Name: 전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 인간 간 사인 내피에서 전단 응력 조건 하 백혈구 모집 메커니즘을 연구하는 흐름 접착 분석법을. 이 방법은 만성 염증성 간 질환 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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SS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 중간 임상 친목, CW에 의해 투자된다.

1. 하는 마이크로 준비 <ol><li> 프리 코트 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I (220 ㎍ / ㎖가 작동 희석을주는 PBS 1:100으로 희석 RTC)와 여섯 채널하는 마이크로. 이것은 직접 채널로 희석 RTC 솔루션 30 μl를 주입하고 PBS 세 세척 한 다음 37 ℃에서 2 시간, 잠복기에 의해 수행된다. </li></ol> 2. Microslides에서 시드 셀 <ol><li> 트립신-EDTA에 (이전 13 설명 ​​된 간 조직에서 분리 된) 배양 된 인간의 간 사인 내피 세포의 합류 T75 플라스크 (HSEC)을 떼어 놓다, 전체 미디어 (인간의 내피에서 3 × 10 6 세포 / ml에서 PBS에 씻어에 resuspend 기초 매체는 2 ㎜의 L-글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토 마이신, 10 % 열 - 불 활성화 된 AB 혈청과, 혈관 내피 성장 인자 10ng의 / ㎖ 및 간세포 성장 인자 10ng의 / ㎖)으로 보충. 무서운 세포 현탁액의 30 μl를 주입ctly 각 채널에. </li><li> 세포가 37 배양기에서 1 시간 동안 준수 남겨 슬라이드 선반에 5 % CO 2 분위기로 C를 °. 세포는 완전 배지 (도 1)와 각 채널의 양쪽에 기입 포트를 부착시킨 후. </li></ol> 3. 세포의 사이토 카인 자극 <ol><li> 24 시간 동안 인큐베이터에있는 세포를 남겨주세요. 도립 위상차 현미경을 이용하여 세포 성장을 평가한다. 종래 접착 분석에 24 시간, 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마에 의해 보충 완전한 미디어, 10 NG / ㎖의 양으로 성장 배지를 교체함으로써 사이토킨과 내피 단층을 자극한다. </li></ol> 4. 말초 혈액 림프구의 분리 <ol><li> 초기 (800)에 25 분 동안 적절한 세포 분리 원심 매체 이상의 밀도 구배 원심 분리하여 단핵 분획을 정제하여 전혈로부터 말초 혈액 림프구를 분리X g. 단핵구의 부착을 허용하는 1 시간 동안 플라스틱의 세포를 품어. </li><li> 플라스틱 대기음을 준수 다음 림프구는 상층 액을 농축. 림프구를 세척하고 유동 매체 (일반적으로 1 X 10 6 세포 / ml (내피 기초 매체가 0.1 %를 함유 (V / V) 소 혈청 알부민 (BSA))을 재현 탁. </li></ol> 5. 억제제와 내피 세포 나 백혈구의 전처리 <ol><li> 내피 media/0.1의 % (V / V) BSA의 기능을 차단하는 항체 또는 작은 분자 억제제의 권장 희석을 준비합니다. 30 분 전에 분석 흐름을 선택하는 마이크로 채널에서 항체 / 억제제 차단 솔루션으로 전체 매체를 교체합니다. </li><li> 림프구에서 케모카인 수용체의 전처리가 계획되는 경우, (v / v) BSA 0.1 %를 함유하는 RPMI 용액 절연 백혈구를 재현 탁하고 케모카인 수용체의 G-단백질 결합 수용체 활성을 차단하는 백일해 독소 중에는 200ng / ㎖로 배양; 다르게 특정 희석 기능추천 희석에서 항체 또는 케모카인 수용체의 작은 분자 억제제를 차단. 