Name: DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 DNA-가교 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제조 방법을 통해 조직 경도를 조절하고 세포 기능에 미치는 영향을 연구하는 기법을. 이 프로토콜은 생체재료 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 감사의 말씀을 프랭크 박사 지앙 박사 데이비드 린 박사 버나드 Yurke 박사 우다이 Chippada을 DNA 겔 기술을 개발에 대한 자신의 기여에 대한; 박사 노넬 Hadzimichalis, SMIT 샤 킴벌리 피터 맨, 자신의 의견이 원고의 편집 로버트 Arter; 척수에 뉴저지위원회 연구 (그랜트 # 07A-019-SCR1, NAL)와 뉴저지 신경 과학 연구소 (MLP)을 포함하여 자금 출처; 및 조직 공학 출판사, 부품이 권한은 그림 3을 다시 인쇄 할 수있는 권한에 대한 그림 2와 그림 4와 생체 재료를 다시 인쇄 할 수.

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
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<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
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<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
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<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
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<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
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<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

DNA 겔의 능력은 연화 시키거나 세포 접착 그들에게 세포 기능의 동적 강성 조직의 역할을 연구하는 이상적인 모델을 만든다 전후 완고. 세가지 설계는 기계적 및 생물학적 연구에 사용되었다. 그러나, 모든 세 개의 디자인 가교 길이는 DNA 겔 탄성 (표 2)에 영향을주지 않는 나타내는 각종 비율로 가교 유사한 탄력성이있다. 대조적으로, 아크릴 아마이드 농도는 탄성에 영향을 미친다. 이러한 디자인은 겔 붕괴 경향 때문에 가교 반응 속도에 따라 다를 수 있고, 또는 젤의 경향 미디어 또는 버퍼에 용해, 가교 결합의 길이가 증가함에 따라 감소한다. DNA 젤에 그러나 운동 정보는 제한되어 있지만, 우리는 가교의 추가 30 % 이일 50 %의 DNA 젤 11 L2 전달 후 발생 알고있다. 그럼에도 불구하고, 겔 연화 경직에서 팽창과 수축의 힘의 발생을 각각 분리하고 피할 수 없다18,21. 더 많은 에너지가 ssDNA를 18 세 스탠드 사이의 결...

