Name: 합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 배우세요 인간과 쥐 뇌 조직에서 단백질을 추출하여 2D-DIGE 및 미니 2DE 면역 블롯으로 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 단백질 발현 및 번역 후 수정 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 INSERM, 릴 2의 대학에 의해 지원되었다, MEDIALZ, LabEx (우수 실험실, 프로그램은 미래에 대한 투자) 및 DISTALZ (알츠하이머 병에 대한 학문적 접근을위한 혁신적인 전략의 개발). FJ.FG 현재 ANR (프랑스 국립 연구 기관 / NeuroSplice 드 타우 01 인텔리 ANR-2010-BLAN-1114)의받는 사람의 교제이지만,이 작품은 JCCM (스페인)에서 교부금의 지원 아래도했다.

1. 균질화 및 인간과 쥐의 뇌 조직에서 총 단백질 추출 <ol><li> 뇌 조직 균질화. (인간의 샘플) 도공 유리 또는 (쥐 샘플) 테플론 균질화를 사용하여 뇌 조직의 10 % (W / V) 8 M 요소에, 2 M 티오 및 W / V SDS 버퍼 (UTS) 1 % 균질화한다. 60 Hz에서 전체 조직의 분해 (13, 14)에 0.5 초를 적용하는 초음파 발생기 (30) 펄스에서 초음파 처리. <ol><li> 표준으로 BSA를 사용하여, 브래드 포드 분석과 단백질 농도를 결정합니다. 이 버퍼 추출만큼 해물이 의해 carbamylation (15)을 방지하기 위해 가열 오버하지 않기 때문에 하나의 차원 SDS-PAGE와 완전히 호환되는 UTS. </li><li> 1 %를 추가 (W / V) 앰버의 실온에서 10 분 동안 부드러운 혼합으로 품어. 그 후 0.22 μm의 주사기 필터로 필터링하고 마지막 요소 / 티오 우레아 용액에 SDS를 추가합니다. 이 단계는 equilibr에 요산 및 이소시 산의 양을 감소시킨다솔루션의 요소와 IUM 및 분해를 촉진한다. </li></ol></li><li> 클로로포름 / 메탄올 단백질 침전. (독립적으로 IEF를 수행하기 위해 선택한 pH 범위에) 18 센티미터 사람을 위해 11cm IPG 스트립과 1.5 밀리그램 단백질 ㎍의 100 ~ 150 사이를 침전. <ol><li> 얼음 또는 4 ° C에서 모든 단계를 수행 침전 절차를 시작하기 전에 30 분 동안 4 ° C에서 멋진 클로로포름, 메탄올. </li><li> UTS 용 해물의 하나의 볼륨에 메탄올 세 권 클로로포름 하나의 볼륨을 추가합니다. 수동으로 혼합물을 흔들어 냉수 세 볼륨을 추가합니다. 1 분 동안 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 단백질을 펠릿 소용돌이 </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층 액을 버리고 차가운 메탄올의 세 볼륨을 추가합니다. 다시 소용돌이와 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 마지막으로 뜨는을 취소하고 N 2에서 펠렛을 건조. </li></ol></li><li> 2D 분석을위한 단백질의 제조.2D-버퍼 단백질 건조 펠릿 (8 M 우레아, 4 % CHAPS로 보충 2 M 티오 우레아)을 재현 탁. 위에 표시된대로 앰버와 솔루션을 씻고 2D-DIGE 용 2D 버퍼 200 μL 당 단백질 500 μg의 비율을 유지하려고합니다. 참고 : 2D 버퍼가 -80 ° C에 저장하거나 (요소 저하를 방지하기 위해) 일주 동안 4 ° C로 유지 될 수있다. <ol><li> 초음파 처리하고 다음 단계를 수행 할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 단백질의 포름산 가용화 10를 집계 후 주목할,이 프로토콜이 사용될 수있다. 간단히, N 2하에 포름산을 증발 바와 같이 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> 샘플의 품질을 테스트합니다. 다시 도즈 샘플 브래드 퍼드 방법을 사용. LDS 샘플 버퍼, 열 37 ° C (15)에서의 단백질의 15 μg을 희석 4-12 % 년 폴리 아크릴 아마이드 젤에로드합니다. </li><li> 쿠마시 염색. 0.1 %의 폴리 아크릴 아마이드 젤 얼룩 (w / v)의 쿠마블루 G-250, 50 %의 EtOH 및 10 %, 적어도 1 시간 동안 (v / v) 아세트산 용액. 