다음 흐름 매체 씻어 재현 탁, 30 분 동안 37 ° C에서 백혈구를 품어. </li></ol> 6. 흐름 분석 시스템의 설치 <ol><li> 37 온도 조절 장치로 통제 투명 실을 Prewarm ° C. 챔버는 사실상 죽은 볼륨 세포와 미디어 사이의 전환을 가능하게하는 전자 솔레노이드 밸브의 실리콘 튜브 및 전자 공급 장치의 삽입을위한 포트가 있어야합니다. 챔버는 허용하도록 거꾸로 현미경에 장착된다 위상차 현미경.도 2는 현미경의 스테이지에 배치 된 유동 검정 챔버 및 현미경 및 마이크로 슬라이드를 보여준다. </li><li> 멸균 증류수 10 mL로 루어 락 50 ㎖ 유리 주사기를 미리 기입 및 주사기 포트에 25cm의 실리콘 튜브의 길이를 첨부. 주사기 펌프에 삽입합니다. 에 따라 주사기 펌프의 철수 속도를 변경0.05 (PA 0.5 다인 / cm 2,도 3)의 전단 응력을 유지하는 마이크로 제조업체의 지침. </li><li> 두 5 ㎖ 주사기를 가지고 플런저를 버리고 실리콘 튜브를 이용한 전자 솔레노이드 밸브의 두 가지의 흐름 포트에 배럴을 연결합니다. <ol><li> 아웃 플로우 밸브에 실리콘 튜브 12cm를 연결합니다. 밸브는 셀 무료 세척 버퍼 (내피 media/0.1의 % (V / V) BSA) 및 림프구 서스펜션 사이에 교대를 허용합니다. </li><li> 두 주사기 배럴 세척 버퍼를 삽입하고 버퍼가 한 통의 밸브를 통해 밖으로 흐름 실리콘 튜브에 흐르는함으로써 전자 솔레노이드 밸브를 세척합니다. </li><li> 다른 통에 대체 버퍼가 흐르는 모든 거품이 시스템에서 제거되는 것을 보장하기 위해 밸브 스위치를 사용합니다. 배럴 중 하나에서 세척 버퍼를 제거하고 림프구의 서스펜션도 4a로 교체. </li></ol></li><li> 실리콘 tubin 연결하는 마이크로 어댑터를 통해 선택하는 마이크로 채널의 하나의 포트에 주사기 펌프에서 g. 그런하는 마이크로 어댑터를 통해 반대 포트에 유출 밸브의 실리콘 튜브를 연결합니다. 실리콘 튜브 및 어댑터가 기포 시스템 (그림 4B)를 입력 방지하기 위해 연결하기 전에 세척 버퍼로 가득 있는지 확인합니다. </li><li> 일단 흐름 시스템에 연결된 현미경 무대에서하는 마이크로를 배치하고 이동을 방지하기 위해 클립이나 테이프로 부착합니다. 적절한 위상 설정과 함께 10X 목적에 현미경을 설정합니다. 내피 세포 단일 층이 가시화되어 있는지 확인하고 초점 안구 렌즈를 사용. 확인 이미지는 이미지 모니터로 중계하고 기록 할 수있다 현미경에 부착 된 카메라를 통해 포착 될 수있다. </li></ol> 7. 분석을위한 접착의 분석 기술 및 녹음 흐름 <ol><li> withdrawa을 시작하여 2 분 동안 세척 버퍼와 내피 층을 Perfuse이물질 또는 언 바운드 차단 항체를 분리 한 다음 0.05 펜실베니아의 일정한 벽 전단 응력에서 백혈구 용액 5 분간 볼 러스를 허용하도록 밸브를 전환 주사기 펌프의 리터 </li><li> 백혈구 루스의 마지막 2 분 동안, 마이크로 슬라이드의 길이를 따라 임의의 필드 (10)를 기록한다. 이 내피 세포 단일 층에 림프구 회전 / 테 더링의 오프라인 분석을 할 수 있습니다. 다음으로 이동하기 전에 약 10 초 동안 각 필드를 기록하고 녹음을 두 번 연속으로 같은 롤링 셀을 기록 피하기 흐름의 방향에 대해 수행되어 있는지 확인합니다. </li><li> 그 시작 위치로 밸브를 반환하여 세척 버퍼의 5 분의 알약과 백혈구의 알약을 따르십시오. 이 볼 루스의 마지막 2 분 동안 마이크로 슬라이드의 길이를 따라 적어도 10 임의로 선택된 필드를 선택하여 제 2 기록 단계를 수행한다. 다음으로 이동하기 전에 약 5 초 동안 각 필드를 기록하고 확인하는 내피 세포의 단일 층 및 부착 leucoc, 킬로바이트는 명확한 초점에 있습니다. 이 접착 패턴의 오프라인 분석을 할 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지

