2014년 3월 14일
직접 인체 조직에서 암 줄기 세포 (암줄 기세포)의 분리는 생물학적 특성 분석을위한 필수입니다. 또한 어려운 단계를 문제 해결에 대한 팁을 제공하면서이 원고는, 인간의 조직에서 전립선 암줄 기세포의 분리를위한 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 전립선암 줄기세포를 인체 조직에서 팩스로 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이는 수술 표본에서 채취한 전립선암 조직을 먼저 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 조직 섹션에서 세포 현탁액이 생성되고 세포는 형광 항체로 표지됩니다.
마지막 단계에서는 전립선암 줄기세포를 사실에 따라 분류합니다. 궁극적으로, 분리된 세포의 분자 및 기능적 특성은 이종 이식 및 유전자 발현 프로파일링으로 특성화될 수 있습니다. 이 방법은 인간 샘플에서 암 줄기세포의 분자 및 기능적 특성화를 촉진함으로써 전립선암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 사람은 Samuel Vidal, MD 박사 과정 학생인 Aiden Quinn, 석사 과정 학생인 Aiden Quinn, 그리고 jania입니다. 실험실의 연구 A: 임상 진단에 필요하지 않은 암 샘플에서 여분의 벌크 조직을 15ml의 배지가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브로 채취하는 것으로 시작합니다. 절제 후 24시간 이내에 처리하기 위해 튜브를 즉시 섭씨 4도에서 보관한 다음 멸균 메스와 집게로 생물 안전 캐비닛에서 작업합니다.
암 조직 샘플 내의 거시적 종양 결절에서 2-4mm 두께의 수평 조직 절편을 얻습니다. 이 섹션을 미디어가 들어 있는 새 50ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 일부를 분리하고 10% 포르말린으로 고정하여 조직학적 분석을 통해 전립선암 조직의 존재를 확인하여 종양 조직에서 세포 현탁액을 생성합니다.
다음으로, 2-4mm 조직 절편을 각각 1밀리리터의 멸균 PBS가 들어 있는 60 x 15mm 배양 접시로 옮기고, 멸균 메스와 겸자를 사용하여 샘플을 기계적으로 삼중 처리하고, 생성된 세포 현탁액을 단일 멸균 50ml 원추형 튜브에 모읍니다. 샘플 접시에 PBS를 한 번 더 첨가하고 각 조직 절편이 완전히 분리될 때까지 3-4회 더 반복합니다. 그런 다음 5 밀리리터 피펫을 사용하여 세포 용액을 혼합합니다.
1분 동안 최대 속도로 세포 용액을 와류로 회전시킨 다음 생성된 세포 슬러리를 35마이크로미터 세포 여과기를 통해 두 번째 멸균 50ml 원추형 튜브로 여과합니다. 여과된 세포를 실온에서 450배 G로 10분 동안 스핀다운합니다. 그런 다음 펠릿을 5ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다.
5분 후 셀을 다시 스핀다운합니다. 트라이안 블루 배제에 의한 계산을 위해 5%FBS가 보충된 소량의 PBS에 적혈구가 없는 펠릿을 현탁시키는 Resus. 생존 가능한 세포의 수를 정량화한 후 세포를 10배로 희석하여 현탁액 밀리리터당 6개의 세포로 만들고 얼음에 1시간 이상 보관하지 않습니다.
전립선암을 분리하기 위해 줄기세포는 분류 중에 조혈 세포와 내피 세포를 제외하는 것처럼 5개의 15ml 원뿔형 튜브에 라벨을 붙이는 것으로 시작합니다. 종양 조직 절편에서 생성된 세포 현탁액을 5개의 튜브 사이로 분할한 다음 얼음에서 30분 동안 1-250 희석으로 적절한 항체로 세포를 배양합니다. 다음으로, 세포를 스핀 다운한 다음 10% FBS가 보충된 멸균 PBS에서 펠릿을 세척한 후 DPI의 밀리리터당 10마이크로그램으로 펠릿을 배양하고 35마이크로미터 스트레이너 캡을 통해 최종 용액을 12 x 75mm 폴리스티렌 튜브로 여과합니다.
처음 4개의 튜브를 사용하여 전방 산란 측, 산란 dpi, fite 및 pe에 대한 게이트를 설정합니다. 마지막으로, 튜브 5를 사용하여 HLA Class 1 음성 및 HLA Class 1 양성 집단을 10% FBS가 보충된 2mL의 RPMI가 포함된 개별 멸균 15ml 원추형 튜브로 수집합니다. 그런 다음 분류된 세포 현탁액을 스핀다운하고 펠릿을 200-500마이크로리터의 배지에 재현탁하여 트라이안 블루 배제에 의한 생존 세포의 정량화를 수행합니다.
입증된 프로토콜은 인간 수술 표본에서 HLA 클래스 1 음성 전립선암 줄기세포의 분리를 용이하게 합니다. 이 이미지는 현미경으로 처리한 다음 확인할 수 있는 전체적으로 보이는 거시적 종양 결절을 보여줍니다. 입증된 바와 같이, 생존 가능한 세포는 음성 dapi 염색에 의해 분리되며, HLA Class one 음성 전립선암 줄기세포의 빈도를 결정할 수 있습니다.
HLA Class 1 음성 전립선암 줄기세포의 수는 환자마다 다르지만 일반적으로 이 절차에 따라 전체 생존 인구의 0.5-8%를 차지합니다. 유전자 발현 프로파일링 및 이종 이식과 같은 다른 방법을 사용하여 화학 요법 내성 및 질병 진행에 기여하는 메커니즘을 더 잘 특성화할 수 있습니다.
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이 기사는 인간 조직에서 전립선 암 줄기 세포(CSCs)를 분리하는 방법론을 설명합니다. 이 과정에는 조직 처리, 세포 현탁액 생성 및 형광 항체를 사용한 CSCs 분류가 포함됩니다.
Direct isolation of prostate cancer stem cells (CSCs) from human surgical specimens enables mechanistic de-risking and functional target validation in oncology discovery pipelines. This approach supports predictive confidence in early-stage prostate cancer research by providing access to live CSC populations for downstream molecular and functional characterization. The method addresses a critical inflection point for translational continuity and portfolio triage in solid tumor R&D.
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling direct hypothesis testing and functional validation of CSCs from human prostate tumors.