정적 및 동적 기질은 세포의 기능에 조직 탄성 또는 강성의 영향을 연구하기 위해 개발 된 생체 물질의 두 가지 범주이다. 정적 기판은 세포가 도금 및 / 또는 일단 제작 된 후 물리적 속성을 변경할 수 없습니다. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔은 제어 공학 조사 5,17 위해 합성했다 제 이차원 정적 기판이었다. PA 젤은 다용도, 저렴, 쉽게 준비하고, 탄성 계수의 넓은 범위로 제조 될 수있다. 이 기술의 장점은 PA가 일반적으로 적용 기판 젤하게하지만, 정적 기판은 생체 내에서 세포 외 기질 (ECM) 및 주변 세포 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 예를 들면, ECM은 상해, 현상, 또는 질병의 결과로서 강성 변화를 겪는다. 동적 기판 따라서 제어 공학 연구에서 조직을 흉내 낸 기판 모델로 선호 <sup&gt; 22,24,25. 수많은 합성은 자연적인, 이차원, 삼차원, 정적 및 동적 생체 재료는 티슈 1,3,6,16,23,26 강성을 모방하기 위해 개발되어왔다. 몇몇 기판들은 동적 기계적 특성을 변경 2,4,7,8,12,15,16 열, UV, 전류, 이온, 및 pH 변화를 필요로하지만, 이들 자극은 하이드로 겔의 생체 응용을 제한 할 수있다. DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 (DNA 젤)은 동적 이차원 탄성 기판이다. DNA의 가교는 미디어에 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 첨가에 의한 DNA 젤 강성, 시간, 공간, 가역적 변조 허용하거나 9-11,13,14,18,21 버퍼. 자극이 탄성 변조 적용되는 상기 동적 젤과는 달리, DNA 젤은 탄성의 변화에​​ 대한 적용 ssDNA의의 확산에 의존하고 있습니다. 따라서 세포가 성장 상부 겔 표면은, 속도 오 때문에 변조 된 첫 번째 영역은F 탄성 변조 겔 두께에 의존한다. DNA 젤 그러나 비스 아크릴 아미드 가교는 DNA (그림 1)으로 구성 가교로 대체됩니다, 그들은 폴리 아크릴 아미드 백본을 가지고 그 자신의 PA 젤 대응과 유사하다. 두 ssDNAs (SA1 및 SA2)가 겔의 가교 결합 된 DNA를 만드는 가교제 스트랜드 (L2)와 함께 혼성화. SA1과 SA2는 모두 PA 네트워크에 효과적으로 통합하기위한 5 &#39;끝에 Acrydite 수정을 포함하는 별개의 시퀀스를 가지고있다. 젤, SA1과 SA2의 준비를위한 개별적으로 PA 백본으로 중합하고, 그 후, 중합 SA1과 SA2 함께 혼합된다. L2, 가교제는, SA1 및 SA2 혼합물에 첨가된다. L2의 염기 서열을 모두 SA1과 SA2에 상보적인 서열이며, L2는 DNA의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화. 초기, DNA 젤 탄력성 L2 농도 및 가교 (표 1 모두에 의해 결정된다 </strong&gt; 및 2). SA1과 SA2가 (100 % 젤로 지정) L2에 의해 백퍼센트 가교 때문에 L2, SA1, SA2와 동등한 화학 양 론적 양을 포함하는 DNA 젤은 뻣뻣한 젤입니다. 따라서 낮은 DNA 가교의 비율과, L2에서 결과의 낮은 농도, 부드러운 DNA 젤. (50 % 젤로 지정) 50 % 가교 낮은 젤은 9-11를 구성하고있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> 도 1 DNA 겔 가교 uncrosslinking 개략적 9-11,13,14,18,21 1 단계 :. SA1 (적색)과 SA2 (청색)은 개별적으로 폴리 아크릴 아미드 백본 (흑)로 중합된다. 중합 후, SA1과 SA2 중합 솔루션은 함께 혼합. 단계 2 : L2 (녹색)을 첨가하고, 겔의 가교 결합을 형성하기 위해 플러스 SA1 SA2와 혼성화된다. 3 단계 : R2는 t으로 하이브 리다그는 L2의 발붙일. 4 단계 : R2의 발붙일 하이브리드는 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다. PA 젤과는 달리, DNA 젤은 완고하고 합성 한 후 부드럽게. 이러한 이유로, DNA 겔상에서 성장한 세포를 동적 강성도 변화를 실시 할 수있다. 세포 접착 성 겔 완고, L2는 가교 결합의 비율을 증가시키기 위해 낮은 퍼센트 겔 배양 배지에 첨가 될 수있다. 세포 접착 성 젤을 부드럽게하기 위해, L2는 가교 10,13,21의 비율을 감소 제거 할 수 있습니다. L2는 L2가 SA1과 SA2 (표 1)에서 uncrosslink 할 수 있도록 3 &#39;끝에 추가 발붙일 순서가 있습니다. L2를 제거하여 R2라고 반전 가닥의 혼성화에 의해 달성된다. R2는 L2의 전체 길이에 상보과 L2의 발붙일와 제 혼성화. 발붙일 하이브리드는 가교을 제거하고 겔 강성을 감소 SA1과 SA2에서 L2의 압축 풀기를 추진한다. 이 보고서에서와지시 보강 및 DNA 젤 연화의 제조에 제공되는 단계별 비디오. 100 % 및 80 % 겔 제제가 기재되어 있지만,이 프로토콜은 다른 초기 및 최종 가교 백분율 DNA 겔을 만들 맞추어 질 수있다. 일반적으로, 100 % 및 80 % 겔은, 제조되는 유리 커버 슬립 상에 고정화 된, 작용 및 세포 시드. L2는 80 %의 겔 매체에 첨가하고 R2가 100 % 겔, 도금 후 48 시간의 매체에 첨가된다. 미디어 R2의 첨가는 가교 결합 된 80 % 100 % 겔을 부드럽게하는 반면 매체 L2의 첨가는 가교 결합 된 100 % ~ 80 % 겔을 경화된다. 보강 된 겔은 80 → 100 % 젤로 지정되어 연화 겔은 텍스트의 80 → 100 % 젤 지정되어 있습니다. 제어 또는 정적 젤, ssDNA를 들어 TS 구성된 또는 100 %와 80 %의 젤의 또 다른 세트에 전달된다. 탄성 변조 다음 두 최소 일 후, 세포를 처리 및 분석 할 수있다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA의 가교 </td><td rowspan="2"> 기지 # </td><td> 시퀀스 (발붙일) </td><td rowspan="2"> 수정 </td><td rowspan="2"> 녹는 온도 (T m의 ° C) </td><td rowspan="2"> 댓글 </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> 디자인 한 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>10 염기쌍으로 발 시퀀스가​​ 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG의 TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2는 L2에 상보 </td></tr><tr><td rowspan="4"> 디자인이 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.