성공적 유동 검정을 수행하기위한 가장 중요한 단계는 내피 세포의 건강과 합류 단층 전에 유동 접착 분석 준비가되었다는 것을 보장한다. 기본 내피 세포는 문화 어렵고 배양 방법의 변화에​​ 민감 할 수 있습니다. 그것은 1) 유량 용기가 적절하게 균일 단층의 내피 세포로 코팅하는 것이 중요합니다; HSEC에 대해 우리는 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I를 사용하지만 다른 내피 인구 다를 수 있습니다, 2) 문화 매체를 들면, 세포 유형에 적합한 HSEC 우리는 프로토콜 섹션에서 우리의 완전한 매체를 설명했다. 다른 중요한 단계는 전단 응력의 생리적 인 수준을 반영하도록 적절한 속도로 시린지 펌프를 설정 있습니다. 유동 검정시에는 내피 단층 손상 또는 내피 세포 표면에서의 면역 세포를 제거 할 수 유동 회로 내에서 기포를 방지 할 필요가있다. 이는 EN에 의해​​ 방지 될 수있다모든 실리콘 튜브 및 어댑터는 모든 기포를 제거하고 용지를 사용하기 전에 예비 가온되는 것을, 연결 전에 세척 버퍼로 관류하는 것을 suring. 는 액체 / 액체 계면이 연결 중에있어 매우 중요하다 마이크로 슬라이드상의 포트에 어댑터를 연결하는 경우에 공기가 존재하는 경우, 이것은 주사기 출금 중에 내피 단층을 방해한다 시스템 내에서 에어 갭을 형성 할 것이다 단계. 시린지 외통의 백혈구 세포 용액 따라서 실험 내내 일정한 셀 밀도를 유지하고, 침전하지 않도록 일정한 교반이 필요하다. 기록 단계 동안에 그것 내피 층의 화상이 적절히 집중하고 정확한 오프라인 분석을 허용하도록 클리어되고 보장하는 것이 중요하다, 즉 유동 검정 (포스트 백혈구 볼 러스)의 두 번째 단계 동안 충분한 시간은 세척 완충액 중에 남아 녹음하기 전에 단계는 다음을 보장하기 위해보다 추천모든 비 접착 성 백혈구가 제거됩니다. 유사하게는 좁은 모세관에서 흐름 패턴을 방해 할 세포의 손실을 방지하고, 또한 위상차 현미경 하에서 큰 부착 백혈구로부터 구별하기 어려울 수있는 적절한 밀도의 단층에서 내피 세포를 사용하는 것이 필수적이다. 우리는 인간의 간 사인 내피 세포에 대한 최적의 파종 밀도를 설명 그러나 이것은 다른 내피 인구와 종 사이에 차이가있을 수 있습니다. 상당한 진전이의 intravital 현미경으로 동물 모델에서 백혈구 모집을 공부에서했다. 유동 접착 분석 방법의 주요 장점은 백혈구 모집 일차 인간 내피 세포와 이진 시스템에서 연구 될 수 있다는 것이다. 또한, 이러한 상호 작용은 전단 응력의 생리 관련 수준에서 공부하실 수 있습니다. differenc이있을 수 있으므로 그것은 인간의 셀룰러 시스템과 동물의 intravital 연구의 연구 결과를 확인하는 것이 중요하다종 사이의 내피 세포의 특성 에스. 유동 검정의 한계 중 하나는 백혈구 모집 내피 단층의 단세포 환경에서 연구되고 있다는 것이다. 백혈구가 내피를 통해 접착 transmigrated 일단 또한 그들은 격리 및 다운 스트림 공정을 실시 할 충분한 수의 존재에 있지 않을 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구하고 유동 접착 분석은 마스터 링 된 후에는 백혈구 접착 캐스케이드의 추가 분석을 수행하도록 개발 및 다세포 환경 요점을 되풀이하도록 구성 될 수있다. 단일 필드 및 추적 소프트웨어의 사용의 장시간 녹음이 백혈구의 크롤링 동작을 분석하는데 사용될 수있다. 또한 유동 검정 완료시 microslides보다 상세히 접착 및 이주를 연구하는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 면역 형광 라벨을 이용하여 심문 할 수있다. 또한, 우리는 이전에 개발 한흐르는 백혈구가 간세포의 존재에 의해 에어컨 간 내피 세포와 상호 작용 할 수있는 시험 관내 모델 에드. 이 분석은 또한 백혈구의 모집단을 연구하기 위해 개발 될 수있다 : 우리 그룹은 규제 T 세포, B 세포, 간 침투 백혈구 등의 부분 집합으로 연구를 수행하고있다. 이러한 연구 흐름 접착 분석은 인간의 시스템에서 일반 및 기관 특정 백혈구 모집을 연구하는 강력한 도구입니다 증거입니다.