배경이 7 % 아세트산 및 10 % (v / v) 에탄올 수용액에 하룻밤 destain하자. </li><li> 샘플의 사전 전기 영동 표시. 이전 시아닌 염료 라벨을 수행하는, N-하이드 록시 대체 기본 pH에서 더 효율적이고 pH가 8.6에서 최적으로 주어진부터 기본 또는 중립이어야한다 시료의 pH를 확인합니다. <ol><li> 50 μg protein/400 pmol의 염료의 비율과를 Cy3 또는 Cy5의 형광 염료 연구의 최소한 두 개의 샘플을 라벨과 프로톤 아민과 시아닌의 NHS 에스테르 반응 그룹을 용이하게하기 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 1 시간 동안 유지 라이신의 그룹. </li><li> 특히 시아닌 한 시료의 우대 커플 링을 방지를 Cy3와 Cy5에 염료와 크로스 라벨을 만드는 샘플 변형을 줄일 수 있습니다. 시아닌 염료 라벨링 PR 최소한 1 μg의 비율을 유지하면서 단백질 소량 위해 적응 될 수 있음을 유의8 pmol의 시아닌 염료 당 otein. 그렇다면, 미니 2DE 시스템 대신 대형 2D 젤 시스템에 사용될 수있다. 이는 뇌 조직의 소량 2D-DIGE 분석을 가능하게 할 것이다. </li><li> CY2 형광 염료와 동일한 양의 단백질 (총 50 μg)과 함께 두 샘플의 풀을 라벨과 내부 표준 물질로 사용된다. 이전에 나타낸 바와 같은 조건을 사용한다. </li><li> 1.1 %의 Destreak 시약, IPG 버퍼의 1.2 % 및 브로 모 페놀 블루 라벨 단백질의 총 150 μg (CY2 50 μg, CY2 50를 Cy3 ㎍의 50 μg)의 흔적을 포함하는 2D 버퍼와 총 부피 350 μL에 완료. 4 개의 독립적 인 스트립을 사용하여 사통에서이 단계를 수행합니다. 또한, 예비 젤에 대한 단백질의 350 ~ 450 μg과 두 개의 추가 비 표지 스트립 (각 샘플에 대해 하나)을 준비합니다. </li><li> 수동 재수 미네랄 오일 하룻밤 덮여 여섯로드 스트립을 남겨주세요. </li></ol></li><li> Isoelectrofocusing. (20)에서 IEF을 수행6, C. pH가 3-11NL의 경우 18 cm의 프로토콜을 제거합니다 : 최대 전류 설정은 8 단계에서 50 μA / 스트립입니다 : 1) 150 V 1 시간 동안 단계, 2) 200 V 5 시간, 3) 500 V 그라데이션 단계 2 시간, 2 시간 4) 1,000 V의 그라데이션, 5) 2,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 6) 4,000 V 2 시간 동안 그라데이션, 7) 8,000 V 2 시간 8) 24,000 V의 총에 대한 그라데이션 · 시간 단계 . IEF 후, 크로마토 그래피 페이퍼를 사용하여 미네랄 오일의 과잉을 파견 및 제 사이즈까지 -20 ° C에서 스트립을 저장한다. </li><li> IPG는 평형을 제거합니다. 같은 버퍼에 요오도 아세트 아미드 4.7 %로하지만, DTT없이 6 M 요소, 2 % SDS, 30 % 글리세롤, 50 MM 트리스 - 염산 pH를 15 분 동안 DTT의 1 %와 8.6 버퍼와 후 스트립을 평형. </li><li> 두 번째 차원 또는 SDS-PAGE 전기 영동. 6 ~ 12 % SDS-PAGE 젤 (1.5 M 트리스 - 염산의 pH 8.6, 12 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드, 0.1 % (W / V) SDS, 0.072 % (W / V) APS 0.1 % (V / V)을 확인 TEMED ) STRI 네 낮은 형광 유리판으로, 대형 2D 시스템을 사용하여 동시에단백질 반점을 절제하기 위해 예비 젤에 대한 두께 1.5 mm의 형광 샘플 및 두 개의 다른 유리 접시와 PS. <ol><li> (w / v) 아가로 오스의 0.5 %와 젤의 상단에 레이어드를 통해 여섯 IPG 스트립을로드합니다. 실행 버퍼는 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % (W / V) SDS로 구성되어있다. 4 ° C 16, 17로 설정 냉동 시스템 야간에 2.5 W / 젤에서 마이그레이션을 수행하십시오. </li></ol></li><li> 형광 이미지 획득 및 분석. 