​​9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> 12 bp의 순서 발붙일 곳이 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2는 L2에 상보 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 사이트 디자인N 세 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT의 TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> 발붙일는 포함되어 있지 않습니다. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> 20 ~ 40 </td><td> AAA AAA (등) 또는 </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (등) </td></tr></tbody></table> 셀룰러 및 기계 연구 라 여러 가지 사용했다. ssDNA를 9-11,13,14,18,21 표 1 염기 서열ifferent 가교 디자인은 정적 및 동적 기계적 특성의 범위 DNA 젤을 생성합니다. 가교 디자인 변조 파라미터는 기본 시퀀스와 시퀀스 길이 또는 가교 길이이다. 굵게 및 기울임 꼴 글꼴은 SA1과 L2 사이에 각각 SA2와 L2 사이의 염기쌍을 보여줍니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> 디자인 </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 이 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 농도 (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 플러스 L2에 하이브리드 SA2 (% 가교) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;강한&gt; 탄성 (kPa의, ± SEM을 의미) </td><td> 6.6 ± 0.6 </td><td> 17.1 ± 0.8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10.4 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> 표 2 DNA 젤 9-11,13,14,18,21. 아크릴 아마이드 농도 비율 가교 결합 및 가교 길이의 영률 (E)의 DNA 젤에서 변조 될 수있다. 디자인 1, 2, 3은 각각 20, 28, 및 40 bp의 길이가 가교. 모든 설계를위한 100 % 젤은 젤 탄력에 영향을주지 않습니다 가교 길이를 나타내는 유사한 계수가있다. 하지만, 아크릴 아마이드 농도 변화는 DNA 겔 탄성을 변경.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>ssDNA를 소용돌이치지 마십시오. 바이알 및/또는 피펫 용액을 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.</td></tr><tr><td>칼슘과 마그네슘</td><td></td><td></td>이 함유된 PBS <td>모든 브랜드.</td></tr><tr><td>100x Tris-EDTA 완충액 (TE 완충액)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTA 완충액 (TBE 완충액)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE는 생식 독소입니다.</td></tr><tr><td>40% 아크릴아마이드 용액</td><td>Fisher Scientific(펜실베이니아주 피츠버그</td>)<td>BP14021</td><td>아크릴아마이드는 독소입니다.</td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>시그마-알드리치(St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>TE 완충액에 2% 용액을 준비합니다. APS는 독소이며 불쾌합니다.</td></tr><tr><td>테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>시그마-알드리치(St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>TE 완충액에 20% 용액을 준비합니다. TEMED는 가연성, 부식성 및 독소입니다.</td></tr><tr><td>직경 12mm 원형 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Norland 광학 접착제 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24-well tissue culture plate</td><td></td><td></td><td>Any brand.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td>모든 브랜드.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem 또는 Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com 또는 thermofisher.com</td><td>C111 또는 22589</td><td>사용 직전에 물에 0.315mg/ml 용액을 준비합니다. 37 &deg에서 용해; C와 여과기는 살균합니다. 필터에서 용해되지 않은 sulfo-SANPAH가 관찰되는 것은 정상입니다. Sulfo-SANPAH는 빛에 민감하므로 자외선에 노출될 때까지 빛으로부터 보호해야 합니다.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>물에 0.2 mg/ml 용액을 준비하고 여과하여 살균합니다.</td></tr><tr><td>Collagen Type I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>0.2 N 아세트산에 0.2 mg/ml 용액을 준비합니다. 용액은 중합을 피하기 위해 항상 차갑게 유지되어야 합니다. 아세트산은 가연성, 독성 및 부식성입니다.</td></tr><tr><td>22 x 60 커버 유리</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Positive-displacement pipette</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>UV light source</td><td></td><td></td><td>젤을 자외선에 최대한 가깝게 놓습니다. 자외선은 피부나 눈을 다칠 수 있습니다.</td></tr><tr><td>온도계</td><td></td><td></td><td>: 모든 브랜드.</td></tr><tr><td>질소 가스</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