그것은 지금 잘 일반적으로 백혈구 모집은 다단계 접착 폭포 1의 패러다임을 따르도록 설정됩니다. 이 혈관 벽을 일렬로 세우는 내피 세포로 흐르는 혈액에서 백혈구의 캡처를 포함한다. 처음에는 백혈구는 수용체 또는 면역 글로불린 슈퍼 패밀리의 구성원을 셀렉틴에 의해 매개되는 압연 단계를 받고있다. 이는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)가 내피 글리코 칼 릭스에 제시 케모카인에 의해 활성화되는 백혈구 표면에 발현한다. 이 백혈구의 표면에 &#39;친 화성이 높은&#39;상태로 인테 확인의 변경에 이르게 체포 및 내피 세포에 회사 접착. 밀착성이어서 용기에 백혈구의 형상 변화와 크롤링하여 이어진다. 마지막 단계는 세포층 또는 세포 횡단 루트를 통해 발생할 수있는 내피 세포 단일 층을 통해 윤회입니다. 다단계 접착 계단식 설명하면서의 신체 내에서 백혈구 모집의 일반적인 메커니즘은 특정 기관의 차이가 있습니다. 간에서 백혈구 모집의 대부분은 채용 일반적 후 모세관 세정맥 (2) 내에 발생하는 다른 장기에 대비 간 정현파들 내에 발생한다. 간 사인 곡선은 낮은 전단 환경이며, 백혈구는 독립적 인 2 셀렉틴되어 접착력을 굳게하기 전에 간단한 테 더링 단계를 받고있다. 이 채널은 불연속 및 fenestrae, 직경 모공 100 ~ 200 nm의를 포함하는 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어와 기저막 3 부족합니다. 인간의 간 사인 내피를 통해 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 해명하는 기관에게 염증성 간 질환에 대한 구체적인 치료 목표를 식별 할 수 있습니다. 흐름 접착 분석은 백혈구 모집을 공부에 필수적인 도구입니다. 그들은 수 백혈구 recru의 재건잘 정의 된 힘에서 접착력을 분석하는 전단 응력의 존재 itment. 분석에 대한 가장 자주 사용하는 배양 내피 세포 단일 층 또는 정제 된 기판에 연구 백혈구의 부착입니다. 시판 유동 챔버는 두 개의 평면 표면들 사이 층류 조건 하에서 세포를 perfuse 후 현미경 (4)에 접착 동적 프로세스를 시각화하는데 사용된다. 이전 그룹은 특정 접착제의 상호 작용은 흐름에서 일어날 것을 증명하고 정적 분석 5,6에서 공부 할 수 없습니다. 우리는 간 사인 곡선을 요점을 되풀이 낮은 전단 응력 조건에서 백혈구 모집을 연구하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 인간의 기본 HSEC이 microslides 및 백혈구의 배양은 다음 간 사인 곡선 내에서 전단 응력을 재현하기 위해 계산 된 유량의 비율이 단층을 통해 관류 할 수 있습니다. 전단 응력은 OPP로 표면에 평행 한 접선인가 스트레스수직 수직 응력에 osed. 경계를 따라 이동하는 유체는 그 경계에 전단 응력을 발휘합니다. 전단 응력은 림프구 윤회 7의 필수 구성 요소로 표시되었습니다. 이러한 조건에서 접착 캐스케이드의 각 단계는 위상차 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 이 방법은 기존의 접착 분자 (8)의 연구, 케모카인 및 케모카인 수용체 9-11의 역할과 같은 혈관 접착 단백질 1 (VAP-1과 같은 비정형 부착 분자를 포함하는 간 내 백혈구의 채용에 중요한 통찰력을 허용했다 ) 8,12 일반적인 림프와 혈관 내피 수용체 1 (CLEVER-1) 13. 이 분석은 우리 그룹의 출판물의 여러 가지에 언급 된 반면, 그 설명을 간략하고있다 그리고 우리는 문제 해결에 도움이 기술적 오류를 방지하는 단계를 안내하여 상세한 단계를 제공하기 위해이 기회를 촬​​영했을 때 시도분석을 보내고. 또한, 우리는 최근에 전단 응력의 정확한 변경을 허용하는 마이크로 챔버의 소싱을 변경했습니다. 우리는이 다른 내피 세포와 면역 세포에 대한 분석의 적용 가능성을 넓혀 생각합니다. 다음의 방법은 인간의 간 사인 내피 세포 및 말초 혈액 림프구와 흐름을 기준으로 접착 분석을 수행하기위한 준비와 기술에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>6채널 마이크로슬라이드 VI 0.4 플로우 챔버&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td>다른 채널 크기 및 사전 코팅된 슬라이드는 분석 요구 사항에 따라 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플로우 어댑터&nbsp; microslide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80646</td><td></td></tr><tr><td>플로우 분석 챔버</td><td>Solent Scientific</td><td>33-3322</td><td>이 챔버는 현미경 및 액세서리 모델에 투자하는 회사에서 맞춤 제작합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>도립 현미경 IX2</td><td>올림푸스, 영국</td><td>모델 IX50</td><td></td></tr><tr><td>하버드 주사기 펌프</td><td>하버드 장치, 영국</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>전자 솔레노이드 밸브</td><td>Lee Products Limited, 영국</td><td>부품 번호 LFYA1226032H</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙 대형</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50855</td><td>내경 2mm, 외경 4mm</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙-소형</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50853</td><td>내경 1mm, 외경 3mm</td></tr><tr><td>Harvard Glass Syringe</td><td>Harvard Apparatus, UK</td><td>55-0962</td><td></td></tr><tr><td>세포 분리 배지/림프액</td><td>VH Bio</td><td>CL-5020</td><td></td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr></tbody></table>