형광 젤 이미지 (하나의 실험에 대한 12 이미지)를 얻기 위해 태풍 9400 스캐너를 사용합니다. 스캔 CY2, 520분의 488 nm의 580분의 532 nm의 670분의 630 nm의 여기 / 방출 파장, 각각 각 젤를 Cy3와 Cy5에 이미지. 이미지를 분석하는 INFORMATIC 소프트웨어를 사용합니다. 데이터 공부 두 샘플 간의 네 겔 걸쳐 신호의 분포와 연관된 스폿 볼륨의 변동을 반영한다. </li><li> 큰 젤에 대한 쿠마시 염색. 5에 예비 젤 수정0 % (V / V)을 EtOH 3 %에서 최소 24 시간 동안 (V / V) 오르토 인산 솔루션을 제공합니다. 그런 후, 20 분 동안 매우 순수한 물로 2 회 세척한다. 34 %에 착색을 수행합니다 (v / v)의 메탄올, 17 % (W / V) 암모늄 황산 (w / v)의 쿠마시 블루 G-250 0.1 %를 추가하기 전에 1 시간 동안 2 % 오르토 인산. 최소 48 시간 초순수에 탈색을위한 색채 젤을 유지합니다. <ol><li> MS의 식별을위한 관광 명소입니다. 형광 이미지를 분석하면, 소프트웨어는 식 통계적 다른 스폿의리스트를 제공한다. 수동으로 예비 젤에서 이러한 장소를 절제. 이 절차는 각질 오염을 피하기 위해 약간의 연습과 손재주를 필요로한다. 다음 샘플은 MS로 전송 될 때까지 -20 ° C에서 물에 보관하실 수 있습니다. 스팟 식별 탠덤 질량 분석 (MS / MS)와 단백질 정체성의 관련성과 완벽하게 호환되는이 확률 0.05 (P &lt;0.05) (18)의 P-값을 계산 기반 Mowse 점수에 따라 판단된다. </li> &lt;/ OL&gt; </li></ol> 3. 질적 미니 2DE 분석 실험 <ol><li> 2D 버퍼의 단백질 시료의 최대 100 μg을 재​​현 탁 11cm의 IPG 스트립 200 μL의 최종 볼륨까지. 과발현 시스템 또는 정제 된 단백질의 경우, 시작 양은 20 μg으로 낮출 수있다. </li><li> 200 μL의 최종 볼륨 (V / V) Destreak 시약, 0.55 % (V / V) IPG 버퍼와 브로 모 페놀 블루의 흔적을 1.1 %를 추가합니다. 그런 다음, 소용돌이, 빠른 스핀을 밤새 미네랄 오일이 덮여 (원래의 두께로 지구를 가져) 수동 수분 보충을 위해 IPG 스트립에로드합니다. 참고 : IPG 버퍼의 비율이 원하는 산도 (pH를 3-11, 4-7, 7-11, 등)의 모든 구간에 대해 동일하지만, 그 조성물 선택된 pH 범위의 함수로 변화한다. </li><li> Isoelectrofocalisation. 20 ° C에서 IEF를 수행 프로그램의 지속 기간은 선택된 산도 간격에 의존한다. 주목할만한, 그런 electroendosmosis는 IEF 프로필을 방해 할 수와 같은 이러한 경우에 매개 변수,electrofocalisation 시간 최적화는 19이 필요합니다. 주 : 반드시 더 나은 결과를 제공하지만, IEF의 시간을 단축하는 것도 해상도를 향상시킬 수있다 이상 IEF 아니다. IEF 후, I​​PG 스트립 개월 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> IPG는 평형을 제거합니다. 25 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 20 mM의 DTT, 10 % 글리세롤, 5 % SDS, 0.05 % 브로 모 페놀 블루를 함유하는 완충액에 스트립을 평형화. 세 가지 평형이 각 화장실 사이의 완충 용액을 변화와 함께 15 분 동안 목욕합니다. </li><li> SDS-PAGE. 관심의 단백질의 분자량에 따라 선택 폴리 아크릴 아미드의 비율로 프리 캐스트 젤 (IPG +1 아니라, 11cm의 IPG 스트립)에 IPG 스트립 레이어. 그 후, 33 분 동안 100 MV에 니트로 셀룰로오스 / PVDF 멤브레인 상에 겔을 가릴. </li><li> 필요한 항체를 밤새 품어 과산화 효소 활성에 의해 시각화. 이차 항체에 의해 밝혀 관련이없는 폴리 펩타이드를 사용하여 면역 블롯의 정렬을 수행합니다. 반으로 Quantit 도달ImageJ에 소프트웨어를 추적 / 반점의 볼륨과 강도의 농도계에 의해 분석는 ative. </li></ol>

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</ol>

저자는 선언하는 어떠한 이해 관계가 없습니다.

