝에서, 빠르게도 각에서 500 μl를 대기음하고 적절하게 24 웰 플레이트에 우물을 표시하기 위해 추가 할 수 있습니다. 참고 : 서스펜션 셀, 처음 4 ℃에서 원심 분리하여 세포를 제거 </li><li> 96 - 웰 플레이트에 상층 액 300 ㎕의 분취 량을 추가 한 후 593 nm에서 읽었다. </li></ol> 세포 외 아스 코르 빈산의 4. 결정 <ol><li> 593 nm에서 웰의 흡광도 값을 읽습니다. </li><li> 세포 내 아스코르브 산염의 결정에 대해 기재된 바와 같이 단백질 1mg 당 (또는 백만 셀마다) 나노 몰 아스코르브로서 세포 아스코르브의 양을 계산단계 1.5.4에서. 참고 : 아스코르브 방출은 세포 내 아스코 의해 제한되지 않도록 최종 사용자가 조건을 최적화한다. </li></ol> LDH 출시 5. 결​​정 <ol><li> 각 샘플에서 세포 외 용액의 나머지 200 μL와 셀룰러 용해의 정도를 결정하기 위하여 LDH 방출 분석을 실시 32,41. 참고 : 전체 박리 LDH의 %로 계산합니다. 0.1 %의 사포닌으로 처리 된 샘플에서 박리 LDH를 결정합니다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

본 논문에서는 배양 된 세포의 내부와 세포 구획에서 파생 된 아스 코르 빈산의 결정을위한 두 가지, 신속한 특정 상대적으로 민감한 색채 마이크로의 분석을 제시한다. 분석 표준 실험실 장비 및 시약에 대한 액세스를 완료 할 수 있습니다. 분석에 필요한 적당히 비싼 시약은 L-아스 코르 빈산을 향해 피 분석 특이성의 높은 정도를 부여하는 등의 필수이다 AO이다. 분석은 어느 서스펜션 세포 (예 : K562) 또는 부착 세포 (예를 들면 인 HepG2 또는 기본 설치류 성상 세포)에 적합하고, 성공적으로 세포에게 19,20,32,37,38를 사용하여 이전의 출판물에 사용되어왔다. 그들은 L-아스 코르 빈산을 위해 충분히 특정하지 않기 때문에 AO 대신에 다른 아스코르브 산염 산화제 (예 TEMPOL)의 사용은 피해야한다. 또한, 다음과 같은 화합물의 용도아...