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

인간의 간 조직에 백혈구 침윤 모든 성인 염증성 간 질환의 일반적인 과정이다. 만성 침투 간경변 섬유증과 진행의 발전을 구동 할 수있다. 간으로 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 간 질환의 중요한 치료 표적을 식별 할 수 있습니다. 백혈구 모집 중에 키 상호 작용은 전단 응력의 조건에서 내피 세포와 염증 세포의입니다. 간을 모집 간 사인 내피 세포 (HSEC)에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 낮은 전단 채널 내에서 발생합니다. 간 정현파 내의 조건은 특정 유속 인간 HSEC 단일 층으로 늘어선 채널을 통해 백혈구를 관류하여 효과적으로 요약 할 수있다. 이러한 조건에서 백혈구가 내피에 걸쳐 크롤링 단계 이후의 윤회 다음 활성화 및 밀착성 다음에 간단한 테 더링 단계를 거쳐층. 위상차 현미경을 사용하여,이 &#39;접착 캐스케이드&#39;의 각각의 단계는 시각 및 오프라인 분석 하였다 기록 될 수있다. 내피 세포 또는 백혈구는이 과정에서 특정 분자의 역할을 결정하기 위해 억제제로 전처리 할 수​​있다.

이 분석은 다단계 흐름 접착 폭포를 시각화 및 분자 억제제에게 제어의 실험 결과를 비교하여 내부의 분자 메커니즘을 규명 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 다양한 혈관 침대는 특정 내피 세포를 통합 및 전단 응력 조건을 변경하여 효과적으로 요약 할 수있다. 점착 캐스케이드의 각 단계는 프로토콜에 명시된 기록 방법에 따라 오프라인에서 분석 될 수있다. 접착 캐스케이드의 첫 번째 단계는 전체 부착 세포의 백분율로 표현 될 수 백혈구 롤링이다. 오프라인 분석은 부착 세포의 수는 백혈구 러스 동안 각 기록 분야에서 열거 할 수있다. 이미지의 재생이 단단히 부착과 내피 세포를 통해 회전 운동을 겪고있다들이다 세포의 비교를 할 수 있습니다. 회전 운동은이 기술을 이용하여 가시화 될 수 있으며, 각 필드는 적어도 10 초 동안 기록된다. 롤링 세포는 세포를 흐르는에 비해 내피 세포의 표면에 자신의 감소 속도에 의해 식별됩니다. 이 문제는 분리하지 않고 적어도 5 초 동안 입증해야합니다. 간 정현파 내의 접착 폭포는 낮은 전단 환경에서 발생하는 생체 내 연구에서 단지 짧은 테 더링 단계를 최소한의 회전을 확인했다. 우리는 흐름 분석이 부착 백혈구의 10 % 미만은 지속적으로 이러한 분석에 이상 HSEC 자극 롤 시연으로 간 사인 곡선의 환경을 반영하고 있음을 확인했다. 접착 캐스케이드의 다음 단계는 밀착성이다. 다운로드 고수 세척 완충액 러스 (단계 7.3) 중에 기록의 두 번째 단계에서 계산 될 수있다. 오프라인 분석을 단단히 부착 세포의 총 수 (그림 5) 각 필드에 계산 될 수 있습니다. 단단히 부착 세포를 고정 또는 느린 크롤링 동작과 shapechanged 있습니다 세포로 정의됩니다.필드 당 세포의 평균 수는 계산 될 수있다. 이 도면은 다음의 범위를 표현하기 위해, 림프구 (통상적으로 1 × 106 세포 / ml)의 농도 및 유량을 (눈금 상당을 사용하여 결정) 시야의 전체 표면적과 함께 사용될 수있다 부착 세포 / mm로 림프구 준수 2 / 10 6 세포를 관류. 접착의 패턴을 공부하는 것은 접착 계단식, 모양 변화 등 크롤링 및 내피 마이그레이션의 마지막 두 단계의 분석을 포함한다. HSEC 단일 층의 상부면에 부착 백혈구 위상 밝은 단일 층을 통해 이주하는 그 동안의 위상이 어두운 (그림 6)가 나타납니다. 세포는 &#39;정적&#39;접착 (nonmigrated / 라운드) 전시로 분류 된 &#39;형상 변경&#39;형태 또는 &#39;이주&#39;와 같이 각각의 범주는 다음의 비율로 표현 될 수있다총 접착제 인구. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> 그림 1. 흐름 챔버 내의 인간의 기본 간 사인 내피 세포의 단층. 미디어가 이전의 흐름 접착 분석 합류 내피 단일 층의. B) 단계 대비 이미지의 시작에 내피 세포의 단일 층을 포함 가득) Microslides, 내피 세포 (인간의 간 내피 세포에 대해이 함께해야한다 예비 코팅 된 마이크로 슬라이드에 접종해야 쥐의 꼬리 콜라겐 1 형)과는 내피 세포가 문화와 합류에 건강한 것이 중요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 분석 챔버를 흐른다. 유동 검정 챔버 셋업 여기서 알 수있는, 그것이 거꾸로 현미경에 장착 투명한 챔버로 구성된다. 히터는 상기 챔버에 배치되고 온도 조절 37 ℃의 온도를 유지하도록 제어되어야 외부에있는 주사기 펌프 챔버 내의하는 마이크로에서 실리콘 튜브를 연결할 수있는 포트가 있어야합니다. 마이크로 슬라이드는 현미경 단계에 직접 배치된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> 그림 3. 펌프 주사기. 주사기 펌프에 연결합니다유량 용기에 실리콘 튜브를 통해 에드. 펌프는 분석에 필요한 원하는 전단 응력에 따라 특정 철수 속도로 설정되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> 그림 4. 밸브가 플러시 두 배럴이 밸브의 실리콘 튜브, 설정되면 유량 용기에 밸브를 연결.) 전자 솔레노이드 밸브)는 사실상 죽은 공간. B와 세포 또는 미디어 중 하나를 포함하는 두 주사기 배럴 사이를 전환 할 수 있습니다 흐름 챔버에 연결된다. 그것은 유량 용기의 포트에 실리콘 튜브에 어댑터를 연결할 때 액체 / 액체 인터페이스가하는 것이 중요합니다. &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;는&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> 그림 5. 총 백혈구 부착의 측정. 