단백질의 병리학 적 발현 변화를 발견, 생체에 대한 검색 및 약물 표적에 대한 잠재적 인 경로의 변조 neuroproteomics의 목적 중입니다 (30)에 접근한다. 새로운 도구 가운데, 2DE 필드는 유망한 expectative을 추가합니다. 그럼에도 불구하고, 합의 변동을 최소화하고 실험의 재현성을 높이기 위해 도달되어야한다. 이 아이디어의 라인에서 2D-DIGE (그림 2)와 모노 차원 면역 블롯과 완벽하게 호환 인간과 생쥐의 뇌 조직에 대한 후속 2DE의 면역 블롯 (그림 3)을 수행하는 표준화 된 프로토콜은 여기에 대한 상세한 설명되어 있습니다. 단백질 체학에서 가장 큰 딜레마 중 하나는 가용화 버퍼 선택입니다. 그것이 IEF 완전히 호환 때문에 다른 접근법들 사이의 재현성을 높이기 위해, UTS가 선택되었다. 또한, UTS 추출 완충액은 PELLE를 산출하지t 또는 12,000 XG에...

정신 및 신경 장애는 질병의 글로벌 부담의 13 %를 나타냅니다, 병태 생리 학적 메커니즘, 위험 요소 및 구성 (prodromal) 바이오 마커와 같은 새로운 도전 1 탐구해야합니다. 이 목적에 부합하는, 인간의 뇌의 단백질 체학 연구는 생리에 대한뿐만 아니라 병적 인 조건뿐만 아니라 메모리, 행동, 감정과 예를 들어 신경 세포의 가소성, 같은 프로세스에 관련된 분자 경로를 발견하기 위해 필수가됩니다. 따라서, 동물 모델의 사용 및보다 구체적으로 형질 전환 마우스는 인간의 신경 퇴행성 질환의 병인이 모방하는 광범위한 가능성을 가져온다. 프로테오믹스 방법은 신경 과학 분야에서 이러한 새로운 관점을 달성하기 위해 요즘 사용할 수 있습니다. 이차원 전기 영동 (2DE)는 시료의 넓은 범위의 프로테옴을 비교할 수 유력한 것으로 간단한 방법이다. 또한,도식별하기 위해 복잡한 혼합물로부터 단백질을 분리하고 추가로 질량 분석법에 의해 분석하기위한 강력한 방법. (IEF)을 isoelectrofocusing하여 자신의 등전점 (PI)에 따라 1) 단백질의 분리 :이 기술은 기본적으로 두 개의 연속적인 단계로 구성되어 있습니다. 보다 정확하게는, 전위의 pH 구배 구비 immobiline 아크릴 아미드 스트립을 가로 질러인가 된 후 단백질은 이주 및 글로벌 넷 충전 기능 판정의 pI에 초점을 맞출 것이다. 2) Isoelectrically 집중된 단백질은 첫 구조하여 단백질이 SDS-PAGE (3)에 의해 그들의 겉보기 분자량 (MW)에 따라 구분되며) 변성하고 부정적인 도데 실 황산나트륨 (SDS의 첨가에 의해 부과. 이 두 가지 속성은 우리가 프로테옴의 연구에 더 갈 수있는 두 값을 해결 할 수 있습니다. 한편이 방법은 최소한의 염료 2D-DIGE 방법을 사용하여 정량 분석​​을 수행 할 수있는 가능성을 제공하고, 반면에 qualitativ미니 2DE에 의해 전자의 분석은 웨스턴 블로 팅에 결합. 2D-DIGE에 의한 정량 분석​​ 단백질 발현은 모든 샘플의 프로테옴에 변경 수여한다. 간단히 샘플은 세 개의 서로 다른 파장 (블루, 그린, 레드)에 발광 세 시아닌 (CY2,를 Cy3와 Cy5에)로 표시되어 있습니다. N-히드 록시 숙신 이미 딜 에스테르기를 함유 한 불소 최소한 염료는 공유 결합, 아미드 결합 소재 얻어진 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노 그룹과 반응한다. 