제어 공학은 세포 형태와 기능을 연출 물리적 신호의 중요한 역할을 해결하는 새로운 과학 분야이다. 조직 경화 질병, 개발 및 부상으로 변조하기 때문에 예를 들어, 세포 기능에 조직 탄성 효과는 제어 공학 연구의 중요한 영역이다. 세포가 일단 도금 강성을 변경할 수없는 고정 조직 모방 재료, 또는 재료는 주로 세포의 기능에 대한 조직의 강성의 영향을 조사하기 위해 사용된다. 정적 스터디에서 수집 된 정보는 가치가 있지만, 이러한 연구는 생체 내에서 세포 미세 환경의 동적 특성을 나타내는 것은 아닙니다. 더 세포 기능에 동적 강성의 영향을 해결하기 위해, 우리는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔 시스템 (DNA 젤)을 개발 하였다. 다른 동적 기판과 달리, DNA 겔이 감소 또는 자극없이 제조 후 강성도를 증가시키는 능력을 가지고있다. DNA 젤은 DNA의 crossl 구성폴리 아크릴 아미드 백본으로 중합 잉크. 추가 및 단일 가닥 DNA의 전달을 통해 가교를 제거하는 것은 시간, 공간, 겔 탄성 가역 제어 할 수 있습니다. 우리는 DNA 젤 탄성 동적 변조 섬유 아세포와 신경 세포의 행동에 영향을 미치는 것을 이전 보고서에 표시했다. 이 보고서와 비디오에서 우리는 준비 DNA 젤에서 DNA 겔 가교 메커니즘과 단계별 지침을 설명하는 회로도를 제공한다.