1928 년에서 1934 년 1에 게시 된 신문에 아스 코르 빈산 (비타민 C), 그리고 염원 알버트 Szent-Györgyi로 &quot;반 괴혈병 인자&quot;, 및 다른 사람과 같은 그 식별의 화학적 특성의 발견은 역사에서 획기적인 사건이었다 생화학. 사실, 이러한 발견은, Szent-Györgyi 1937 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수여된다. 동물과 식물 생리학 아스 코르 빈산의 역할의 끊임없이 확장 제품군뿐만 아니라 인간의 건강에 기여 활성 과학의 주제로 계속 조사와 논쟁. L-아스 코르 빈산 풍부한 생리 환원제와 포유류의 시스템에서 보조 인자 (cofactor) 효소, 콜라겐 수산화, 카르니틴과 노르 에피네프린 생합성, 티로신 대사 및 펩타이드 호르몬 아미드 2를 포함하는 다수의 잘 정의 된 효소 반응에 기여한다. 흥미롭게도, 설치 evide후부는 아스 코르 베이트는 수산화 관련된 프 롤릴와 아스 파라 hydroxylases 다른 철에 의존 dioxygenases을 자극하고, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 1α 및 2α 3 대상의 역할을하는 것이 좋습니다. 최근 보고서는 아스 코르 빈산 핵 hydroxylases, 몬지 C (JmjC) 도메인 단백질을 자극에서의 활동을 통해 크로 마틴의 탈 메틸화에 영향을 미치는을 통해 T-세포 성숙에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다; 후자의 전체 활동 4 아스 코르 빈산을 필요로 나타납니다. 실제로, 아스 코르 빈산에 의해 이러한 효소의 자극은 HIF 콜라겐 hydroxylases의 아스 코르 빈산에 의해 자극과 유사한 메커니즘에 의해 발생하는 것으로 나타납니다. 다른 고전적인 효과 중, 아스 코르 빈산 수용성 연쇄적인 라디칼 스 캐빈 저 5 셀룰러 항산화와 세포막의 재활용에 크게 기여 α-토코페롤 W, 6 α-토코페롤의 급진적 인 감소를 통해 (비타민 E)HICH는 막 지질 과산화 7에 대해 보호하는 것이 중요합니다. 대부분의 포유류는 D-포도당 아스 코르 빈산의 드 노보 간 합성 할 수 있지만 중요한 것은, 높은 영장류, 기니아 피그 및 일부 박쥐 비타민 8의식이 소스에 따라 달라집니다. 이 GULO 유전자의 불 활성화로 인해 영향을받지 포유 동물에서의 orthologues 9-13 산화 효소 효소, γ-굴로-락톤을 인코딩합니다. 이 효소는 포도당 13 아스 코르 빈산 생합성의 최종 반응이 필요합니다. 인간의 창자 루멘에서 수송 매개 흡수 후, 아스 코르 베이트는 순환 시스템에 의해 몸 전체에 배포됩니다. 비타민은 일반적으로 (농도가 일반적으로 통용 혈장 농도와 유사하다하는 적혈구의 주목할만한 예외) 세포 내 밀리몰 농도에서와 마이크로 몰 진한에서 자사의 감소 형태로 발견대부분의 세포 외 체액 (14, 15)에 entrations (예를 들면 50 ~ 200 μM). 생리적 조건 하에서, 아스 코르 베이트는 일반적 아스코 자유 라디칼에 가역성 원 전자 산화를 겪는다 (AFR &#39;또한 monodehydroascorbate 또는 semidehydroascorbate라고도 함). AFR 다시 아스코르브에 급속한 한 전자 환원 효소의 부재, 상대적으로 안정 라디칼 (16)이지만,이 AFRs 한 아스코르브 하나 dehydroascorbate (DHA) 9,13,17에 dismutate을 발전 할 수있다. 셀의 내부에, 아스 코르 베이트, DHA의 2 전자 산화 생성물은 급속 글루타티온 및 NAD (P) H-의존적 효소 적 및 비 효소 반응 (13)에 의해 확대 아스코르브로 감소 될 수있다. 이 고전 철 대사에 아스 코르 빈산의 유일한 중요한 역할이 아닌 헴 철 (18)의식이 흡수를 자극하는 것을 허용하는 동안, 우리와 다른 증거들을 제공 한trongly 그 아스 코르 빈산을 제안하는 것은이 금속의 대사에 크게 확장 된 역할을한다. 첫째, 아스 코르 빈산 - 구비 세포에 의해 방출되는 아스 코르 빈산 세포 (19, 20)에 의해 비 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절하는 데 중요한 역할을하고, 아주 최근의 증거는 아스 코르 빈산도 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절된다는 것을 의미합니다 나타납니다 셀 (21)에서, 후자는 주요 생리적 철 흡수 경로 (22)에 대응한다. 아스 코르 빈산 포유류 (23, 24) 정상 중추 신경계 기능을 위해 필수적입니다. 함께 부신 피질, 뇌하수체, 흉선, 망막 및 황체로, 뇌는 다른 신체 조직 23,25-27에 아스 코르 빈산 상대적으로 높은 농도가 포함되어 있습니다. 또한, 성상 세포 (28, 29) 및 신경 세포와 같은 세포의 글루타메이트 30 두의 노출은 ascorbat 세포 외 공간에 아스 코르 빈산의 방출을 유발하는 것으로 알려져있다전자는 글루타민산에 의한 신경 장애 (31)에 대해 신경 세포를 보호하는 것으로 생각된다. 성상 세포에서 글루타메이트에 의한 아스 코르 빈산 자료의 정확한 메커니즘은 알 수 있지만, 우리는 최근 성상 세포의 글루타메이트와 아스파 라진 산염 수송 (GLAST에 의해 글루타메이트 섭취로 인한 부종 세포의 관련을 나타내는 증거를 제공하고, 또한 알려진 흥분성 아미노산 수송 이소 1 [EAAT1 ] 인간)와 같은 아스 코르 빈산 32 작은 유기 음이온 투과성 볼륨에 민감한 osmolyte과 음이온 채널 (VSOACs)의 결과의 활성화. VSOAC 형성에 관여 세포막 도관의 분자량은 33, 34 신원을 식별하기 위해 남아있다. 많은 분석이 분광 형광 및 크로마토 그래피 분석 (35, 36)를 포함 생물학적 시료에서 아스코르브 산염의 결정을 위해 개발되었지만, 특이도, 민감도, interferenc에 많은 변화가있다화학적 오염 물질, 효과적인 선형 범위 및 끝점 분석 물의 안정성 E. 또한, 분석의 선택에 영향을 다른 중요한 요인은 신속성, 사용의 용이성과 같은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 장치로서 비교적 특수 장비에 접근한다. 