리신 잔류 물은 1 ~ 3 % 사이 따라서 단백질에 여러 라벨 또한 주요 그물 충전 수정 5, 6을 방지 표시되어 있습니다. 를 Cy3와 Cy5에 자주 CY2 비교할 샘플의 동일한 비율의 혼합에 태그를하는 동안 두 개의 독립적 인 샘플을 레이블로 사용됩니다. 두 가지 주요 이점은 모든 표지 샘플 혼합하고 IEF 및 SDS-PAGE 젤이 비교에 의한 실험들 간 변동을 피하기 위해, 각 단계에 대해 한 번에 한 겔에서 실시되어있다. 또한, 단백질 7의 약 1 femtomole의 높은 탐지 임계 값을 제공한다. 젤 스캔 및 2D 소프트웨어는 CY2는 질량 분석에 의해 그들의 후방 식별을위한 관광 명소 중 통계적 차이의 식별을 허용하는 내부 표준으로 제공하는 2D 겔의 형광 이미지를 비교하고 있습니다. 내부 표준을 사용하여 2 차원 분석 소프트웨어 통계적 신뢰도 8의 95 % 이상과 샘플 사이의 차이의 10 % 미만의 빠른 검출을 달성한다. 미니 2DE 질적 분석은 단백질 특성 분석을위한 중요한 단계입니다. 원리는 이전 pi에서 MW 분리 설명한 것과 동일하지만,이 경우에는 단백질이 막에 작은 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 전송 및 면역 블 롯팅은 나중에 수행된다. 하나의 차원 겔 전기 영동은 하나의 항체 기능, 정보 출력 여러 단백질 에피토프에 대한 단백질 발현의 변화를 제공하는 반면미니 2DE에서 북쪽으로 두 개의 추가 매개 변수를 부여한다. 첫째, 단백질 isovariants은 번역 후 변형이 일어날 수 있음을 나타내는 파이의 기능에 변경합니다. 둘째, 질량 분석 식별 그럴듯 zymogens과 단백질의 이화 작용 제품을 나타낼 수있다. 따라서, 2D-DIGE 관찰 수정이 글로벌 프로테옴 프로파일의 변화를 기본 메커니즘을 나타내는 것 같다. 미니 2DE하여 동일한 단백질 에피토프 / S에 대한 몇 가지 샘플들 사이 면역 블롯의 선형은 산도가 약간 관찰 번역 후 변형에 빛을 흘리는 변경 또는하지 monodimensional 면역 블롯 (9, 10)에 의해 반영 될 수 있습니다. 또한,이 분석은 대사 잔기 11,12의 파이 및 MW의 기술에 의한 전위 절단 부위에 대해 알려준다. 이들 두 기술의 조합은 상보 단백질 체학 분석을 제공한다. 한편 2D-DIGE은 일반 가르치시표정이 다른 폴리 펩타이드의 정확한 분리를 허용 차이의 전자. 이러한 차이는 지점 또는 형광 젤의 소프트웨어 분석에 의해 주어진 하나의 강도의 증가 / 감소의 비 표시로 기본적으로 구성되어 있습니다. 그러나, 그 자체로 이러한 관찰은 관찰 변형 예의 본질을 설명 할 확률이다. 의 isovariant / 이소 형 수준의 변화 : 폴리펩티드를 단리하고 질량 분석에 의해 식별되면 이러한 이유로, 미니 2DE의 사용)는 정확하게 하나를 확인하기 위하여 절연 단백질의 정체성과 차이의 2) 자연있게 예를 들어 표현, 번역 후 변형 및 절단 과정. 그러나, 매우 비슷하다 추출 프로토콜의 사용으로 인해 잠재적 분산액을 제한하기 위해 2D-DIGE 가진 미니 2DE 호환 모두 시작 용해 완충액을 개발하는 것이 필요하다. 본 문서에서는, 우리는 드2D-DIGE 인간 및 마우스 조직에서 오는 뇌 단백질 미니 2DE 기술의 준비, 추출 및 성능에 대한 적응 프로토콜을 스 크라이 빙.