우리의 연구에 앞서, 세포 ECM 상호 호환 생체 물질은 정적 또는 동적 비가역 단방향 기판 상에 관찰되었다. 이 기판은 정확하게 세포 미세 환경의 동적 특성을 반영하지 않습니다. 우리의 작업은 연화에 세포 ECM 상호 작용을 공부하고 동적 생체 재료를 보강하기위한 더 많은 생리 학적 모델을 제공함으로써 기존의 기술 패러다임을 이동합니다. 이전 연구에서, 우리는 이러한 젤에 다양한 세포 모폴로지 및 표현형을 조사하여 세포에 동적 기판의 효과를 분석 하였다. 일 예시에서는, 동적 DNA 젤에 섬유 모세포 형태를 평가함으로써, 섬유 아세포에 기판의 보강 효과를 판정. L929 세포, 마우스 유래의 섬유 아세포 세포주는 80 %와 100 %의 겔 (도 3) (11) 상에 도금 하였다. 이틀 후 도금, 20 % 추가 L2 액 가교 100 % (80 → 100 %, 센터 패널 젤 완고 80 % 겔에 첨가 하였다 매체). 백퍼센트 젤 80 % 젤의 또 다른 정적 (오른쪽과 왼쪽 패널 각각...

본 연구실은 더 세포 기능에 티슈 강성 변조의 효과를 이해하는 DNA 가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔, 하이드로 겔 동적 시스템을 개발했다. 여기서, 우리는 이러한 하이드로 겔을 제조하기위한 회로도, 설명, 및 프로토콜을 제공한다.