여기에서 우리는 배양 된 세포에서 세포 내 아스코의 판정뿐만 아니라, 배양 된 세포로부터 아스코르브-유출의 결정을위한 별도의 분석에 대한 간단하고 매우 구체적인 비색 마이크로 분석을 제시한다. 후자의 분석으로 인해 나트륨 의존 아스 코르 빈산 포터 (SVCTs)가 발표 한 아스 코르 빈산의 신속한 재 흡수에 세포에서 아스 코르 빈산 릴리스의 과소 평가의 문제를 회피하는 것을 목표로하고있다. 두 방법 모두는 우리의 이전의 출판물 19,20,32,37,38의 일부에 출연했지만,이 원고는 지침과 자신의 효과적인 실행을위한 가이드 라인의 명시 적 세트를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96웰 평면 미</td>세원심분리기 <td>Thermo</td><td>269620</td><td>모든 평바닥 96웰 플레이트 사용 가능</td></tr><tr><td>냉장 벤치탑 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>냉장실에서 온도와 평형을 이룬 비냉장 마이크로 원심분리기</td></tr><tr>사용 가능<td>냉장 벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Swing-bucket</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus 마이크로플레이트 분광광도계</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>593nm에서 판독할 수 있는 모든 마이크로플레이트 분광광도계를 사용할 수 있으며 권장됩니다. 필터 기반 플레이트 리더를 사용하는 경우 가능한 가장 가까운 파장을 선택하고 표준 곡선 방법을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate(마이크로플레이트 오비탈 믹서)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>이 제품은 매우 다재다능하고 신뢰할 수 있는 마이크로플레이트 믹서이며 다음과 같은 분석에 매우 적합합니다</td></tr><tr><td>. 범용 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS 완충 식염수(MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-포도당 (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충 식염수 + 5 mM D-포도당 (HBS/D);137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&bull; 2 H2O, 0.8 mM MgSO4&bull; 7 H2O, 5 mM D-포도당, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 투과 완충액 (CPB; PBS의 0.1% 사포닌)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 화학 물질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 또는 L-아스코르브산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>최고 순도 제제를 얻어야 합니다.</td></tr><tr><td>Dehydro-L-아스코르브산(DHA) 이량체</td><td>시그마-알드리치</td><td>30790</td><td>수용액은 이론적으로 DHA 이량체</td></tr><tr><td>사이토칼라신 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6762</td><td>DMSO 또는 에탄올</td></tr><tr><td>아스코르베이트 산화효소(AO)</td>로 제조된 원액 시<td>그마-알드리치</td><td>A0157</td><td>원액(120 U/ml)을 PBS 또는 MBS로 준비한 다음 분취량에서 동결할 수 있습니다.</td></tr> 페리<tr><td>시아나이드칼륨(FIC)</td>시<td>그마-알드리치</td><td>455989</td><td>삼수화물</td></tr><tr><td>Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&prime;,5&prime; &prime;-disulfonic acid disodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 L-글루타메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.1% 원액 준비</td></tr><tr><td>세포 내 아스코르브산염 측정 분석을</td><td></td><td></td><td></td>위한 원액</tr><tr><td>3 M 아세트산 나트륨 (pH 6.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>빙초 아세트산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M 구연산</td> 3.3 m><><M 구연산 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.1 M 아세트산</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 % (v / v) 아세트산 + 30 % (w / v) 트리클로로 아세트산 (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산염 유출 분석</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO(120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.4 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 mM sodium citrate</td><td></td><td></td><td></td> 내 0.12 mM FeCl3용</tr> 원액</tbody></table> 솔루션