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Reference pH 간격/크기</td></tr><tr><td>IPG 버퍼 기능, pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Reference 원하는 pH 간격</td></tr><tr><td>기능 AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>드라이스트립 커버 유체 IMMOBILINE 1 * 1 l</td><td>GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>수동 재수화를 위한 플라스틱 상자&nbsp;</td></tr><tr><td>MILLEX GS 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Reference in the MW의 기능에서</td></tr><tr><td>IPGphor III 등전 초점 장치</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix 대형 전기영동 시스템</td><td>GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&nbsp;</td><td>젤 컴퍼니</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

합의 뇌 유래 단백질, 2d-dige 미니 2de 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

이차원 전기 영동 (2DE)는 잠재적으로 다른 생리적 또는 병리 적 조건과 관련 프로테옴 수정 사항을 발견 할 수있는 강력한 도구입니다. 기본적으로,이 기술은 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 제 1 단계에서 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리하고, 둘째 그 분자량에 따른에 기초한다. 이 보고서에서 인간의 사후와 마우스 뇌 조직의 작은 금액에 대한 최적화 된 샘플 준비 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 두 개의 차원 형광 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE) 미니 2DE의 면역 블롯을 수행 할 수 있습니다. 이러한 접근 방식의 조합은 하나의 질량 분석 검출과의 호환성 발현 덕분에 새로운 단백질 및 / 또는 단백질의 변형을 찾을뿐만 아니라 수 있지만, 또한 마커 검증에 새로운 통찰력. 따라서, 미니 2DE은 포스트를 확인하고 검증하기 위해 서부 블로 팅 허가에 결합번역 후 수정, 단백질 이화 작용과 다른 조건 및 / 또는 치료 사이에 질적 인 비교를 제공합니다. 여기서, 우리는 아밀로이드 - 베타 펩티드와 알파 synuclein으로 AD와의 Lewy 몸 치매에있는 단백질 집합체의 구성 요소를 공부하는 방법을 제공한다. 우리의 방법은 이와 같이 프로테옴의 분석을 위해 적응 될 수 불용성 단백질은 인간의 뇌 조직 및 마우스 모델에서 추출한다. 병렬에서는 퇴행성 신경 질환뿐만 아니라 잠재적 인 새로운 바이오 마커 및 치료 표적에 관련된 분자 및 세포 경로의 연구를위한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다.

제공된 이상적인 버퍼 단백질의 100 %, 특히 막 - 연관 또는 세포 골격 단백질을 복구하기 위해 존재하지 않기 때문에 뇌 조직에 프로테오믹스 도전 남아있다. 실험의 첫 번째 세트는 단백질의 대형 패널을 복구 할 수 있도록 두 개의 접근법과 호환 적합한 용해 버퍼의 검색에 집중 하였다. 따라서, 세 용해 버퍼는 가장 적절한 하나를 결정하기 위해 분석 하였다. 첫째, 그것은 1 %와 10 밀리미터 (W / V) SDS (그림 1A)에서 공통의 생화학 및 분자 생물학 버퍼 트리스 - 염산 (20)를 사용 하였다. 또한, 트리스 - 염산은 폴리 아크릴 아미드 및 아가 로스 젤에 대한 전기 영동 버퍼와 같은 강력한 응용 프로그램이 있습니다. 다른 두 용해 버퍼는 UTS (그림 1B)와 2DE 하나 있었다. 트리스 SDS는 가난한 해상도를 얻을 수 및 지점의 수는 상당히 높은 자리 분리, 아니 distorsion과 FA UTS, 관찰 프로파일과의 비교 <...