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 세포를 상단에 플레이팅한 후 배양액에 단일 가닥 DNA를 피펫팅하여 강도를 높이거나 낮출 수 있는 DNA 가교 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 제조하는 것입니다. 이를 위해 먼저 동결 건조된 SA one, SA two, L two, R two 및 대조군 단일 가닥 DNA를 버퍼에 재현탁하고, SA one 및 SA two 용액을 각각 폴리아크릴아마이드 골격 내로 중합시킵니다. 두 번째 단계는 SA one과 SA two가 중합된 용액을 L two 용액과 혼합하여 DNA 젤을 형성하는 것입니다.다음으로, DNA 겔 용액을 광학 접착제를 사용하여 유리 커버슬립 위에 고정합니다. 마지막 단계는 sul sampa와 PDL을 순차적으로 처리하여 겔을 기능화하는 것입니다. 최종적으로, DNA 겔 위에 세포를 플레이팅하고, R two L two 또는 대조군 단일 가닥 DNA를 첨가하여 겔의 탄성을 각각 약화시키거나 강화하거나 또는 변화시키지 않도록 조절합니다.이러한 실험 결과는 하부 기질의 동적인 특성이 세포 행동을 직접적으로 제어한다는 것을 보여줍니다. CRO, lingo, ball 하이드로젤과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술을 사용할 때의 장점은, DNA 겔은 탄성도를 조절하기 위해 UV와 같은 자극이 필요하지 않다는 점입니다. 대신, DNA 겔은 단일 가닥 DNA인 L two 또는 R two의 겔 내 확산을 통해 각각 경화되거나 연화됩니다. 먼저, 동결 건조된 SA one 단일 가닥 DNA를 2000 GS에서 15초 동안 원심 분리하여 모든 단일 가닥 DNA가 튜브 바닥에 모이도록 합니다.원심분리 후, 1x Tris-EDTA 또는 TE 버퍼 107 µL를 튜브에 첨가하여 3 mM SA one 용액을 준비합니다. 단일 가닥 DNA 펠릿이 완전히 녹을 때까지 SA one NTE 버퍼를 70 °C에서 5분 동안 가열합니다. 이후, 40% acrylamide 45 µL와 10x Tris-Borate-EDTA 또는 TBE 버퍼 18 µL를 첨가하여 SA one 중합 용액을 준비하고, 혼합이 잘 이루어지도록 원심분리합니다.P 200 팁을 끼우고 질소 가스 공급원을 용액에 연결한 다음, 2~3분 동안 질소 가스가 용액을 통해 천천히 흐르게 합니다. 다음으로, 용액을 모으기 위해 샘플을 2000 Gs에서 15초 동안 원심 분리합니다. 완료되면, 겔 중합을 개시하기 위해 4.5 µL의 2% ammonium per sulfate(또는 APS)를 샘플에 첨가하고, 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 균일한 중합을 위해 샘플을 원심 분리하여 용액을 모은 후, 중합을 촉매하기 위해 4.5 µL의 20% tetraethyl methylene diamine(또는 TEMED)을 샘플에 첨가합니다. 샘플의 혼합과 원심 분리가 끝나면, 중합을 완료하고 미반응 단량체를 최소화하기 위해 질소 가스로 3~5분 동안 용액의 가스를 제거합니다.그 다음, 실온에서 용액을 10분 동안 배양하여 중합 반응을 완료하고 SA one 중합 용액을 얻습니다. 동결건조된 SA two 단일 가닥 DNA를 사용하여 이전 단계들을 반복하며, 108 µL의 SA two 용액에 acrylamide, T-B-E, A-P-S 및 teed를 각각 45, 18, 4, 0.5 및 4.5 µL씩 첨가합니다. L two, R two 및 대조군 용액을 준비하려면, 앞서 설명한 것과 같이 동결건조된 단일 가닥 DNA를 원심분리하고 해당 동결건조 단일 가닥 DNA에 정해진 양의 TE buffer를 첨가한 후, 겔 용액을 위해 용액이 녹을 때까지 가열합니다.SA 1 및 SA 2 중합 용액을 70 °C에서 용액의 점도가 낮아질 때까지 약 1분 동안 가열하여 준비합니다. SA 1 중합 용액 10 µL 또는 10부를 SA 2 중합 용액 10 µL 또는 10부에 첨가합니다.그런 다음 SA 1과 SA 2 중합 용액을 70 °C에서 15초간 가열하고 피펫 팁으로 15초간 교반하는 과정을 반복하여 총 1분 동안 혼합합니다. 100% 젤을 형성하기 위해 100% L2 용액 6 µL 또는 6부 분량으로 혼합합니다. 앞서 설명한 대로 샘플을 혼합한 후, 100% 젤을 60 mm 페트리 접시에 피펫으로 옮기고 최적 어닐링 온도에서 1시간 동안 가열합니다.다음으로, 젤을 실온에서 4시간 동안 배양하여 DNA 가교 결합이 계속 재결합되도록 합니다. 실온에서 하룻밤 동안 배양한 후, 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS로 젤을 덮고, 페트리 접시에서 남은 버퍼를 제거한 다음 젤을 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 이때, 100% 젤을 70 °C에서 약 30초 동안 또는 젤의 점도가 낮아질 때까지 가열합니다.피펫팅을 위해 유리 커버슬립을 70 °C 가열 블록 위에 놓고 1~2분 동안 가열합니다. 각 유리 커버슬립에 광학 접착제를 한 방울씩 첨가합니다. 그런 다음 각 유리 커버슬립에 100% 겔 20 µL를 첨가하고, 겔이 녹아 표면에 퍼지도록 둡니다.겔이 들어 있는 각 유리 용기를 히트 블록에서 꺼내 24웰 조직 배양 접시에 넣습니다. 겔을 365 nanometer UV 광선에 15분 동안 노출시킵니다. 최적의 항문 온도에서 겔을 1시간 동안 가열하고 DNA 교차 결합이 4시간 동안 재하이브리드화되도록 기다린 후, PBS를 첨가합니다.그 다음 겔을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 후, 겔이 흡입되지 않도록 주의하며 피펫으로 웰의 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 각 겔이 덮이도록 sulfa sampa를 첨가합니다.젤을 365 nanometer UV light에 15분 동안 노출시킨 후, sulfa sampa를 제거합니다. 이전 단계들을 반복한 후, 과량의 sulfa sampa를 제거하기 위해 젤을 PBS로 한 번 헹굽니다. 0.2 mg/mL poly de lycine 약 300 µL 내에서 4 °C로 하룻밤 동안 젤을 배양합니다. 완료되면, 과량의 polylysine을 제거하기 위해 젤을 PBS로 5분 동안 두 번 세척하고 배지를 추가합니다. 젤을 배지에서 30분 동안 배양한 후, 세포 배양 및 이미징을 위한 세포 플레이팅 직전에 배지를 즉시 제거합니다.강성이 증가하는 겔에서 배양된 섬유아세포는 가로세로비(aspect ratio)의 변화는 없었으나, 100% 겔에서 배양된 섬유아세포보다 더 넓은 투영 면적을 나타냈습니다. 100% 겔에서 배양된 섬유아세포는 80% 겔에서 배양된 섬유아세포보다 투영 면적은 더 작고 가로세로비는 더 컸습니다. 이러한 결과는 섬유아세포의 거동이 미세환경의 동적인 특성에 따라 달라짐을 나타냅니다.연화 겔에서 배양된 뉴런은 1차 수지상 돌기 수나 축삭 길이에서 차이를 보이지 않았으나, 50% 겔에서 배양된 뉴런보다 1차 수지상 돌기의 길이가 더 짧았습니다. 섬유아세포 연구 결과와 마찬가지로, 정적 겔에서의 뉴런 표현형은 동적 겔에서의 뉴런 표현형과 달랐습니다. 50% 겔에서 배양된 뉴런은 100% 겔에서 배양된 뉴런보다 1차 수지상 돌기 수가 더 적고 축삭 길이는 더 길었습니다.이 절차를 수행할 때는 점성이 있는 겔을 정확하게 피펫팅하는 것이 매우 중요합니다. 농도가 겔의 파열을 방지하는 데 핵심적이므로, 정확한 피펫팅을 위해 여러 번의 시도가 필요할 수 있으며, 본 프로토콜의 고찰 부분에서 몇 가지 다른 대안을 제시합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

이 비디오에서는, 우리는 세포 배양에 적합 규격, 세포외 매트릭스 (ECM) 코팅 기판을 조작하는 데 사용되는 실험 기법을 설명하고, 견인 힘 현미경 의무가 있으며, 세포 행동 ECM의 강성의 영향을 관찰하는.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

우리는 최소한의 비용 또는 전문 지식을 갖춘 ECM 단백질의 직접적인 결합을 허용 히드 록시 PAAm라는 새로운 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔을 제시한다. 마이크로 콘택트 프린팅 휴대 mechanostransduction을 연구 천연 세포 미세 환경의 많은 큐들의 독립적 제어를 용이하게하여 히드 록시 PAAm의 조합은 하이드로 겔.

mechanotransduction의 큐의 영향 디커플링에 대한 히드 록시 PAAm 히드로 겔의 제조

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다.

망막의 수평 슬라이스 준비

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

배우세요 DNA-가교 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제조 방법을 통해 조직 경도를 조절하고 세포 기능에 미치는 영향을 연구하는 기법을. 이 프로토콜은 생체재료 및 세포생물학 연구에 활용됩니다.

DNA-가교 폴리 아크릴 아미드 하이드로 겔의 제조

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