합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 분석을 위해 인간 및 마우스 뇌 조직에서 단백질을 추출하는 것입니다. 이는 2차원 전기영동 방식에 적합하도록 공통 용해 버퍼를 사용하여 동일한 단백질 추출물을 얻음으로써 달성됩니다. 그 다음, 질량 분석법 식별을 위해 단백질을 분리하는 2차원 형광 차이 젤 전기영동법이 사용됩니다.

이어지는 단계로, 번역 후 변형을 확인하기 위해 면역 블로팅을 동반한 소형 2D 겔 전기영동을 수행합니다. 결과는 전반적인 단백질 발현을 나타낼 수 있습니다. 숙주 번역 변화는 등전점과 분자량의 차이에 따라 모든 인대화 및 촉매 생성물을 보여줍니다.

2D dash와 2D monolo의 조합은 발현 변화에 대한 정보를 동시에 제공함으로써 신경 단백질체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 생성물의 번역 후 수정 및 이화 작용은 뇌 조직의 수집 및 균질화부터 시작합니다. 인간 뇌 조직의 경우 추출 버퍼 내에서 10% w/v 농도로 조직을 준비하십시오.

유리 피펫터를 사용하여 조직을 균질화하되, 설치류 조직의 경우 테플론 균질화기를 사용하여 균질물을 분해하십시오. 60 hertz에서 0.5초 간격의 펄스를 30회 가하여 초음파 처리합니다. 그다음, BSA를 표준 물질로 사용하는 Bradford assay를 통해 단백질 농도를 결정하십시오.

이제 클로로포름 메탄올 침전법에 필요한 용액들을 얼음 버킷에 준비합니다. 11 cm IPG 스트립의 경우 약 125 µg, 18 cm IPG 스트립의 경우 약 1.25 mg을 수집할 계획을 세웁니다. 용액의 온도가 4 °C가 되면, 모든 침전 과정을 얼음 위에서 수행합니다.

먼저 메탄올 3부피를 넣고, 이어서 클로로포름 1부피를 추가합니다. 이 혼합물을 흔들어 섞어줍니다. 다음으로, 차가운 증류수 3부피를 추가합니다.

이 혼합물을 1분 동안 Vortex한 후, 샘플 튜브를 4°C에서 12,000 Gs로 30분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 흡입하여 제거하십시오. 그런 다음 메탄올 3부피를 첨가하고, 동일한 방식으로 Vortex 및 스핀 다운하여 단백질을 침전시키십시오.

2D DIGE를 수행하기 전, 수집된 단백질 펠렛을 질소 가스로 건조하십시오. 단백질을 2.5 mg/mL 농도의 2D 버퍼에 재현탁하십시오. 그 후, 사용 전까지 이전과 동일한 방식으로 샘플을 초음파 처리하십시오.

이 단계를 시작하기 전과 단백질 침전 후에 -80 °C에서 보관하십시오. Bradford Assay를 통해 단백질 농도를 다시 한 번 결정해야 합니다. 이는 앞서 설명한 psy dye 표지 전의 절차와 동일하게 진행합니다.

단백질 샘플의 품질은 SDS page를 통해 확인합니다. 15 µg의 단백질을 LDS로 희석한 후, 항온수조 또는 히팅 블록에서 37 °C로 가열합니다. 그 다음, 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 수행하고, 쿰اسی 블루 용액으로 겔을 최소 1시간 동안 염색합니다.

그 후 7% acetic acid와 10% ethanol 혼합 용액에서 겔을 하룻밤 동안 보관합니다. 단백질 시료의 품질이 확인되면, 다음 날 SD 표지 절차를 시작합니다. 먼저 용해물의 pH를 측정하며, 이는 염기성에서 중성 사이여야 합니다.

후속 반응을 위한 최적 pH는 8.6입니다. 다음으로, 각 단백질 샘플에 대한 염료 접합 반응을 준비합니다. 50 micrograms의 단백질을 400 picomoles의 S3 염료와 혼합하고, 또 다른 50 micrograms의 단백질을 400 picomoles의 S five 염료와 혼합합니다.

샘플당 총 8회의 D 커플링 반응이 되도록 이를 4중(quadruplex)으로 수행하십시오. 테스트하는 각 샘플에 대해, 질환이 있는 뇌와 같은 대조군 유래 단백질을 사용하여 상보적인 DI 커플링 반응 세트를 만드십시오. 그런 다음 모든 반응 쌍에 대해, 400 picomoles의 CY two와 총 250 micrograms의 모든 단백질이 균등하게 포함된 내부 대조군 반응을 설정하십시오.

SAI 라벨링은 모든 반응 혼합물을 4°C 암소에서 1시간 동안 배양하여 수행합니다. 배양 후, 세 가지 서로 다른 시안 반응 세트를 모두 합쳐 각 반응 세트에 200µL의 2D 버퍼를 가해 최종 부피를 150µL로 맞춥니다. 그런 다음 2D 전기영동 단계를 진행합니다.