배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

비타민 C (아스 코르 빈산)는 만 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중 세포 대사에서 많은 중요한 역할을한다. 뇌 아스 코르 빈산의 항상성에 중요한 것으로 보인다 관계 - 예를 들어, 뇌 내에서, 아스코르브 산염은 뉴런과의 인접한 성상 세포 사이의 아스 코르 빈산 순환을 포함하는 신경과 neuromodulatory 방식으로 작동합니다. 또한, 새로운 증거가 강력하게 아스코르브 산염은 고전적인 인식되는 것보다 세포 및 조직 철의 신진 대사를 조절에 크게 확장 된 역할을하는 것이 좋습니다. 정상 및 자유화 세포 및 유기체 생리학 아스코르브의 필수적인 역할의 증가 인식은 매우 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 실행될 수있는 매체 처리량 및 고감도 분석 방법의 범위를 요구한다. 여기에서 우리는 중간 처리량을 명시 적으로 지시, 보의 결정에 대한 구체적이고 상대적으로 저렴한 마이크로 분석을 제공세포 배양에서 일 내 및 세포 외 아스 코르 빈산.

배양 된 서스펜션 세포의 세포 내 아스 코르 빈산의 결정 첫 번째 분석 (그림 1)에서, 세포 내 아스 코르 베이트는 이전에 출판 된 절차 (37)에 의해 페로의 매우 중요한 결정을 사용하여, 페로 시안화하는 페리 시안화 (즉, AO 구분) 감소 아스 코르 빈산 별에 따라 결정된다. 아스 코르 베이트의 검출은 페로 시안화 제 1 철에 의해 철의 환원시킴으로써 페로하는 페리 시안화 아스코르브 의존 환원에 의해 생성되는 제 1 철의 색채 킬레이트 화에 기초한다. 일부 2가 금속 이온 (예 : 구리 2 +, 공동 2 + 및 Zn으로 2 +)의 supraphysiological 농도는 아마도 ferene-S로 킬 레이션에 대한 제 1 철과 경쟁에 의해 방해 할 수있는 바와 같이, 적절한 예방 조치는 이러한 조건 37에서주의해야한다.</sup...

아스 코르 빈산은 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중, 세포 대사에 많은 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 중간 처리, 세포 배양 모두 내 및 세포 외 아스코르브 산염의 결정에 대한 구체적인 저렴 마이크로 분석을 설명합니다.