세척 완충액 러스 단계 (프로토콜에 기술 된)의 마지막 두 분간, 열 랜덤 필드의 최소 기록되어야한다. 이러한 오프 - 라인 분석 할 수 단단히 부착 세포의 총수는 각 필드에 계산 될 수있다. 백혈구의 총 접착 제어 챔버 및 항체를 차단 전처리 그 사이에 비교 될 수있다, 우리가 제어 슬라이드의 대표 필드와 세포 접착 분자 1 (ICAM-1) 차단 항체로 전처리 슬라이드를 보여줍니다. 화살표는 표상에 부착 백혈구을 강조하기 위해 추가되었습니다제어 슬라이드에서 필드를 심하게 배 식별 (25) 백혈구의 총이있다 및 ICAM-1 블록 슬라이드에서 확인 된 13 백혈구의 총이있다. = 100 μm의 스케일 바는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> 그림 6. 기록 필드의 위상 콘트라스트 현미경으로 내피 단층에 백혈구 부착 패턴의 분석. 오프라인 분석은 또한 백혈구의 부착 방향과 속도를 연구하기 위해 사용될 수있다. 점착 캐스케이드의 특정 단계는 시각 및 위상차를 촬상하여 정량화 될 수있다. 활성화 단단히 부착되지 않지만 단계 밝은 세포는 &#39;라운드&#39;접착, 활성화되는 세포라고 할 수 있습니다D 및 위상 밝은 &#39;형상을 변경&#39;라고 할 수있는 위상 어두운 세포가 내피 마이그레이션을받은와 &#39;이주&#39;라고 할 수있는 세포입니다. 이미지는 접착의 각 패턴의 예를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 생리적 수준의 전단 응력(shear stress)이 존재하는 환경에서 인간 간 내피세포를 통한 백혈구 모집 기전을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마이크로 슬라이드에 인간 간양성 내피세포(human hepatic sinusoidal endothelial cells)의 합류 단층을 형성한 후, 염증성 사이토카인을 통해 자극을 줍니다. 두 번째 단계는 말초 혈액에서 림프구를 분리하는 것입니다.다음으로, 마이크로 슬라이드를 유동 분석 시스템에 연결하고 생리학적으로 유의미한 전단 응력이 존재하는 상태에서 림프구를 관류시킵니다. 마지막 단계는 위상차 현미경을 사용하여 유동 조건 하에서의 림프구 상호작용을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 유동 분석 중에 획득한 위상차 이미지의 오프라인 분석을 통해 간 혈관내피세포 전반에 걸친 림프구 모집에 미치는 다양한 억제제의 효과를 비교합니다.이 방법은 어떤 접착 단백질과 케모카인 수용체 조합이 시누소이달 내피세포를 거쳐 간 실질로 다양한 면역 세포군을 모집하는 데 중요한지와 같은 간장학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 활용 가능성은 만성 염증성 간 질환의 치료로 확장되며, 이러한 질환의 대부분은 간 조직으로의 림프구 모집에 의해 유발됩니다. 분자적 기전을 이해함으로써 새로운 항염증 치료법을 개발할 수 있을 것입니다.이 방법은 염증 세포의 인간 간 모집에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 탯줄 정맥이나 다른 혈관상에서 분리한 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용될 수 있습니다. 우선, 스톡 용액을 멸균 PBS로 희석하여 200 µg/mL 농도의 1형 쥐 꼬리 콜라겐 작업 용액을 준비하십시오.그 다음, 희석된 콜라겐 30 µL를 6채널 마이크로 슬라이드의 각 채널에 주입하고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 이어서, human endothelial basal media에 L glutamine, penicillin, streptomycin, heat inactivated ab, human serum, vascular endothelial growth factor 및 hepatocyte growth factor를 첨가하여 완전 배지를 준비합니다. 그런 다음 trypsin EDTA를 사용하여 confluent 상태의 T 75 플라스크에서 배양된 human hepatic sinusoidal endothelial cells를 수확하고, 세포를 펠렛화하여 PBS로 세척한 후, 완전 배지에서 3 × 10⁶ cells/mL 농도로 재부유시킵니다.다음으로, 마이크로 슬라이드를 PBS로 3회 세척한 후, 콜라겐이 코팅된 마이크로 슬라이드의 각 채널에 세포 현탁액 30 µL를 첨가합니다. 37 °C, 5% CO2 분위기의 습윤 배양기에서 1시간 동안 세포를 부착시킵니다. 세포가 부착되면 각 채널 양측의 포트에 완전 배지를 채우고 24시간 동안 다시 배양기에 넣습니다.24시간 후, 도립 위상차 현미경을 사용하여 세포 성장이 80% 합류도(confluency)에 도달했는지 확인합니다. 다음으로, 1 mL의 완전 배지에 10 ng/mL TNF alpha와 10 ng/mL interferon gamma를 첨가하여 세포 자극을 위한 사이토카인을 준비합니다. 그다음 부착 분석을 수행하기 24시간 전에 세포 성장 배지를 0.1 mL의 사이토카인 보충 배지로 교체하여 세포를 자극하고, lympho light와 같은 적절한 세포 분리 원심분리 배지를 사용하여 800 ×g에서 25분 동안 밀도 구배 원심분리를 수행함으로써 전혈에서 단핵구 분획을 정제합니다.그런 다음 단핵구 분획을 새 튜브로 옮기고 0.1% volume per volume BSA가 함유된 PBS를 가득 채운 뒤, 125 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 용액 내의 혈소판을 제거합니다. 