인간과 쥐의 뇌 조직을위한 요소 / 티오 / SDS 버퍼를 사용하는 일반적인 단백질 추출 프로토콜은 허용 2D-DIGE 미니 2DE의 면역 블롯에 의해 그들의 연속 특성에 의한 단백질의 indentification. 이 방법은 인간의 조직 검사 및 실험 모델에서 더 많은 재현성 및 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 하나를 할 수 있습니다.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 분석을 위해 인간 및 마우스 뇌 조직에서 단백질을 추출하는 것입니다. 이는 2차원 전기영동 방식에 적합하도록 공통 용해 버퍼를 사용하여 동일한 단백질 추출물을 얻음으로써 달성됩니다. 그 다음, 질량 분석법 식별을 위해 단백질을 분리하는 2차원 형광 차이 젤 전기영동법이 사용됩니다.이어지는 단계로, 번역 후 변형을 확인하기 위해 면역 블로팅을 동반한 소형 2D 겔 전기영동을 수행합니다. 결과는 전반적인 단백질 발현을 나타낼 수 있습니다. 숙주 번역 변화는 등전점과 분자량의 차이에 따라 모든 인대화 및 촉매 생성물을 보여줍니다.2D dash와 2D monolo의 조합은 발현 변화에 대한 정보를 동시에 제공함으로써 신경 단백질체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 생성물의 번역 후 수정 및 이화 작용은 뇌 조직의 수집 및 균질화부터 시작합니다. 인간 뇌 조직의 경우 추출 버퍼 내에서 10% w/v 농도로 조직을 준비하십시오.유리 피펫터를 사용하여 조직을 균질화하되, 설치류 조직의 경우 테플론 균질화기를 사용하여 균질물을 분해하십시오. 60 hertz에서 0.5초 간격의 펄스를 30회 가하여 초음파 처리합니다. 그다음, BSA를 표준 물질로 사용하는 Bradford assay를 통해 단백질 농도를 결정하십시오.이제 클로로포름 메탄올 침전법에 필요한 용액들을 얼음 버킷에 준비합니다. 11 cm IPG 스트립의 경우 약 125 µg, 18 cm IPG 스트립의 경우 약 1.25 mg을 수집할 계획을 세웁니다. 용액의 온도가 4 °C가 되면, 모든 침전 과정을 얼음 위에서 수행합니다.먼저 메탄올 3부피를 넣고, 이어서 클로로포름 1부피를 추가합니다. 이 혼합물을 흔들어 섞어줍니다. 다음으로, 차가운 증류수 3부피를 추가합니다.이 혼합물을 1분 동안 Vortex한 후, 샘플 튜브를 4°C에서 12,000 Gs로 30분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 흡입하여 제거하십시오. 그런 다음 메탄올 3부피를 첨가하고, 동일한 방식으로 Vortex 및 스핀 다운하여 단백질을 침전시키십시오.2D DIGE를 수행하기 전, 수집된 단백질 펠렛을 질소 가스로 건조하십시오. 단백질을 2.5 mg/mL 농도의 2D 버퍼에 재현탁하십시오. 그 후, 사용 전까지 이전과 동일한 방식으로 샘플을 초음파 처리하십시오.이 단계를 시작하기 전과 단백질 침전 후에 -80 °C에서 보관하십시오. Bradford Assay를 통해 단백질 농도를 다시 한 번 결정해야 합니다. 이는 앞서 설명한 psy dye 표지 전의 절차와 동일하게 진행합니다.단백질 샘플의 품질은 SDS page를 통해 확인합니다. 15 µg의 단백질을 LDS로 희석한 후, 항온수조 또는 히팅 블록에서 37 °C로 가열합니다. 그 다음, 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 수행하고, 쿰اسی 블루 용액으로 겔을 최소 1시간 동안 염색합니다.그 후 7% acetic acid와 10% ethanol 혼합 용액에서 겔을 하룻밤 동안 보관합니다. 단백질 시료의 품질이 확인되면, 다음 날 SD 표지 절차를 시작합니다. 먼저 용해물의 pH를 측정하며, 이는 염기성에서 중성 사이여야 합니다.후속 반응을 위한 최적 pH는 8.6입니다. 다음으로, 각 단백질 샘플에 대한 염료 접합 반응을 준비합니다. 50 micrograms의 단백질을 400 picomoles의 S3 염료와 혼합하고, 또 다른 50 micrograms의 단백질을 400 picomoles의 S five 염료와 혼합합니다.샘플당 총 8회의 D 커플링 반응이 되도록 이를 4중(quadruplex)으로 수행하십시오. 테스트하는 각 샘플에 대해, 질환이 있는 뇌와 같은 대조군 유래 단백질을 사용하여 상보적인 DI 커플링 반응 세트를 만드십시오. 