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

다음 실험의 전반적인 목적은 배양된 세포 또는 단리된 세포 내의 세포 내 또는 세포 외 아스코르브산(ascorbate) 수치를 측정하는 것입니다. 이는 세포 추출물 또는 전체 세포를 스코르비네이스(score oxidase)와 함께 배양하여 후속 단계에서 특정 BA를 선택적으로 고갈시킴으로써 달성됩니다. 첫 번째 방법에서는 세포 추출물을 시안화물(cyanide)과 함께 배양하여 아스코르브산 의존적인 방식으로 페로시안화물(ferro cyanide)을 생성하며, 이를 통해 추출물 내 아스코르브산의 양을 직접적으로 나타냅니다.다음으로, 세포 추출물에서 형성된 ferrocyanide의 양을 측정합니다. 이를 위해 추가된 ferric iron으로 ferrocyanide를 정량적으로 산화시켜 ferric iron으로 변환함으로써, 분광 광도법으로 정량화할 수 있는 발색 철-ferne S 복합체를 생성합니다. 두 번째 방법에서는 모든 세포를 철 킬레이터인 ferne S 및 ferric citrate와 함께 직접 배양합니다. 결과는 검출 가능한 세포 외 철 복합체의 정량적 및 특이적 환원을 바탕으로 세포 내 또는 세포 외 ascorbate 수준의 차이를 보여줍니다.분광 분석법으로 측정합니다. HPLC 기반 검출과 같이 기존에 사용되던 방법과 비교하여 본 기술이 가진 주요 장점은, 이 매우 특이적인 마이크로플레이트 분석법을 매우 빠르게 수행할 수 있으며 모든 시료와 표준물질을 순차적인 방식이 아닌 병렬 방식으로 처리할 수 있다는 점입니다. 이 절차를 시작하기 전에, K 5 62 부유 세포를 배양하고 세포 추출물을 포함하는 시료를 준비하십시오.그 다음, 얼음처럼 차가운 PBS에 10 millimolar 아스코르빈산을 녹여 스톡 용액을 준비합니다. 이어서 0에서 20 micromolar 사이의 농도로 일련의 아스코르브산 표준 용액을 정밀하게 준비합니다. 각 표준 용액에서 100 microliter씩 4개의 분주액을 조심스럽게 취하여 웰의 가로 방향 시퀀스에 추가합니다.웰당 25 µL의 PBS 또는 45.5 units/mL의 L ascorbate oxidase(AO) PBS 표준 용액이 들어 있는 96-웰 평저 플레이트를 호일로 덮고, 상온에서 550 RPM으로 5분 동안 궤도 혼합(orbital mix)합니다.완료되면, 이전과 동일한 조건으로 96-웰 플레이트를 궤도 혼합(orbital mixing)한 후, 최종 페리시안화물(Ferris cyanide) 농도가 1 mM이 되도록 모든 웰에 PBS에 희석된 3.5 mM potassium Ferris cyanide 50 µL를 첨가합니다. 즉시 50% acetic acid와 30% trichloroacetic acid가 포함된 갓 조제한 용액 25 µL를 첨가합니다. 다음으로, 각 웰에 갓 준비한 Pharaoh cyanide 측정 용액 100 µL를 궤도상으로 첨가합니다.상온에서 550 RPM으로 30분 동안 암실에서 플레이트를 혼합합니다. 그다음 593 nanometers에서 웰의 흡광도 값을 측정합니다. 이로써 분석을 시작합니다.먼저, 선택한 웰에 120 units per milliliter AO 또는 HBSD 50 µL를 3회 반복 실험(triplicate)을 위해 쌍을 이룬 웰에 첨가하여 최종 AO 농도가 10 units per milliliter가 되도록 하여 세포 외 ascorbate를 산화시킵니다. 그다음, 해당 쌍의 웰을 minus AO 및 plus AO로 표시합니다. 37 °C에서 5분 동안 부드러운 궤도 혼합(orbital mixing)으로 플레이트를 혼합한 후, 모든 웰에 2.4 mM Ferne S 50 µL를 첨가하여 최종 ferne s 농도가 200 µM이 되게 하고, 위와 동일하게 37 °C에서 5분 동안 플레이트를 혼합합니다.다음으로, 최종 철 및 시트르산 농도가 각각 10 µM 및 50 µM이 되도록 모든 웰에 갓 조제한 120 µM ferric citrate 50 µL를 첨가합니다. ascorbate FLX 분석 종료 시 충분히 혼합합니다. 각 웰에서 상층액을 빠르게 흡입하여 적절하게 라벨링된 24-웰 플레이트의 웰에 옮겨 담습니다.그 후, 세포 외 아스코르브산(ascorbate)을 측정하기 위해 상층액 3 µL씩을 96-웰 플레이트에 분주합니다. 마이크로플레이트 분광광도계(microplate spectrophotometer)를 사용하여 593 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 마지막으로, 세포 외 아스코르브산의 양을 표시된 mg 단백질당 m ascorbate로 계산합니다.