다음으로, 0.1% volume per volume BSA가 함유된 PBS로 펠릿을 세척한 후, 800 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 0.1% volume per volume BSA가 함유된 10 mL의 RPMI에 재현탁하고, 세포를 조직 배양 처리된 T 75 플라스크에 넣은 뒤 분획 내 단핵구가 부착될 수 있도록 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 림프구가 농축된 상층액을 조심스럽게 제거하고 800 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 형성합니다. 그 후, 0.1% v/v BSA와 200 ng/mL의 백일해 독소 특이적 기능 차단 항체 또는 케모카인 수용체 소분자 억제제가 포함된 RPMI 용액에 림프구를 재현탁하여 분리된 림프구를 전처리합니다. 억제제 용액 내에서 림프구를 37 °C에서 30분 동안 배양한 다음, 세포를 원심분리하여 침전시키고 0.1% v/v BSA가 포함된 PBS로 세척합니다.그 다음 세포를 다시 펠렛화하고, 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 유세포 분석용 배지(flow medium)에 재현탁합니다. 온도 조절이 가능한 투명 환경 챔버를 37 °C로 예열합니다. 챔버에는 실리콘 튜브를 삽입할 수 있는 포트와 솔레노이드 밸브용 전자 공급 장치가 포함되어 있어야 합니다.루어 락(lure lock)이 장착된 50 milliliter 유리 주사기에 10 milliliters의 멸균 증류수를 채웁니다. 그다음 25 centimeter 길이의 실리콘 튜브를 주사기 포트에 연결하고 주사기를 주사기 펌프에 삽입합니다. 마이크로 슬라이드 제조사의 지침에 따라 펌프의 흡입 속도를 조절하여 0.05 pascals 또는 0.5 dines per square centimeter의 전단 응력을 유지합니다.5 mL 시린지 2개에서 플런저를 제거하고, 1 cm 실리콘 튜브를 사용하여 시린지 배럴을 전자 솔레노이드 밸브의 유입 포트 2개에 연결합니다. 그 다음, 유출 밸브에 12 cm 실리콘 튜브를 연결합니다. 두 시린지 밸브에 세포가 없는 세척 버퍼를 넣고 전자 솔레노이드 밸브를 플러싱합니다.완충액이 하나의 배럴에서 밸브를 통해 유출 실리콘 튜브로 흐르는지 확인하십시오. 다음으로, 밸브 스위치를 다른 배럴로 돌려 완충액이 계속 흐르는지 확인하십시오. 시스템 내의 모든 기포를 제거하십시오.그 다음, 배럴 중 하나의 세척 버퍼를 1 × 10⁶ cells/mL 농도의 림프구 현탁액으로 교체합니다. 시린지 펌프의 실리콘 튜브를 마이크로 슬라이드 어댑터를 사용하여 선택한 마이크로 슬라이드 채널의 한쪽 포트에 연결합니다. 이어서 유출 밸브의 실리콘 튜브를 마찬가지로 마이크로 슬라이드 어댑터를 이용해 동일한 마이크로 슬라이드 채널의 반대쪽 포트에 연결합니다.다음으로, 움직임을 방지하기 위해 클립이나 테이프로 마이크로 슬라이드를 현미경 스테이지에 고정합니다. 관류를 시작하기 전에 현미경을 적절한 위상 설정과 함께 10 x 대물렌즈로 맞춥니다. 카메라가 현미경에 제대로 장착되어 녹화를 위해 모니터로 영상을 전달할 준비가 되었는지 확인하십시오.내피세포 단층의 초점이 정확한지 확인한 후, 시린지 펌프를 이용해 시린지를 후퇴시켜 세포가 포함되지 않은 세척 버퍼로 2분 동안 내피세포 층을 관류함으로써 잔해물이나 결합되지 않은 블로킹 항체를 제거하십시오. 그런 다음 밸브를 전환하여 림프구 용액을 5분 동안 일정한 벽 전단 응력으로 볼루스 투여하십시오. 림프구 볼루스 투여의 마지막 2분 동안 전단 응력은 0.05 pascals로 유지합니다.마이크로 슬라이드 길이를 따라 임의의 구역 10곳을 각각 10초 동안 기록하십시오. 각 기록 사이의 이동은 흐름의 반대 방향으로 이루어져야 합니다. 동일한 구르는 세포를 중복으로 기록하는 것을 방지하기 위해, 림프구 볼루스 투여 후 밸브를 시작 위치로 되돌려 5분 동안 세포가 없는 세척 버퍼 볼루스를 흘려주십시오.무작위로 선택한 10개 영역에 대해 각각 5초 동안 두 번째 스캔을 기록합니다. 이 볼러스 투여의 마지막 2분 동안, 본 유동 분석 기술을 사용하여 림프구의 롤링 운동을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 롤링 세포는 흐르는 세포와 비교하여 내피 표면에서의 속도가 감소한 것으로 식별됩니다.본 유동 분석(flow assay)에서, 자극된 내피세포 위에서 지속적으로 롤링(rolling)하는 부착 림프구의 비율은 10% 미만이었으며, 이는 유동 분석이 간정맥동(hepatic sinusoids)의 환경을 반영함을 확인시켜 줍니다. 세척 완충액 볼루스(wash buffer bolus)의 기록은 총 림프구 부착도를 평가하는 데 사용됩니다.강하게 부착된 세포는 정지 상태이거나 형태가 변하며 느린 크롤링 행동을 보이는 세포로 정의됩니다. 여기 제시된 것은 대조군 슬라이드와 세포 간 접착 분자 1 차단 항체로 전처리한 슬라이드의 대표적인 시야입니다. 각 조건에서 림프구 부착 정도는 관류된 백만 개 세포당 제곱밀리미터당 부착 세포 수로 표시됩니다.이 절차 이후에는 전내피세포 이동의 정확한 경로 또는 전단 응력 하에서의 보충 과정 중 발생하는 세포골격 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 공초점 현미경 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 간 또는 다른 장기의 염증을 연구하는 연구자들이 장기 특이적 내피세포 집단이 백혈구 보충 과정을 어떻게 조절하는지 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 간 내피세포를 통한 림프구의 보충을 평가하고, 부착 단계의 각 단계별로 면역 세포의 수를 산정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 보고서는 physiologic 전단 응력 하에서 백혈구 내피 상호 작용을 공부를위한 병렬 플레이트 흐름 챔버 분석의 시각적 묘사를 제공합니다. 이 방법은 트리거 백혈구가 내피 세포 표면에 롤링되는 내피 (E) - selectin과 E - selectin 백혈구 리간드의 역할을 조사에 특히 유용합니다.