그런 다음 모든 반응 쌍에 대해, 400 picomoles의 CY two와 총 250 micrograms의 모든 단백질이 균등하게 포함된 내부 대조군 반응을 설정하십시오.SAI 라벨링은 모든 반응 혼합물을 4°C 암소에서 1시간 동안 배양하여 수행합니다. 배양 후, 세 가지 서로 다른 시안 반응 세트를 모두 합쳐 각 반응 세트에 200µL의 2D 버퍼를 가해 최종 부피를 150µL로 맞춥니다. 그런 다음 2D 전기영동 단계를 진행합니다.각 샘플과 양성 대조군에 대해 단백질 스팟을 절취할 분취용 겔을 위한 비표지 단백질 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 300에서 350 µg의 비표지 단백질을 2D 버퍼에 분주하고 IPG 스트립과 접촉시켜 재수화시킵니다. 다음으로 IPG 스트립을 로딩하여 표지 및 비표지 단백질을 재수화 상태로 옮깁니다.그 다음 각 웰을 IPG 반응 스트립으로 덮습니다. 이어서 미네랄 오일을 덮어주고, 25 °C 이하의 온도에서 단백질 용액을 통해 스트립이 밤새 수동적으로 재수화되도록 합니다. 다음 날, IPG 스트립의 등전점 전기영동을 수행합니다.그런 다음 오일을 제거하고 IPG 스트립을 -20 °C에서 보관하여 평형화합니다. 이를 평형화 버퍼에 15분 동안 담급니다. 그 후 DTT가 없는 평형화 버퍼 내의 4.7% IDO 아세트아마이드로 스트립을 옮겨 담급니다.대형 2D 젤 시스템을 사용하여 라벨링된 단백질용 저형광 유리 플레이트에 샘플당 4개의 12% SDS-PAGE 젤을 제작하십시오. 또한 라벨링되지 않은 단백질 각각에 대해 1.5 mm 두께의 표준 유리 플레이트에 12% SDS-PAGE 젤 1개를 제작하십시오. 이들은 분리용 젤입니다.겔이 식으면 스트립을 겔 상단으로 옮기고 0.5% Aros를 덮어줍니다. 냉각 후, 4°C에서 2.5W로 하룻밤 동안 겔을 전기영동하고 다음 날 분석합니다. 많은 2D 반응은 분취용 겔에 사용된 단백질 샘플로 수행할 수 있습니다. 200 µL의 2D 버퍼에 100 µg 미만의 샘플을 정량하여 넣습니다.그 다음 시료 혼합물을 세게 볼텍싱하고 짧게 원심 분리합니다. 11 centimeter IPG 스트립에 시료를 로딩하고, 미네랄 오일로 덮어 다음 날까지 하룻밤 동안 수동적으로 재수화시킵니다. 등전점 전기영동을 수행합니다.그 다음 스트립을 평형화 완충액이 담긴 세 개의 수조에 각각 15분씩 옮겨가며 처리합니다. 이후 스트립을 2D SDS page 젤에서 전기영동합니다. 각 스트립을 적절한 분자량의 프리캐스트 젤 위에 층을 이루어 올립니다.대상 단백질을 위한 폴리아크릴아미드 겔을 준비합니다. 이후, 겔을 NITROCELLULOSE PVDF 막으로 전사하고 본 프로토콜의 전개 과정에 따라 항체로 분석합니다. 세 가지 서로 다른 용해 방법을 사용합니다.완충액을 테스트하였습니다. 우선, 일반적인 생화학 및 분자생물학 완충액인 Tris SDS를 테스트하였습니다.Tris SDS는 다른 테스트 버퍼인 UTS에 비해 분해능이 낮았습니다. 세 번째 버퍼는 테스트 가능한 시료를 준비할 수 없었으므로 제외되었습니다. 다음으로, 인간 및 마우스 뇌 프로테옴을 조사하였습니다.인간 대조군 피질 샘플과 AD 피질 샘플을 비교하였습니다. 또한 AD 유사 tau 병증이 있는 마우스의 뇌 단백질을 인간 샘플과 함께 살펴보았습니다. 각 D에 대해 SCI two, S SI three 및 sci five를 독립적으로 분석하였습니다. 높은 스팟 분해능 덕분에 정렬이 용이했습니다.정성적 mini 2D 분석을 통해 번역 후 수정을 조사하였으며, 지방 조직 내의 리가먼트화된 alpha synuclein은 정상적인 프로파일을 보였으나 별표로 표시된 이량체 형태로도 발견되었습니다. 화살표는 alpha synuclein이 발견된 위치를 나타냅니다. 유비퀴틴화된 amyloid precursor protein 또한 mini 2D를 통해 관찰되었습니다.산발성 알츠하이머병(ad)을 가족성 알츠하이머병(ad)과 비교하였습니다. 가족성 알츠하이머병(ad)의 경우, 8 kDa에서 리가(liga) 형태가 발견되었기 때문에 beta amyloid one to 42와 ISO variance의 농도가 더 낮게 나타납니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단백질 발현 변형을 측정하여 복잡한 시료를 비교하기 위한 프로테옴 연구 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

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