각 샘플과 양성 대조군에 대해 단백질 스팟을 절취할 분취용 겔을 위한 비표지 단백질 용액을 준비하는 것으로 시작합니다. 300에서 350 µg의 비표지 단백질을 2D 버퍼에 분주하고 IPG 스트립과 접촉시켜 재수화시킵니다. 다음으로 IPG 스트립을 로딩하여 표지 및 비표지 단백질을 재수화 상태로 옮깁니다.

그 다음 각 웰을 IPG 반응 스트립으로 덮습니다. 이어서 미네랄 오일을 덮어주고, 25 °C 이하의 온도에서 단백질 용액을 통해 스트립이 밤새 수동적으로 재수화되도록 합니다. 다음 날, IPG 스트립의 등전점 전기영동을 수행합니다.

그런 다음 오일을 제거하고 IPG 스트립을 -20 °C에서 보관하여 평형화합니다. 이를 평형화 버퍼에 15분 동안 담급니다. 그 후 DTT가 없는 평형화 버퍼 내의 4.7% IDO 아세트아마이드로 스트립을 옮겨 담급니다.

대형 2D 젤 시스템을 사용하여 라벨링된 단백질용 저형광 유리 플레이트에 샘플당 4개의 12% SDS-PAGE 젤을 제작하십시오. 또한 라벨링되지 않은 단백질 각각에 대해 1.5 mm 두께의 표준 유리 플레이트에 12% SDS-PAGE 젤 1개를 제작하십시오. 이들은 분리용 젤입니다.

겔이 식으면 스트립을 겔 상단으로 옮기고 0.5% Aros를 덮어줍니다. 냉각 후, 4°C에서 2.5W로 하룻밤 동안 겔을 전기영동하고 다음 날 분석합니다. 많은 2D 반응은 분취용 겔에 사용된 단백질 샘플로 수행할 수 있습니다. 200 µL의 2D 버퍼에 100 µg 미만의 샘플을 정량하여 넣습니다.

그 다음 시료 혼합물을 세게 볼텍싱하고 짧게 원심 분리합니다. 11 centimeter IPG 스트립에 시료를 로딩하고, 미네랄 오일로 덮어 다음 날까지 하룻밤 동안 수동적으로 재수화시킵니다. 등전점 전기영동을 수행합니다.

그 다음 스트립을 평형화 완충액이 담긴 세 개의 수조에 각각 15분씩 옮겨가며 처리합니다. 이후 스트립을 2D SDS page 젤에서 전기영동합니다. 각 스트립을 적절한 분자량의 프리캐스트 젤 위에 층을 이루어 올립니다.

대상 단백질을 위한 폴리아크릴아미드 겔을 준비합니다. 이후, 겔을 NITROCELLULOSE PVDF 막으로 전사하고 본 프로토콜의 전개 과정에 따라 항체로 분석합니다. 세 가지 서로 다른 용해 방법을 사용합니다.

완충액을 테스트하였습니다. 우선, 일반적인 생화학 및 분자생물학 완충액인 Tris SDS를 테스트하였습니다.

Tris SDS는 다른 테스트 버퍼인 UTS에 비해 분해능이 낮았습니다. 세 번째 버퍼는 테스트 가능한 시료를 준비할 수 없었으므로 제외되었습니다. 다음으로, 인간 및 마우스 뇌 프로테옴을 조사하였습니다.

인간 대조군 피질 샘플과 AD 피질 샘플을 비교하였습니다. 또한 AD 유사 tau 병증이 있는 마우스의 뇌 단백질을 인간 샘플과 함께 살펴보았습니다. 각 D에 대해 SCI two, S SI three 및 sci five를 독립적으로 분석하였습니다. 높은 스팟 분해능 덕분에 정렬이 용이했습니다.

정성적 mini 2D 분석을 통해 번역 후 수정을 조사하였으며, 지방 조직 내의 리가먼트화된 alpha synuclein은 정상적인 프로파일을 보였으나 별표로 표시된 이량체 형태로도 발견되었습니다. 화살표는 alpha synuclein이 발견된 위치를 나타냅니다. 유비퀴틴화된 amyloid precursor protein 또한 mini 2D를 통해 관찰되었습니다.

산발성 알츠하이머병(ad)을 가족성 알츠하이머병(ad)과 비교하였습니다. 가족성 알츠하이머병(ad)의 경우, 8 kDa에서 리가(liga) 형태가 발견되었기 때문에 beta amyloid one to 42와 ISO variance의 농도가 더 낮게 나타납니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단백질 발현 변형을 측정하여 복잡한 시료를 비교하기 위한 프로테옴 연구 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.