Microvascular 내피에 Physiologic E - Selectin - 중재 백혈구의 롤링 분석

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

이 비디오는 백혈구와 내피 세포와 같은 세포 파트너의 상호 작용을 특성화하기 위한 층류 기반 분석을 보여줍니다. 이 방법은 혈관 세포의 손상되지 않고 합류하는 층에 관류될 때 백혈구의 접착, 데데젼 및 전이에 대한 동적 통찰력을 제공합니다.

백혈구와 내피 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위한 층류 기반 분석

접착 실험에 사용되는 유동 챔버는 일반적으로 선형 유동 경로로 구성되며 전단 접착 맵을 생성하기 위해 서로 다른 유속으로 여러 실험이 필요합니다.  SynVivo-SMN을 사용하면 마이크로리터 부피를 활용하는 단일 실험을 통해 전단 접착 맵을 생성할 수 있으므로 시간과 소모품을 크게 절약할 수 있습니다.

SynVivo 합성 미세 혈관의 네트워크를 사용하여 전단 접착지도의 생성

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

여기서는 조사자 마우스 순환계 유래 내피 부착 분자로 코팅 챔버를 연결하여 백혈구 보충 생체 역학을 평가할 수 있도록하는 프로토콜을 제시한다. 이 상대적인 생물학적 조건하에 백혈구 평가 가능 때문에이 방법은 상당한 이점을 제공한다.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가 전의 VIVO Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

여기, 우리가 특정 표면 마커 및 공초점 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 흐름 체 외에서 매매 하는 monocyte 부분 모집단을 측정 하는 통합된 프로토콜 제시. 이 프로토콜은 다른 특정 표면 마커를 사용 하 여 다른 백혈구 하위 프로로 뿐만 아니라 순차 모집 단계를 탐험 하 사용할 수 있습니다.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

이 단계별 프로토콜 실험 설정 및 hiPSC-ECs에 염증 반응의 평가 대 한 데이터 분석 및 생리 적 흐름에서 백혈구 접착의 분석에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

미세 분석 결과 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 내 피 세포 (hiPSC-ECs)에 백혈구 접착의 평가 대 한

배우세요 인간 간 사인 내피에서 전단 응력 조건 하 백혈구 모집 메커니즘을 연구하는 흐름 접착 분석법을. 이 방법은 만성 염증성 간 질환 치료 전략 개발에 활용됩니다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

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