다음은 웰당 0에서 20 µM 또는 0에서 2 nmol ascorbate의 ascorbate 표준물질 세트에 대한 일반적인 표준 곡선입니다. 여기에는 표시되지 않았으나, 96웰 플레이트의 경우 웰당 최대 8 nmol ascorbate까지 선형성이 유지되며, 이는 샘플 ascorbate 농도로 약 80 µM에 해당합니다. 본 분석법을 통해 웰당 0.25 nmol ascorbate 미만의 ascorbate 수준을 성공적으로 검출할 수 있습니다.K 5 62 세포는 세포 외 dehydro L ascorbic acid로부터 세포 내 ascorbate를 빠르게 축적하지만, ascorbate로부터는 축적하지 않습니다. 본 대표 실험에서는, PBS로 세척한 K 5 62 세포를 500 µM의 ascorbate, dehydro L ascorbic acid, dehydro L ascorbic acid 및 50 µM cyto B, ascorbate 및 5 mM cyanide, 또는 ascorbate 및 50 U/mL AO가 포함된 PBS에서 37 °C로 30분 동안 배양하였습니다. 세포 내 ascorbate는 이전에 설명한 방법으로 측정하였습니다.K 5 62 세포의 Dehydro L ascorbic acid 흡수는 촉진성 포도당 수송체 glute 매개 수송에 의해 일어나며, glutes가 dehydro L ascorbic acid 흡수에 관여하는지 평가하였습니다. 이 대표 실험에서는 dehydro L ascorbic acid와 함께 배양하기 전, K 5 62 세포를 농도를 높인 cyto B 또는 dihydro cyto B와 함께 배양하였습니다. cyto callin B와 dihydro cyto B 모두 마이크로몰 농도에서 운동 과정을 억제하지만, 단일 이중 결합의 존재 여부로 dihydro cyto B와 구별되는 cyto callin B만이 낮은 마이크로몰 농도에서 glute 의존적 수송을 억제한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.따라서, dehydro L ascorbic acid의 흡수가 IC 50 2.5 micromolar 미만에서 cyto B에 의해 억제된 반면 dihydro cyto. B에 의해서는 억제되지 않았으므로, dehydro. L ascorbic acid의 흡수는 아마도 glute 매개 수송을 통해 일어나는 것으로 보인다.또는, 세척된 세포를 dehydro L ascorbic acid와 함께 배양하는 동안, GLUT 수송 가능하지만 대사되지 않는 포도당 유사체인 three O methyl D glucose 또는 GLUT 수송이 불가능한 포도당 입체 이성질체인 L glucose의 농도를 높여 노출시켰습니다. 이번 결과 또한 GLUT가 dehydro L ascorbic acid 유입에 관여함을 나타내는데, 이는 세포 내 ascorbate 축적의 억제가 GLUT 수송 가능 포도당 유사체가 존재할 때만 발생하기 때문입니다. 두 번째 분석에서는.배양 세포로부터의 아스코르브산 유출 속도를 측정할 수 있습니다. 세포에서 아스코르브산의 방출은 비트랜스페린 결합 철의 아스코르브산 조절 세포 내 섭취에 있어 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 이 특정 분석법은 중요합니다. 비트랜스페린 결합 철의 섭취는 헤모크로마토시스와 같은 철 과부하 질환의 병태생리뿐만 아니라, 포유류 뇌 내의 성상세포-뉴런 간 철 교환 및 항상성과 관련이 있는 것으로 간주됩니다.실제로 주요 흥분성 신경전달물질인 L glutamate는 L glutamate의 섭취, 글리아스(glia)에 의한 흡수, 그리고 아마도 GLT one 및 그에 따른 세포 부종을 통해 추정 VSO에 의한 ascorbate 방출을 유도하는 방식으로 성상세포의 ascorbate 방출을 유발합니다. 이와 유사하게, ascorbate가 적재된 성상세포로부터의 ascorbate 방출은 흥분성 아미노산인 L aspartate에 의해 자극될 수 있으나, 비흥분성 아미노산인 L glutamine에 의해서는 자극되지 않습니다. 이러한 효과가 여기에 묘사되어 있으며, 이는 ascorbate가 적재된 생쥐 성상세포 일차 배양물에서 aspartate와 glutamine에 의한 ascorbate 방출 자극의 용량-반응 곡선을 보여줍니다.이 기술은 올바르게 수행될 경우 최소 2시간 만에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

이 비디오는 14개의 C-방사성 표지 기판을 사용하여 기판 산화 중에 방출되는 CO2에 대한 정량화 기술을 보여줍니다. 방출 된 14CO2 는 알칼리 용액에 갇혀 섬광 계수기에 의해 정량화됩니다. 서로 다른 기질의 산화는 조직마다 다르며 조직의 병태생리학적 상태를 반영합니다.

배양된 세포의 기질 산화 분석: 포획된 CO2의 방사성 신호를 측정하여 세포의 기질 산화를 정량화하는 체외 분석

이 비디오는 포유류 세포에서 원형질막 재밀봉 효율을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 세포는 세포막에 기공을 형성하는 박테리아 독소에 노출됩니다. 세포 외 칼슘 이온이 존재하면 기공은 칼슘 유입을 일으켜 막 재밀봉 사건을 유발합니다. 재밀봉 효율은 DNA 결합 프로피듐 요오드화물 염료를 사용하여 평가되며, 이 염료는 재밀봉된 멤브레인 없이 세포에만 들어갑니다.

원형질막 재밀봉 효율을 측정하기 위한 In vitro Fluorescence-based Assay

치료 화합물은 종종 첫 번째 생존 분석과 시험 관내에서 검사합니다. 인간의 관찰자에 의해 블라인드 세포 수는 세포 수의 작은 변화에 매우 민감 할 수 있지만 기능을 평가하지 않습니다. 컴퓨터 생존 분석, 여기에 설명 된대로 객관적인 구조와 기능을 모두 평가할 수 있습니다.

문화의 세포에 대한 생존 분석 실험

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

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세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

(1) 세포 내 세균 병원체를 표적으로 하는 진핵 세포 침투 항균제를 동시에 식별하고 (2) 진핵 세포 독성을 평가하기 위해 고처리량 실시간 분석이 개발되었습니다. 그 후 동일한 기술의 변형이 디지털 디스펜싱 기술과 결합되어 용이한 고해상도, 용량 반응, 2차원 및 3차원 시너지 연구를 가능하게 했습니다.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

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세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

고분해능 호흡 측정법을 이용한 일차 인간 망막 색소 상피 세포의 생체 에너지 실시간 분석

배우세요 배양 세포의 세포내 및 세포외 아스코르빈산 수준을 측정하는 중간처리량 마이크로플레이트 분석법을 통해 세포 대사 연구에 활용할 수 있는 비용 효율적인 방법을 확인하세요.

배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

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